1、遗传学实验用GUS基因表达观察启动子功能用GUS基因表达观察启动子功能摘要通过GUS基因表达染色程度判定启动子关键序列。1.引言在真核生物中，主要通过顺式调控元件启动子和反式作用因子转录因子的相互 作用，对基因表达进行调控。启动子的功能可以利用报告基因进行检测。报告基因GUS基因存在于E.coli等一些细菌基因组内，编码卩-葡萄糖昔酸 酶。卩-葡萄糖昔酸酶是一个水解酶，以卜葡萄糖昔酸酯类物质为底物，其反应产物 可用多种方法检测出来。由于绝大多数植物没有检测到葡萄糖昔酸酶的背景活性， 因此这个基因被广泛应用于植物基因调控的研究中。科研工作中发现，盐芥液泡焦磷酸酶基因启动子（TsVPl）在除了种子
2、以外的 所有组织中都有活性，它的活性在根和叶中能被盐诱导，尤其在根尖中。为了研究 启动子的关键序列，构建了盐芥液泡焦磷酸酶基因启动子（TsVPl）不同长度启动 区控制的A葡萄糖昔酸酶（GUS）载体pCAMBIA1391z （PTsVP:GUS）,转染 拟南芥，获得转基因拟南芥PT1, PA1和P7。发现PT1, PA1和P7具有不同的 GUS活性及盐诱导活性。表明启动区长度对启动子功能有影响，由此推测启动子 的关键序列及诱导特点。2.实验材料2实验材料2.1材料拟南芥种子PT1、PT2、PT7、PT82.1.1试剂配制MS培养基所需的母液，琼脂，蔗糖，lmol/L的NaOH溶液，70%乙 醇，
3、无菌水，10%次氯酸钠，琼脂粉，NaCl, lmol/LGUS染色液。2.1.1器具量筒，移液枪，烧杯，天平，玻璃棒，滴管，pH计，500 mL锥形瓶，高压蒸 汽灭菌锅，培养皿，EP管，人工培养箱，吸管，吸水纸。2.2实验方法2.2.1配制MS培养基MS培养基：Murashige和Skoog于1962年为烟草细胞培养设计的，其特点是 无机盐和离子浓度较高，是较稳定的离子平衡溶液，它的硝酸盐含量高，其养分的 数量和比例合适，能满足植物细胞的营养和生理需要，因而适用范围比较广，多数 植物组织培养快速繁殖用它作为培养基的基本培养基。MS培养基组成:301.113900MHOS旳(H1650kOn.*
4、Wffi UW DiS&l13t.OTjsn. hso： to)94C. ITN化竹 CaC12. 2H2O347.02110*ftw KI3W.OI0. B3H.W3?3Q12oS01? H2C28L5IlilWIA d0t.2KM2120.25JVM CuSOtSRW2.1W5KftM 仏 1M22r,w酸网乙做诞1W.SDTAFeto?仁 7HXJ骑2 253：31Q0烟酸 VB5或VPP05蔗 Wj sucrose342. 3130g/L琼脂 agar7 s/L配制母液的优点是：1、避免每次配制培养基都要对几十种成分进行称量。2、 减少了称量微量元素造成的误差。配制MS培养基：（1）用
5、量筒和移液枪从各种母液中分别取出所需的用量：母液I （大量元素20x）为10 mL,母液II （微量元素200x）、III （铁盐200x）、IV （有机成分 200x）各ImL,加入烧杯中,再加入蔗糖6g,加蒸镭水至175mL左右。(2)用滴管吸取物质的量浓度为1 mol/L的NaOH溶液，逐滴滴入溶化的培 养基中，边滴边搅拌，并随时用pH计测培养液的pH,直到pH为5.8为止(培 养基的pH必须严格控制在5.8。(3)在大量筒中定容至200mL ,倒入锥形瓶，加入1.6g琼脂粉。(4)同样的方法配制200mL含盐的培养基，在第(1)步中加入2.34g NaCl。 (5)称0.005g左右的
6、琼脂粉与10mL蒸镭水混合，配成0.05%琼脂液。(6)高压灭菌第一，码放锥形瓶。将装有培养基的锥形瓶直立于金属小筐中，再放入高压蒸 气灭菌锅内。第二，放置其他需要灭菌的物品。将其他需要灭菌的物品也放入高压蒸气灭菌 锅内，如用牛皮纸包裹的培养皿、枪头、无菌水、琼脂液等。第三，灭菌。待需要灭菌的物品码放完毕，盖上锅盖。在98 kPa、121.3 C 下,灭菌20 min。第四，灭菌后取出锥形瓶，让其中的培养基自然冷却凝固，或立即倒平板。2.2.2培养拟南芥幼苗(1)培养皿分装培养基将锥形瓶中的培养基加热融化，在超净工作台上将其趁热倒入四个培养皿，令 其自然冷却凝固。(2)种子灭菌种子在EP管内经
7、体积分数70%乙醇漂洗1 min,无菌水洗1次，等量无菌水 和10%次氯酸钠混合浸洗10 min ,无菌水洗5遍 最后加入质量分数0 . 05%的 琼脂液悬浮，分别均匀撒于平板上。(3)适宜环境培养培养条件：在人工气候室培养，调节温度20C,湿度75%,光照3OOpmol/s m 2光周期16h光照/8h黑暗（4）盐处理将MS培养基上培养一周多的植株取10株左右转移到含有200mmolL-lNaCl的培养基上相同条件下培养16小时，剩下一半原条件继续培养。3结果PT1染色深于PT2,说明PT1中启动子多于PT2的序列能增强GUS基因的表 达。而PT2的小叶未被染色，说明PT2缺失的部分基因可能
8、与GUS基因在小叶中 的表达有关。PT7染色与PT2相似，说明PT7相对PT2缺失的启动子序列对于GUS基因表 达作用效果影响相对较小。但是PT7中小叶染色，因此说明在所缺失中的启动子 序列中存在调控GUS基因在小叶中表达的序列，同时根据PT2与PT1的对比，说 明PT2相对PT1中缺失的序列与PT7相对PT2缺失的序列共同影响GUS基因在小 叶中的表达。PTS相对PT7染色较浅，说明PT8相对PT7缺失的序列对GUS表达有増强作 用。而PT8中根基本无染色，说明缺失部分序列对GUS基因表达影响较大。PT2经盐处理后，染色明显加深，而且小叶中也出现轻微染色，说明盐处理 能促进GUS基因的表达。PT7经过盐处理后，染色也出显的加深，说明GUS基 启动子仍然活性较强。现明因的PT8经盐处理后，染色稍加深，但对比不明显， 说明PT8上存留的启动子序列对GUS基因表达的作用已经不是很强烈了。4讨论4.讨论经结果讨论推断，启动子关键序列有可能存在与PT7与PT8序 列之间，但是由于7、8号拟南芥染色差别不明显，因此，不能十分确定，也有可 能关键序列在PT8剩余的序列内，如需确定，还应经过进一步实验确定。
