1、基因工程复习整理第34讲基因工程1.基因工程的基本工具(1)限制性核酸内切酶(限制酶)来源：主要从 生物中分离纯化而来。作用：识别 并切开特定部位的两个核苷酸之间的 。结果：产生 或平末端。如下图所示，EcoR限制酶识别的碱基序列是 ，切割位点在 之间；Sma限制酶识别的碱基序列是 ，切割位点在 之间；说明限制酶具有 。(2)DNA连接酶作用：将限制酶切割下来的DNA片段拼接成DNA分子。类型常用类型Ecoli DNA连接酶T4 DNA连接酶来源功能“缝合” “缝合” 结果恢复被限制酶切开的两个核苷酸之间的 键(3)载体常用载体质粒其他载体： 、 等。载体的作用：携带外源DNA片段进入受体细胞
2、。(1)基因工程2种工具酶的化学本质分别是什么？运载体的种类有哪些？(2)限制酶为何不切割自身DNA?(3)限制性核酸内切酶Mun 和限制性核酸内切酶EcoR 的识别序列及切割位点分别是和。如图表示四种质粒和目的基因，其中箭头所指部位为限制性核酸内切酶的识别位点，质粒的阴影部分表示标记基因。适于作为图示目的基因载体的质粒是哪一种？并指明理由。2.基因工程的基本操作程序(1)目的基因的获取目的基因：主要指 的基因，也可以是一些具 作用的因子。获取方法(2)基因表达载体的构建基因工程的核心目的：使目的基因 ，同时使目的基因能够表达和发挥作用。基因表达载体的组成 构建过程(3)将目的基因导入受体细胞
3、受体细胞种类不同，导入方法不同生物种类植物细胞动物细胞微生物细胞常用方法 受体细胞 转化过程将目的基因插入到Ti质粒的TDNA上导入农杆菌侵染植物细胞整合到受体细胞的染色体DNA上表达将含有目的基因的表达载体提纯取卵(受精卵)显微注射受精卵发育获得具有新性状的动物Ca2处理细胞感受态细胞重组表达载体与感受态细胞混合感受态细胞吸收DNA分子(4)目的基因的检测与鉴定1.下列物质或过程哪一项不影响磷酸二酯键数目变化？请逐项分析说明。RNA聚合酶、逆转录酶、Taq酶DNA聚合酶、DNA连接酶、DNA酶遗传信息的翻译、PCR中DNA解链 cDNA文库的构建、基因突变过程2.(教材P4“寻根问底”改编)
4、根据你所掌握的知识，你能分析出限制酶存在于原核生物中的作用是什么吗？3.(教材P6“旁栏思考题”解答)想一想，具备什么条件才能充当“分子运输车”？1.某一质粒载体如图所示，外源DNA插入到Ampr或Tetr中会导致相应的基因失活(Ampr表示氨苄青霉素抗性基因，Tetr表示四环素抗性基因)。有人将此质粒载体用BamH 酶切后，与用BamH 酶切获得的目的基因混合，加入DNA连接酶进行连接反应，用得到的混合物直接转化大肠杆菌，结果大肠杆菌有的未被转化，有的被转化。被转化的大肠杆菌有三种，分别是含有环状目的基因、含有质粒载体、含有插入了目的基因的重组质粒的大肠杆菌。回答下列问题：(1)质粒载体作为
5、基因工程的工具，应具备的基本条件有_(答出两点即可)，而作为基因表达载体，除满足上述基本条件外，还需具有启动子和终止子。(2)如果用含有氨苄青霉素的培养基进行筛选，在上述四种大肠杆菌细胞中，未被转化的和仅含环状目的基因的细胞是不能区分的，其原因是_；并且_和_的细胞也是不能区分的，其原因是_。在上述筛选的基础上，若要筛选含有插入了目的基因的重组质粒的大肠杆菌单菌落，还需使用含有_的固体培养基。(3)基因工程中，某些噬菌体经改造后可以作为载体，其DNA复制所需的原料来自于_。2.如图为农杆菌转化法示意图。请回答以下问题：(1)图中过程用到的工具酶的特点是_(2)图中过程用到的工具酶是_，该过程是
6、基因工程最核心的步骤，即_。(3)图中过程，需使用_溶液处理农杆菌使其成为感受态。(4)图中过程的原理是_。(5)检测基因工程是否成功。首先，应检测_，这是目的基因能否在真核细胞内稳定遗传的关键；其次，利用_法检测目的基因是否转录出相应的mRNA；最后，利用_法检测目的基因是否翻译成蛋白质。(1)诠释基因组文库与部分基因文库基因文库类型基因组文库部分基因文库(cDNA文库)构建基因文库的过程(2)诠释PCR技术原理：体外DNA复制需要条件：模板DNA、引物、四种脱氧核苷酸、热稳定DNA聚合酶(Taq酶)过程：DNA受热(9095 )变性解旋为单链、冷却(5560 )后RNA引物与单链相应互补序
7、列结合，然后在DNA聚合酶作用下延伸(7075 )合成互补链。(3)诠释基因表达载体(4)农杆菌转化法原理植物受损伤时伤口处分泌物可吸引农杆菌农杆菌中Ti质粒上的TDNA可转移至受体细胞并整合到受体细胞染色体DNA上(若将目的基因插入到Ti质粒的TDNA上，则目的基因将被一起带入)1.基因工程的应用(1)动物基因工程：用于提高动物 从而提高产品产量；用于改善畜产品品质；用转基因动物生产 ；用转基因动物作器官移植的 等。(2)植物基因工程：培育 转基因植物(如抗虫棉)、 转基因植物(如转基因烟草)和 转基因植物(如抗寒番茄)；利用转基因改良植物的 (如新花色矮牵牛)。(3)比较基因治疗与基因诊断
8、：原理操作过程进展基因治疗 利用 导入有基因缺陷的细胞中，以表达出正常性状来治疗(疾病)临床实验基因诊断 制作特定 与病人样品DNA混合，分析杂交带情况临床应用2.蛋白质工程(1)概念理解基础：蛋白质分子的结构规律及其与生物功能的关系。操作： 或基因合成。结果： 现有蛋白质或制造出 。目的：根据人们对蛋白质功能的特定需求，对 进行分子设计。(2)操作过程从预期的蛋白质 出发设计预期的 推测应有的 找到相对应的 (基因)基因表达产生需要的蛋白质。其流程图如下：1.蛋白质工程操作程序的基本思路与基因工程有什么不同？2.(教材P26旁栏思考题解答)对天然蛋白质进行改造，你认为应该直接对蛋白质分子进行
9、操作，还是通过对基因的操作来实现？1.已知生物体内有一种蛋白质(P)，该蛋白质是一种转运蛋白，由305个氨基酸组成。如果将P分子中158位的丝氨酸变成亮氨酸，240位的谷氨酰胺变成苯丙氨酸，改变后的蛋白质(P1)不但保留P的功能，而且具有了酶的催化活性。回答下列问题：(1)从上述资料可知，若要改变蛋白质的功能，可以考虑对蛋白质的_进行改造。(2)以P基因序列为基础，获得P1基因的途径有修饰_基因或合成_基因，所获得的基因表达时是遵循中心法则的，中心法则的全部内容包括_的复制；以及遗传信息在不同分子之间的流动，即：_。(3)蛋白质工程也被称为第二代基因工程，其基本途径是从预期蛋白质功能出发，通过
10、_和_，进而确定相对应的脱氧核苷酸序列，据此获得基因，再经表达、纯化获得蛋白质，之后还需要对合成蛋白质的生物_进行鉴定。2.科学工作者将抗虫毒蛋白基因通过载体转入棉花细胞，对抵抗棉铃虫有很好的作用。请回答与该抗虫棉培育有关的问题。(1)抗虫毒蛋白基因是从苏云金芽孢杆菌中获得的，获得该基因需要使用的酶是_，该酶作用的化学键是_。(2)将含有抗虫毒蛋白基因的基因表达载体导入棉花体细胞中的常用方法是_；要将已经成功接收基因表达载体的棉花体细胞培育成一个新的植株需要用到的生物技术是_。(3)在研制抗虫棉的过程中，利用标记基因可以快速检测基因表达载体是否导入棉花细胞，然而，即使基因表达载体已经导入棉花细
11、胞，也不能确定转基因过程已经取得成功。因此，在该项工程的最后阶段，需要做一系列检测。例如，用放射性同位素标记的_作探针，可以分别检测棉花细胞中是否有_；向棉花细胞的匀浆中加入特定的_，可以检测棉花细胞中是否能够产生抗虫毒蛋白。(4)我国西北的一些地区年降雨量很小，只适宜种植少数的草本植物，但却被硬性规定种植转基因的抗虫棉，结果造成减产。这个案例主要违背了生态工程的_原理。蛋白质工程与基因工程的比较项目蛋白质工程基因工程实质定向改造或生产人类所需蛋白质定向改造生物的遗传特性，以获得人类所需的生物类型或生物产品(基因的异体表达)结果生产自然界中没有的蛋白质生产自然界中已有的蛋白质联系蛋白质工程是在
12、基因工程的基础上延伸出来的第二代基因工程，因为对现有蛋白质的改造或制造新的蛋白质，必须通过基因修饰或基因合成实现1.PCR技术(1)PCR原理：DNA复制原理，即：(2)PCR反应过程过程说明图解 当温度上升到 以上时，双链DNA解聚为单链复性温度下降到 左右，两种引物通过碱基互补配对与两条单链DNA结合 72 左右时， 有最大活性，可使DNA新链由5端向3端延伸(3)结果： 上述三步反应完成后，一个DNA分子就变成了 个DNA分子 ，随着重复次数的增多，DNA分子就以 的形式增加。PCR的反应过程都是在 中完成的。2.DNA的粗提取与鉴定(1)实验原理(2)操作流程(1)为什么加入蒸馏水能使
13、鸡血细胞破裂？(2)若用植物细胞提取DNA需加入洗涤剂和食盐，其作用是什么？(3)为什么反复地溶解与析出DNA，能够去除杂质？1.关于DNA的实验，叙述正确的是()A.用兔的成熟红细胞可提取DNAB.PCR的每个循环一般依次经过变性延伸复性三步C.DNA溶液与二苯胺试剂混合，沸水浴后生成蓝色产物D.用甲基绿对人的口腔上皮细胞染色，细胞核呈绿色，细胞质呈红色2.PCR技术是分子生物学实验室里的一种常规手段，其原理是利用DNA的半保留复制，在试管中进行DNA的人工复制(如图所示)，在很短的时间内，将DNA扩增几百万倍甚至几十亿倍，使实验室所需要的遗传物质不再受限于活的生物体。(1)PCR的全称是_
14、，94 高温使DNA双链打开，这一步是打开_键，称为_。而这一过程在细胞内是通过_酶实现的。(2)当温度降低时，引物与模板_端结合，在_的作用下，引物沿模板延伸，此过程中原料是_，遵循的原则是_。(3)PCR技术的必要条件除模板、原料、ATP、酶以外，至少还需要三个条件，即液体环境、适宜的_和_，前者由PCR仪自动调控，后者则靠_来维持。(4)DNA的复制需要引物，其主要原因是_。引物的实质是_，若将1个DNA分子拷贝10次，则需要在缓冲溶液中至少加入_个引物。1.生物体内DNA复制与PCR反应的区别体内DNA复制PCR反应解旋在解旋酶作用下，细胞提供能量，部分解开加热至90 ，双链全部解开，
15、不需要解旋酶引物一小段RNA可以是RNA或单链DNA分子片段合成子链在引物基础上，一条链连续合成，另一条链不连续合成分别从两条链的引物端开始，都是连续合成，控制温度72 特点边解旋边复制，半保留复制体外迅速扩增Taq DNA聚合酶不需要需要循环次数受生物体自身控制30多次相同点生物体内的DNA复制和PCR体外DNA扩增都需要模板、四种脱氧核苷酸，且都需要在一定的缓冲溶液中进行易错防范清零易错清零易错点1误认为目的基因的插入是“随机”的点拨目的基因的插入位点不是随意的：基因表达需要启动子与终止子的调控，所以目的基因应插入到启动子与终止子之间的部位，若目的基因插入到启动子内部，启动子将失去原功能。
16、易错点2混淆启动子与起始密码子，终止子与终止密码子，不明确标记基因的作用点拨启动子起始密码子，终止子终止密码子(1)启动子：一段有特殊结构的DNA片段，位于基因的首端。它是RNA聚合酶识别、结合的部位。(2)终止子：一段有特殊结构的DNA片段，位于基因的尾端。作用是使转录过程停止。(3)起始密码子和终止密码子位于mRNA上，分别控制翻译过程的启动和终止。(4)标记基因：一般为抗生素抗性基因或荧光基因等，其作用是鉴别受体细胞中是否含有目的基因(目的基因是否导入成功)，从而将含目的基因的细胞筛选出来。易错点3误认为切取目的基因与切取载体时“只能”使用“同一种酶”点拨(1)在获取目的基因和切割载体时
17、通常用同种限制酶，以获得相同的黏性末端。但如果用两种不同限制酶切割后形成的黏性末端相同时，在DNA连接酶的作用下目的基因与载体也可以连接起来。(2)为了防止载体或目的基因的黏性末端自己连接即所谓“环化”可用不同的限制酶分别处理目的基因和载体，使目的基因两侧及载体上具有两个不同的黏性末端。易错点4误认为基因工程可导致受体细胞或生物产生“新基因”或“新蛋白质”点拨基因工程的实质是“基因重组”，它是将外源基因导入受体细胞，使该基因在受体细胞中表达由于“外源基因”是自然界已存在的“现成”基因，故基因工程并未产生新基因，由此目的基因表达时也未产生新蛋白质，基因工程只不过是让受体细胞(或生物)“实现了外源
18、基因的表达”。规范答题下图表示培育“华恢1号”抗虫水稻的主要流程，据图回答下列问题：(1)杀虫基因通过过程，最终在宿主细胞内维持稳定和表达的过程叫做_。(2)杀虫基因(crylA)是根据几种Bt毒蛋白的分子结构，设计并人工合成的，这属于_工程的技术范畴。(3)组建理想的载体需要对天然的质粒进行改造。下图是天然土壤农杆菌Ti质粒结构示意图(示部分基因及部分限制酶作用位点)，据图回答下列问题：人工改造质粒时，要使抗虫基因能成功表达，还应插入_。人工改造质粒时，用限制酶_(填或)处理，其目的是：第一，去除质粒上的_(基因)，保证TDNA进入水稻细胞后不会促进细胞的分裂和生长；第二，使质粒带有单一限制
19、酶作用位点，有利于_。第三，使质粒大小合适，可以提高转化效率等。(4)若限制酶切割DNA分子后形成的黏性末端为，则该酶识别的核苷酸序列是_。随堂真题演练1.植物甲具有极强的耐旱性，其耐旱性与某个基因有关。若从该植物中获得该耐旱基因，并将其转移到耐旱性低的植物乙中，有可能提高后者的耐旱性。回答下列问题：(1)理论上，基因组文库含有生物的_基因；而cDNA文库中含有生物的_基因。(2)若要从植物甲中获得耐旱基因，可首先建立该植物的基因组文库，再从中_出所需的耐旱基因。(3)将耐旱基因导入农杆菌，并通过农杆菌转化法将其导入植物_的体细胞中，经过一系列的过程得到再生植株。要确认该耐旱基因是否在再生植株
20、中正确表达，应检测此再生植株中该基因的_，如果检测结果呈阳性，再在田间试验中检测植株的_是否得到提高。(4)假如用得到的二倍体转基因耐旱植株自交，子代中耐旱与不耐旱植株的数量比为31时，则可推测该耐旱基因整合到了_(填“同源染色体的一条上”或“同源染色体的两条上”)。2.阅读如下资料：资料甲科学家将牛生长激素基因导入小鼠受精卵中，得到了体型巨大的“超级小鼠”；科学家采用农杆菌转化法培育出转基因烟草。资料乙T4溶菌酶在温度较高时易失去活性。科学家对编码T4溶菌酶的基因进行了改造，使其表达的T4溶菌酶第3位的异亮氨酸变为半胱氨酸，在该半胱氨酸与第97位的半胱氨酸之间形成了一个二硫键，提高了T4溶菌
21、酶的耐热性。资料丙兔甲和兔乙是同一物种的两个雌性个体，科学家将兔甲受精卵发育成的胚胎移植到兔乙体内，成功产出兔甲的后代，证实了同一物种的胚胎可在不同个体的体内发育。回答下列问题：(1)资料甲属于基因工程的范畴。将基因表达载体导入小鼠的受精卵中常用_法。构建基因表达载体常用的工具酶是_和_。在培育有些转基因植物时，常用农杆菌转化法，农杆菌的作用是_。(2)资料乙中的技术属于_工程的范畴。该工程是指以分子生物学相关理论为基础，通过基因修饰或基因合成，对_进行改造，或制造一种_的技术。在该实例中，引起T4溶菌酶空间结构改变的原因是组成该酶肽链的_序列发生了改变。(3)资料丙属于胚胎工程的范畴。胚胎移
22、植是指将获得的早期胚胎移植到_种的、生理状态相同的另一个雌性动物体内，使之继续发育成新个体的技术。在资料丙的实例中，兔甲称为_体，兔乙称为_体。3.人血清白蛋白(HSA)具有重要的医用价值，只能从血浆中制备。下图是以基因工程技术获取重组HSA(rHSA)的两条途径。(1)为获取HSA基因，首先需采集人的血液，提取_合成总cDNA，然后以cDNA为模板，采用PCR技术扩增HSA基因。下图中箭头表示一条引物结合模板的位置及扩增方向，请用箭头在方框内标出另一条引物的位置及扩增方向。(2)启动子通常具有物种及组织特异性，构建在水稻胚乳细胞内特异表达rHSA的载体，需要选择的启动子是_(填写字母，单选)
23、。A.人血细胞启动子 B.水稻胚乳细胞启动子C.大肠杆菌启动子 D.农杆菌启动子(3)利用农杆菌转化水稻受体细胞的过程中，需添加酚类物质，其目的是_。(4)人体合成的初始HSA多肽，需要经过膜系统加工形成正确的空间结构才能有活性。与途径相比，选择途径获取rHSA的优势是_。(5)为证明rHSA具有医用价值，须确认rHSA与_的生物学功能一致。4.基因工程又称为DNA重组技术，回答相关问题：(1)在基因工程中，获取目的基因主要有两大途径，即_和从_中分离。(2)利用某植物的成熟叶片为材料，同时构建cDNA文库和基因组文库，两个文库相比，cDNA文库中含有的基因数目比基因组文库中的少，其原因是_。
24、(3)在基因表达载体中，启动子是_聚合酶识别并结合的部位。若采用原核生物作为基因表达载体的受体细胞，最常用的原核生物是_。(4)将目的基因通过基因枪法导入植物细胞时，常用的携带目的基因的金属颗粒有_和_颗粒。1.请根据基因工程的有关知识回答下列问题：(1)cDNA文库属于_文库，其构建方法是：用某种生物发育的某个时期的_反转录产生的cDNA片段，与载体连接后储存在一个受体菌群中。(2)切割DNA分子的工具是_，它能使每一条链中特定部位的两个核苷酸之间的_键断开，从而形成黏性末端或平末端。(3)基因工程中所使用的DNA连接酶有两类，其中只能“缝合”黏性末端的是_DNA连接酶；既可以“缝合”黏性末
25、端，又可以“缝合”平末端的是_DNA连接酶。(4)将目的基因导入植物细胞采用最多的方法是_；如果受体细胞是大肠杆菌，需要用_处理细胞，使之成为感受态细胞。2.科研小组将大麦的抗旱基因(HVA)导入小麦细胞，并用植物组织培养的方法培育成高抗旱性小麦植株。回答下列问题：(1)该科研小组采用_技术培育抗旱小麦，该生物技术的核心步骤是_。若要获得大量抗旱基因，可通过_技术对抗旱基因进行扩增。(2)要确定抗旱基因在小麦细胞中是否成功表达，从分子水平上鉴定，可采用的方法是_；若要进行个体水平检测，则需要把转基因小麦植株分别种植在_不同的田地，以检测其是否有抗性及抗性程度。(3)在培育成功的转基因抗旱小麦的
26、繁育过程中，抗旱基因和标记基因_(填“遵循”或“不遵循”)基因的分离规律，理由是_。3.图示方案为人们获得生物新品种的过程，请回答下列问题：方案：抗冻蛋白基因烟草细胞抗冻烟草方案：A基因免疫过的B细胞体外培养单克隆抗体方案：人的生长激素基因牛的受精卵早期胚胎受体母牛转基因牛(1)基因工程的核心步骤是_。农杆菌转化法中，根据农杆菌的特点，如果将抗冻蛋白基因插入_上，通过农杆菌的转化作用，就可以使目的基因进入植物细胞，并将其插入植物细胞中_上。(2)推测方案中A基因所起的作用是_，请写出该方案获得的细胞中遗传信息传递时所遵循的法则_。(3)方案中的转基因牛可以通过分泌乳汁来生产人的生长激素。这需要将人的生长激素基因与_的启动子等调控组件重组在一起。该方案中的早期胚胎在移植入受体母牛子宫之前，必须进行性别鉴定，一般是取处于_时期的_细胞进行检测。4.人酪蛋白是人乳汁中的重要营养成分，科学家已培育出转基因山羊来生产人酪蛋白，下图为培育流程，其中为相关过程，请回答下列问题：
