1、最新版济南大学毕业设计论文外文资料翻译参考格式理工科类53576778生物化学期刊VOL. 281, NO. 17, pp. 1175511760.存在于透明质酸合酶家族中的两种膜内极性残基的突变能改变透明质酸产物的大小卡玛里库玛丽,布鲁斯把根斯透斯 ,安德里亚诺夫艾克,保罗格尔1来自于生物化学和分子生物学领域及关于医学的糖生物学俄克拉荷马州中心和俄克拉荷州健康科学中心大学摘 要 我们识别了两种在链球菌不同细胞膜结构域的透明质酸存在两种保守的极性氨基酸，如存在于膜结构域2的赖氨酸和存在于膜结构域4的谷氨酸。在真核生物的透明质酸合酶中，谷氨酸的位置一般非常相似，并且赖氨酸由保守的极性谷氨酰胺所代
2、替。为了评估是否赖氨酸和谷氨酸作用于或影响于链球菌透明质酸合酶的活性，我们调查了把赖氨酸替换成精氨酸或者谷氨酸，还有谷氨酸替换成赖氨酸、精氨酸或谷氨酸的影响。包含赖氨酸和谷氨酸被替换的双开关的变异体在大肠杆菌细胞膜内得到表达和分布。尽管SeHAS（E327Q）和seHAS(E327K)低水平表达，然而seHAS（E327D）和Lys48表达比较好。这些特定的酶活性（相对于野生型）对于K48R和K48E突变体分别为17%和7%,并且对于E327Q和E327D突变体分别为26%和38%。相反，seHAS（E327K）只表现出野生型酶活性的0.16%，但是当把Lys转变成Glu之后，seHAs（E3
3、27K）的酶活性能够提高46倍。根据色谱层析分离方法加上多角度激光散射，所有的 突变体合成了平均摩尔质量比野生型（3.6MDa）小的透明质酸，最小的HA（0.6MDa）来自于seHAS（E327K，K48E）和seHAS（K48E）。这个结果表明了存在于MD4的Glu对于seHAS的稳定性是非常重要的物质，并且这些残基涉及到能够使HAS合成摩尔质量非常大的HA。关键词 透明质酸合酶；透明质酸；赖氨酸；谷氨酸；SeHAS；HA产物大小；大肠杆菌； 1934年，Meyer和Palmer发表文献之后，透明质酸无所不在，经常大量存在于脊椎动物组织的细胞外基质组分中，尤其存在于软骨、皮肤和玻璃体液中。H
4、A也可以由多种致病细菌产生。HA是一条线性非分支交替地多聚分子，由（1，4)-N-乙酰葡糖胺和（1，3）-D-葡糖醛酸构成。传统的HA是非常多分散的。经典的最小分子100KPa,最大的分子接近于10MPa。HA是由HAS合成。自从1993年第一次HAS gene出现于链球菌Group A之后，相似的HAS gene已经在其它细菌、蛙类、人、其它的哺乳动物以及甚至在一些干扰藻类（1014）的病毒里面。这些大于20的HAS组成了一个拥有共同特点和AA序列相同或相似区域的蛋白家族。这种存在于巴氏杆菌的酶只是一种HAS但并不属于这个大家族，因为它在其结构、拓扑结构和作用机制的不同。 尽管在结构上简单，
5、HA对于脊椎动物的正常发育是必要的，并在正常的健康和各种疾病中扮演着非常重要的功能。很多研究已经达成共识：HA不仅仅是一种结构分子，并且是一种能够调整包括形成心脏垫、血管再生术及多种抗药性等复杂细胞行为的细胞信号。令人惊讶的是，很多这些细胞信号作用是由较小HA的调节，而不是较大MM HA。例如，血管再生（16，17） 被较小的HA所刺激，而不是较大的HA，并且能活化巨噬细胞，从而达到促进表达大量只反应成小HA的基因。小分子HA片段通过特定细胞表面受体来刺激信号连续传递给靶细胞，。因此，在特定的糖蛋白CD44（18）中，小分子HA和大分子HA可能对其有不同的生物学功能。 逐渐达成的共识表明，特定
6、生物反应可能很好依赖于特定大小网状的HA。还发现了，尽管他们催化相同的反应，但是不同的HASs产生HA的大小不同，一般为（2022）。例如，来自于能表达HAS 1或HAS 3细胞的膜合成0.22.0MDa的HA，然而大于2MDa的HA分子由来自于能表达HAS 2细胞膜上合成的。如果相同的结果适用于活的人体细胞，由HAS1、HAS2或HAS3合成的实际HA大小分布对于特定的生物学功能是不同的。这些人类HAS geng的表达方式在不同的成年和胚胎组织中是截然不同的。就像在胚胎发育过程中暂时的表达模式一样，不同大小的HA由三种HAS同工酶在不同时期和特定组织中合成。因此，这些HA可能涉及不同的生理学
7、功能。 当前，通过能调整HAS活性的细胞和影响有HAS产生HA大小的因素，人们对理解这些作用机理产生很大的兴趣。这是第一次关于由大小分离色谱法及多角度激光散射方法分析由包含野生型或突变型的细胞膜合成HA的摩尔质量的报道。在近来的研究中，我们检测了两种保守并且处于不同膜结构域的AA，其对于HAS功能至关重要。这些结果显示了，它们涉及到HAS能合成高摩尔质量HA的能力，并且支持了一种假说：MD2和MD4足够的近为这两种残基的直接作用于HA的相互作用提供可能。1. 位于HAS膜结构域的极性AA残基的突变能改变HA的大小1.1 实验过程1.1.1 载体、引物和试剂表达载体pKK223来自于安玛西亚公司
8、。大肠杆菌SURE细胞体和点突变试剂盒来自Stratagene。突变的寡核苷酸由Genosys（Spring，德克萨斯州）生物技术有限公司合成并由反相色谱分析进行纯化。Cy-5荧光测序引物由分子生物学资源装备所合成。其他的寡核苷酸引物由UDP-GLcUA和UDP-GIcNAC分别来自于Fluka和Sigma公司。UDP-14CGLcUA（300mCLmmol）来自于铂金埃尔默生物科学院。所有其他的试剂是最高等级，都来自于Sigma除去个别标记。1.1.2 定点突变发生在3-端带有编码His6尾巴融合物的seHAS基因克隆导入pKK233(25).定点突变有意意引物设计成将Glu变成Gln（5-
9、CTATGGACCATACTTCAGGTGTCTATGTTTATG),Asp(5-CTATGGACCATACTTGATGTGTGTATGTTTATG)，或Lys48转变成Arg（5-GCTTACCTATTAGTCAGAATGTCCTTATATCCTTT）或Glu（5-GCTTACCTATTAGTCGAAATGTCCTTATCCTTT）。编码感兴趣突变的两互补寡核苷酸引物用于制造单一AA突变，SeHAS（K48E，E827K）二突变基因用单AA突变的质粒DNA作为模板合成。突变生成是根据制造商的指导下用Quikchange来进行的。含有seHAS His基因的pKK233质粒在SURE细胞中合成
10、，用旋转纯化盒纯化，其作为模板用于与一对突变基因引物的引物延伸反应，用pfu DNA聚合酶进行PCR扩增，条件如下：95 1min，58 1min，68 18min 16个循环过后，突变的质粒经二磷酸吡啶核苷酸热处理后去消化甲基化和半甲基化亲本DNA。经消化的pDNA导入SURE细胞，克隆子得到筛选后用于进行感兴趣的突变。通过用荧光标签的终端剂（ABI棱柱377型号程序）对单一的pDNA进行测序，挑选出来的突变基因的完整阅读框通过用Cy-5标签的载体引物在法马西亚阿尔法快速DNA测序仪上进行双向测序，数据用ALF Manager进行分析。SeHAS突变体的酶活性大肠杆菌SURE细胞（其内含有各
11、种seHAS突变基因的质粒）在鲁利亚培养基介质中子32下培养至A6000.8并用1mM异丙基硫代-半乳糖苷诱导3h获得细胞，其如钱数一样准备细胞膜。SeHAS变异体的特定活性在37 ，50mM磷酸钠和磷酸钾缓冲液，p为7.0，加上20mM MgCl2，1mM DTT,0.1mM 苯甲基磺酰氯，1.0mM蛋白酶抑制剂和2uM 亮氨酸蛋白酶抑制剂，240uM UDPG-GlcUA,0.7uM UDP14CGlcUA,0.6uM UDP-GlcNAC 组成的100ul 的体系中得到测定。细胞膜（含0.540ugPr）加入体系起始酶反应，需加入SDS终止反应，使其在体系的终浓度为2%，并且HA中14C
12、GlcUA的加入使其能通过递减的纸层析来得到测定。所以的样品用2个或3个独立的膜标本以双份或三份进行分析。结果用平均数来表示。实验在时间和蛋白质浓度成线性的条件下进行。Km值和Vmax值如前述所述通过Tiapak-simmons进行测量。1.1.3 膜上SeHAS蛋白浓度的测定和SeHAS活性的标准化含有野生型或突变型seHAS的大肠杆菌细胞膜经溶解并在10%SDS-PAGE电泳.在每种膜标本中seHAS蛋白通过凝胶染色图像分析进行量化.膜中seHAS带的调整值与纯seHAS去评估膜中蛋白的seHAS蛋白含量的标准曲线进行对比,然后这些数据用于标准化膜内变异HAS活性相对于野生型。1.1.4
13、由seHAS变异体产生的HA产物大小的测定由野生型或突变型seHAS合成HA的绝对质量通过不加标签的HA产物的SEC-MALLS分析进行测量。对研究包含HAS的膜合成HA的SEC-MALLS程序的有关记录在其他方面有更多详细的描述。膜在0下通过超声波进行破碎，再加入0.51.0mL的试验缓冲液（在微星离心管中），在上面制备一样，但需要加入2%的甘油、0.1mM EDTA但物MgCl2或底物，加入UDP-GlcUA和UDP-GlcNAC，使其终浓度为1mM。以上混合物在30温育10min，然后加入小牛肠碱性磷酸酶使其终浓度为0.02UuL，接着添加MgCl2使其终浓度为20mM。最后，样品在30
14、下在振动的小型冰槽搅拌器中温育4h。此反应通过加入EDTA和UDP(最终的浓度分别为40mM和10mM)，在冰上冰浴20min，然后在100下沸腾使磷酸酶失活。用两种Plaquagel-OH 60凝胶色谱柱连续地以0.5mLmin的流速在50mM磷酸缓冲液、PH为7.0、150mMNaCl中，在22下对样品进行色谱分离，顺序地用DAWN DSP激光测光计和OPTIAB DSP折光计进行MALLS分析（都来自Wyatt技术）。在微星离心管中的20ul样品在注射之前先在100下沸腾2min，然后用Astra v4.73进行分析数据，dndc的值为0.153 ，A2值为0.0023并且一介导数和二阶
15、导数分为HA2MDa.1.1.5 总结前面提到由Lee和Corrman制备琼脂糖凝胶电泳通过Bradford方法用小牛血清蛋白作为标准蛋白对样品蛋白进行测定。西方是根据Burnette程序用带有并如前面所描述的修饰的多克隆白兔的抗体IgG对saHAS进行分析。 1.2 结果及其讨论 HAS家族成员的AA排列展现出几种比较保守的存在于MDs的带电或极性残余物。尽管这些AA出现在许多蛋白质中，但带电或极性AA在MDs并不是经常能发现，因为当它们出现在疏水的双层磷脂分子中时，它们制造一种不利的能量形式。一种机能能缓它们的作用，就是必须有两种极性或带有相反电荷的AA存在于附近并能够形成一对离子对或者是
16、氢键。例如，在MDV中乳糖通透酶中的Arg144能于在MD的Glu269形成氢键，这种相互作用促进排列及稳定在Arg144和底物乳糖之间氢键的形成。图1.关于SeHAS的Lys48和Glu327的细胞膜内极性对大多数HAS家族中是保守的。这种部分的排列展现出AA序列在对应于残基Lys48和Glu327的区域附近的AA序列。这两种残基在三种链球菌(乳房、链球菌、脓疮）的HAS中是完全保守的。尽管不相同，但是这两种残基在大多数真核HAS家族中总体是保守的，比如，来自于鸡、鼠、蛙、人或藻病毒。根据含有Lys48的seHAS，所有其他带有相似极性残基Glu的HAS家族，在相同的位置，这些含Glu327
17、的seHAS在位置上是保守的。所有真核家族成员包含了在seHAS位置三种残基内高度保守的Glu。在seHAS中，Lys48和Glu327分别存在于MD2和MD4中，这些AA在链球菌产生的酶中是绝对保守的（图.1）。尽管存在于seHAs中的Lys48在其他HAS家族成员中不是保守的，但绝对保守的极性Gln残基经常出现在相同的位置(图.1B)。在真核HAS家族成员中，SeHAS中的Glu327残基在位置上高度保守，所有的HAS家族成员在HAS中,3个Aa位置内都有一个Glu（图.1B）.Lys48可以是带电的也可以是不带电的，其参与链球菌HASs的氢键合成。像Lys，Gln的极性侧链作为H+受体或
18、供体参与多种氢键合成。我们已经表明来自内部的孔状结构并穿过正在合成HA链的HASs膜结构域能够移动并且表明了HASs有能够随着HA链延长的过程中运输HA穿过膜的能力。因为链球菌的HASs还有可能是真核生物HASs，它们依赖于磷脂质的，这个小孔很可能是通过HAS磷脂复合物的特定相互作用而形成的，这种孔也可能需要在HAS中MDs的特定相互作用。图 2.大肠杆菌膜中在Lys48和Glu327的重组seHAS变异体的表达和定量分析。制备膜用于细胞表达野生型或感兴趣的变异体seHAS，经过SDS-PAGE，这种凝胶可以用考马斯亮蓝染色用于定量分析HAS蛋白的表达情况，也可以点样到硝酸纤维素薄膜上通过We
19、stern方法来检测HAS蛋白。注意：SeHAS（E327D）和seHAS（K48E）的相关迁移速率都比野生型seHAS的迁移率慢得多（用虚线指示）。为了检测Lys48和Glu327相互作用的可能性或对HAS功能至关重要的其他因子，我们制备了突变体。在这些突变体中，Lys48突变成Arg或Glu和Glu327突变成Asp、Lys或Gln。根据Western分析方法(图.2A)表达所有这些seHAS突变体。尽管蛋白质水平变化很大(图.2B)，但E327D、K48R好人K48E突变体变现出接近野生型表达水平。相反，E327Q和E327K突变体表达量很低。然而，增加了K48E这种突变体反而恢复了se
20、HAS（E327K）蛋白表达量使其恢复至野生型水平。在以后的分析中，不同数量的膜蛋白习惯于至少部分的相互弥补这些表达量的不同。HAS家族成员以相当较小的显著大小在SDSPAGE上迁移。比如说，49kDa seHAS像一种42kDa蛋白那样迁移。这些异常的行为表明了尽管在SDS中沸腾，这些蛋白仍能保持本质的三级或四级结构并且结构不完全折叠。有兴趣的是，SeHAS（E327D）和seHAs（K48E）在SDS-PAGE上的迁移率明显慢于野生型或其他变异型，表明了这两种蛋白通过SDS处理更加松散并更加易于变性。通过增加E327K变化seHAS蛋白的方法可恢复正常迁移。1.3 制表1 透明质酸合酶活性
21、及有在Lys48和Glu327突变的seHAS突变体产生的HA产物的摩尔质量。用23膜制品进行多种实验去分析Vmax值和由包含指示的seHAS变异体的膜合成的HA的平均摩尔质量。 seHAS 突变体 野生型的Vmax值（%） 透明质酸产物的摩尔 的质量 MDa Wild type 100 3.64 0.07 E327D 38 2.0 3.200.01 E327Q 274.1 1.520.38 E327K 0.16 0.2 Not detected K48E 6.7 0.2 0.68 0.02 K48R 17.2 2.6 1.890.10 E327K & K48E .5 0.3 0.61 0.0
22、9所有seHAS突变体都有酶的活性尽管几乎能察觉到seHAS（E327K）（图 1）.Vmax值从对于seHAS（E327K） 0.16%变化到对于seHAS（E327D） 38%。AA在位置上转变成相似残基Lys48或Glu327一般比转化成不相似的极性残基具有更小的破坏性。关于seHAs突变体UDPsugar的Km值改变的不是很大，它们通过达到2倍来不同于野生型。尽管带有Glu327转变成Asp或Gln的seHAS突变体具有很好的酶活性，但E327K突变体具有相当小的活性。然而，seHAS的活性和表达量通过结合带有在48位置上相互转变产生seHAS（R48E，E327K）突变体的这种突变，
23、从而快速增加。这种双开关突变体像野生型一样表达并且展现出野生型酶活性的7.4%。Lys48到Glu的转变至关重要的恢复了seHAS（E327K）的酶活性，使这种突变体的活性增加了46倍多。如果位于seHAS的Lys48和Glu327残基调节MD2和MD4之间的相互作用，并且它们的干扰能破坏一种假设性的分子间孔，酶通过这个孔运输HA。破坏这个孔可能破坏HAS运输延伸着的HA的速率（导致合成速率减慢），并且还影响HAS保持延伸HA链的能力，导致较小HA产物的合成。图 3.由膜结合的野生型seHAS或seHAS变异体合成HA的SEC分析。未标记的HA由含有野生型seHAS（WT，实线）或指示的突变体
24、的膜合成的并且这些样品通过SEC-MALLS进行分析。这些线展现出折射指示值。A，由E327D（虚线）或E327Q（虚线）seHAS突变体合成的HA。B，由野生型（WT，实线）或K48E（虚线）或K48R（点虚线）seHAS突变体合成的HA。C，由双开关seHAS（K48E，E327K）突变体（虚线）合成的HA是WT HA大小的六分之一。用SEC-MALLS去描述由含有HAS的膜合成HA的相关报道至今没有。尽管事实是MALLS是评估大小分布和多分散HA绝对质量的最好技术之一。近来我们开发了进行这种分析的程序（29）并用这种新方法去量化由这些seHAS变异体（图.3and4）合成HA大小的不同。
25、平均摩尔质量在图一中得到总结。凝胶过滤后解剖图展示了HA产物的大小分布仍保持正常（大约均匀）尽管突变体合成较小分子的HA（图.3）。SeHAS（K48E）和seHAS（K48E，E327K）突变体产生最小的HA分子，本质上摩尔质量相同。由野生型酶和seHAS（K48E，E327K）产生HA产物的平均重量分别为3.64MDa和0.61MDa（图,4，图,1）.图 4列出了高质量光散射数据，这些数据为表达seHAS的膜合成HA而制得。图4.由膜结合的野生型seHAS或seHAS（K48E,E327K）合成HA的SEC-MALLS分析。未标记的HA由包含野生型seHAS（实线,实心圆圈）或双开关突变
26、体（虚线，实心三角）的膜合成，然后一个SEC-MALLS进行分析。光散射数据用于测定HA产物的平均摩尔质量。链球菌HASs调节合成的HA合成物发生在逐渐减少的末端（38-40）并且延伸HA链一旦得到释放。尽管在理解HAS拓扑结构和HA链延长机制的方面得到发展，但几个关于HAS功能的重要问题仍然未能解答。一个问题是怎样控制HA产物的大小。第二个问题设计到运输HA产物到细胞外的机理。因为酶的活性位点位于细胞内(28)。其他研究人员已经提出HAS在细胞内合成HA并且提出HA特定的ABC转运者能运输HA到细胞外(41)。我们已经提出膜结合的HAS本身能在生物合成过程中将HA链转运到双分子层膜。这种假说
27、是根据各发现，包括UDP-糖结合位点位于或邻近膜-HAS表面（42）并且实际上不像其他所有糖基转移酶。HASs是依赖于磷脂质（34，35）的并具有多种跨膜结构域（28）。另外，遗传和生化数据表明了：如果底物存在仅仅是种用于HA生物合成的蛋白。当不能正常合成HA的细菌通过转化导入hasA基因和用于合成UDP-糖前体的基因,这些细胞产生HA并更加重要的是将HA分泌进入介质中。例如，除了hasA以外的外源基因再也没有为乳糖杆菌（7）或枯草杆菌细胞（43）在培养基中积累HA。根据两种链球菌HASs和非洲爪蟾蜍的HAS1的辐射钝化分析，有活性的膜连接酶只包含单个的HAS蛋白（而不是一个寡聚体），但是这种
28、蛋白和23KDa的附加质量是有关的。这种附加质量不能由有活性的HAS1酶所确认但能由链球菌酶所确认为心磷脂。因此，一种有活性的链球菌HAS是一种带有16个分子心磷脂的蛋白。当在不存在心磷脂的情况下纯化的话，链球菌的HASs表现出较低的生物活性，然而当这种磷脂存在的情况下酶活性将提高10倍（34）。因此，所有HAS家族成员可能需要脂质去合成HA，但是不同的HASs家族可能需要不同类型的脂质。我们假设心磷脂分子可能促进酶在HAS-脂质复合体中形成一个孔状通道，通过这个通道延伸中的HA分子链穿过细胞。图 5.SeHAS及残基Lys48和Glu327的拓扑结构。A,在seHAs中从MD1到MD6（白色
29、数据）的方向和连接每个MD存在于细胞质中的AA位置编号已经在图上指示出来。Lys48和Glu327分别是在MD2和MD4之间的白色圈圈;在这两者之间假设的相互作用通过虚线箭头指示出来。B,在存在于MD1-MD6的可能结构中，MD2和MD4相互联系（通过用白色框架指示的Lys48和Glu327相互联系）。在MD簇中的黑色区域表示假设性的分子间孔，延伸中的HA链通过这个孔运输跨过膜。在每一张图中，细胞内部都在下面。如果HAS的MDs能形成在HA生物合成过程中能穿过的孔，然后很有可能在MDs中有一种特定的作用，这种作用能稳定这种结构并调节与HA链相互作用的形成和断开循环随着HA-UDP交替的运输与延
30、伸。结果表明不管是Lys48还是Glu327的变化都能抑制酶的活性和改变HA产物大小及支持了一种可能性的观点：Lys48和Glu327是能调节处于MD2和MD4之间相互作用的绑定伙伴。后来的结论通过双开关突变体的蛋白表达量和酶活性与E327K突变体相比较的结果而得到大力的支持。尽管通过引入K48E变化能提出关于E327K突变体的其他解释，但是最简单的是位于这两种位置上的Glu和Lys残基直接相互作用。根据seHAS（28）的拓扑结构，Lys48和Glu327在脂双层的相同位置（图,5A）并且能够相互作用。由于非常短小的HAS细胞外环，MD1-MD2和MD4-MD5很可能邻近MD对（e.g.图.
31、5B）。还有可能是存在于MD2和MD4的两种极性残基雨HA中的极性集团相互作用并涉及到在HA合成过程中的排列与运输。当酶不在合成HA时，两侧链可能如上面所述一样直接相互作用。这两种观点的一种感兴趣的交织是：Lys48和Glu327在链延伸和转运的过程中能够以一种交替的方式在这两种情形中进行转化。HA通过酶的运输很可能需要连接链的一个或多个MDs的协调运动，这些链能使HA运动。这很可能是一个循环的过程，在这个过程中，随着HA链以一种飞快的方式通过膜运输到细胞外，HAS中残基和HA链中的特定基团之间的相互作用形成然后断开。尽管影响HA产物大小的每个残基都变化，但是Glu327对于seHAS活性表现
32、的比Lys48更加重要。将Glu327转变成相似的AA Asp后对蛋白的表达量有很小的影响并使HA产物大小只降低到12%,然而将Glu327变化成Lys48将会破坏蛋白，减少表达量并且巨大地抑制其活性。K48E和K48R突变体都表达的很好，表明了这些变化并不能破坏蛋白。SeHAS（K48E）在SDS-PAGE中较慢的迁移率和它产生的较小的HA产物大小（野生型的19%）与突变蛋白是一致的，不紧密并抑制HA连接形成或HA运输或两者都有。我们解释了这些结果是为了表明Glu327参与氢键或离子的相互作用，在结构上是重要的。在Lys48位置上改变的相对公差表明了如果这些残基于Glu327反应，然后Glu327与其他的残基发生重要的反应。两侧链或是直接或是间接用过水、磷脂质头上基团或其他侧链相互作用。当前研究的结果表明：随着在SDS-PAGE电泳过程中迁移的评估过程中，在突变对酶活性比对酶稳定性的影响中没有简单的关联。关于这个有一种推断的解释：不管是Lys48还是Glu327都还有可能与HAS中的其他残基相互作用并且有可能与上面提到的HA中的某些集团相互作用
