1、基因工程期末复习第一章 基因工程的概念第一节 基因工程诞生的理论基础 一.确定了遗传信息的携带者是DNA而不是蛋白质。明确了遗传的物质基础问题 1. 肺炎双球菌转化实验 1944年 Avery，确定了基因的分子载体是DNA，而不是蛋白质。 2. 噬菌体转染实验 1952年Alfred Hershy和Marsha Chase进一步证明遗传物质是DNA二.揭示了DNA分子的双螺旋结构模型和半保留复制机理，解决了基因的自我复制和传递的问题。 1953年James D. Watson和Francis H. C. Crick揭示了DNA分子的双螺旋结构和半保留复制机制。三.提出了“中心法则”和操纵子学说
2、，并成功地破译了遗传密码，从而阐明了遗传信息的流向和表达问题 1958年Crick又提出了遗传信息传递的“中心法则” 1964年Marshall Nirenberg和Gobind Khorana等终于破译了64个遗传密码 F.Jacob和J.Monod在1961年提出了操纵子学说第二节 基因工程诞生的技术基础 DNA分子的体外切割与连接 1.限制性内切酶（restriction enzymes） Werner Arber 理论预见限制酶 1968年H.O. Smith等分离出第一种限制性核酸内切酶 Daniel Nathans 用限制酶切得SV40 DNA片断 3人于1978年获得Nobel生
3、理或医学奖2. DNA连接酶（ligase） 1967年5个实验室几乎同时发现了DNA连接酶二. DNA分子的核苷酸序列分析 1975年F. Sanger、A. Maxam和W. Gilbert发明了DNA快速测序技术, 1980年Nobel化学奖三.载体的构建 1972年前后使用小分子量的细菌质粒和 噬菌体作载体。在细菌细胞里的大量扩增四.转化技术 1970年M. Mandel和A. Higa发现经过氯化钙处理的大肠杆菌容易吸收噬菌体DNA。1972年S. Cohen发现这种处理过的细菌同样能吸收质粒DNA五.琼脂糖凝胶电泳和southern转移杂交技术 1960s发明了琼脂糖凝胶电泳，可将
4、不同长度的DNA分离开;DNA印迹技术由Southern于1975创建,称为Southern印迹技术 二.基因工程的定义和特征1.定义 在体外将核酸分子插入病毒、质粒或其它载体分子，构建遗传物质的新组合，并使之渗入到原先没有这类分子的寄生细胞内，而能持续稳定地繁殖 在体外对不同生物的遗传物质（基因）进行剪切、重组、连接，然后插入到载体分子中（细菌质粒、病毒或噬菌体DNA)，转入微生物、植物或动物细胞内进行无性繁殖，并表达出基因产物第二章 酶学基础1 拷贝数就是指某目的基因（可以是质粒）在某一生物群体或个体中存在的个数. 单拷贝就是该基因在基因组中只有一个,多则指有多个。 (一)在细菌细胞中，某
5、种特定质粒的数目。根据复制特性，质粒分严紧型和松弛型两类，前者在细胞中只含12个，而后者含1015个以上。恒定的拷贝数与质粒复制控制系统、宿主细胞遗传背景及生长条件有关。质粒复制控制系统首先通过调节复制的起始点来控制拷贝数，调节因素包括阻遏蛋白、反义RNA和某些顺向重复序列。有些质粒还有其他控制系统，如有分配功能的par系统和确保质粒稳定遗传的ccd系统。一旦质粒上与调控有关的基因或位点突变，可使拷贝数明显增加或减少。 (二)。工具酶：进行DNA操作经常要用到的“工具”酶四大工具酶：核酸酶 nucleases 连接酶 ligase 聚合酶polymerase 修饰酶 modification
6、enzyme 第一节 限制性内切酶 【命名、识别位点、切割过程、末端特征（粘端、平端）、酶活单位及定义】限制性内切酶：指能识别特定的DNA序列，在一定的条件下，可在识别位置上或附近对DNA进行切割的酶。二.限制性内切酶的命名 与种类 按照国际命名法，限制性内切核酸酶属于水解酶类。由于限制性酶的数量众多，而且越来越多，并且在同一种菌中发现几种酶。为了避免混淆，1973年Smith 和Nathans对内切酶的命名提出建议，1980年，Roberts对限制性酶的命名进行分类和系统化。 限制性酶采用三字母的命名原则，即属名 + 种名 + 株名的个一个首字母，再加上序号，A、 第一个字母大写，表示该酶来
7、源的细菌属名的第一个字母B、 第二、三个字母小写，表示该酶来源的细菌的种名的前2个字母C、第四个字母 大写 代表不同的变种/品系 小写 代表不同的菌株和型 D、最后罗马字母，代表同一菌株中不同的限制性内切酶 注意限制性内切酶的正确写法：1、前3个字母一定斜体 2、字母与罗马数字间空格 如：EcoR I Pst I I类限制性内切核酸酶 类酶不仅是一种核酸内切酶, 同时在酶分子上还具有甲基化酶和ATPase的活性，所以是具有多种酶活性的复合酶类。作用时除了需要Mg2+作辅助因子外, 还要求ATP和S腺苷甲硫氨酸(SAM)的存在。类酶具有特异的识别序列，大约15个碱基对。 类酶虽然能够在一定序列上
8、识别DNA分子, 并能同DNA分子作用, 因其识别DNA后, 要朝一个方向或两个方向移动一段距离(通常为1000个碱基左右)，并且要形成一个环才能切割DNA(图), 所以识别位点和切割位点不一致，产生的片段较大。 III 类限制性内切核酸酶 III类限制性内切核酸酶也是基因工程中不常用的酶，分子量和亚基组成类似于类酶, 作用方式基本同类酶。如EcoP 1是由两个亚基组成，一个亚基(M亚基)负责位点识别和修饰。另一个亚基(R亚基)具有核酸酶的活性(图3-5)。切割DNA时需要ATP,Mg2+,也能被SAM激活，但并非必需。类限制性内切核酸酶 这类酶的分子量较小. 一般在2-4万道尔顿, 通常由2
9、-4个相同的亚基所组成。它们的作用底物为双链DNA, 极少数类酶也可作用于单链DNA, 或DNA/RNA杂种双链。这类酶的专一性强, 它不仅对酶切点邻近的两个碱基有严格要求, 而且对更远的碱基也有要求, 因此, 类酶既具有切割位点的专一性, 也具有识别位点的专一性, 一般在识别序列内切割。切割的方式有平切和交错切, 产生平末端的DNA片段或具有突出粘性末端的DNA片段(5或3粘性末端)。作用时需要Mg2+作辅助因子, 但不需要ATP和SAM。类酶与对应的甲基化酶在蛋白亚基上尚未发现有什么关系, 第一个被分离的类酶是Hind 。 a.识别位点：绝大多数的II型核酸内切限制酶，都能够识别由48个核
10、苷酸组成的特定的核苷酸序列。我们称这样的序列为核酸内切限制酶的识别序列。而II型限制酶就是从其识别序列内切割DNA分子的，因此识别序列又称为核酸内切限制酶的切割位点或靶序列。有些识别序列是连续的(如GATC)，有些识别序列则是间断的(如GANTC)，N是代表任意一种核苷酸碱基切割位点的一个共同特点是，它们具有双重旋转对称的结构形式，换言之，这些核苷酸对的顺序是呈回文结构。这段序列有两个基本的特征，第一是能够在中间划一个对称轴，两侧的序列两两对称互补配对，第二个特点是两条互补链的5到3的序列组成相同，即将一条链旋转1800，则两条链重叠。 b.切割类型 检验了非常大量的实验事例之后发现，由核酸内
11、切限制酶的作用所造成的DNA分子的切割类型，通常是属于下述两种独特的排列方式之一：（1）两条链上的断裂位置是交错地、但又是对称地围绕着一个对称轴排列，这种形式的断裂结果形成具有粘性末端的DNA片段；（2）两条链上的断裂位置是处在一个对称结构的中心，这样形式的断裂是形成具有平末端的DNA片段。 c.产生的末端特征：类限制性内切酶的切割产物有平末端和粘性末端(cohesive end)。 粘性末端是指DNA分子的两端具有彼此互补的一段突出的单链部分, 这一小段单链部分和同一分子的另一端或其它分子末端的单链部分如果互补的话，则能通过互补碱基之间的配对, 形成双链。并在DNA连接酶的作用下, 使同一D
12、NA分子的两端连接成环状,或使两个分子连成一大的线状分子。已知有两种不同类型的限制酶都可以产生粘性末端，但一种是形成具有3粘性末端，例如Pst I酶就是属于这种类型；另一种则是形成具有5粘性末端，例如EcoR I酶便是此种类型的一个代表。粘性末端能够通过互补碱基间的配对而重新环化起来， 平末端的DNA片段则不易于重新环化。 酶活性单位：1单位限制性内切酶（1 U）通常定义：在建议使用的Buffer及温度下，在20l（50l）反应体系中反应1小时，使1g入DNA完全消化所需的酶量.星活性（star ctivity）在非最适的反应条件下，酶的识别特异性降低，产生非特异性带，这种酶切特异性降低的现象
13、，称为星活性。所谓非最适的反应条件：过量酶、低盐浓度、过量甘油、高pH（8.0以上）、有机溶剂ex：酒精（EcoR I对酒精敏感）、SDS、苯酚、氯仿等。五.影响限制性核酸内切酶活性的因素 1、DNA样品的纯度： 蛋白质、苯酚、氯仿、乙醇、EDTA、SDS、NaCl等将影响DNA样品的纯度。 如果DNA样品难以纯化时，可以采取下列方法进行酶切： 加大酶的用量，1 mg DNA 用 10U 酶(但是不能超总体积1/10 加大反应总体积 延长反应时间 2、DNA样品的甲基化程度： 核酸内切限制酶是原核生物限制修饰体系的组成部分，因此识别序列中特定核苷酸的甲基化作用，便会强烈地影响酶的活性。 为避免
14、产生这样的问题，在基因克隆中使用的是失去甲基化酶的大肠杆菌菌株制备质粒DNA。 可以利用不同的限制性内切酶对甲基化敏感程度不同，研究不同条件下DNA的甲基化程度。 3、缓冲液性质： 标准缓冲液的组份包括：氯化镁、氯化纳或氯化钾、Tris-HCl,-巯基乙醇或二硫苏糖醇(DTT)以及牛血清白蛋白（BSA）等。酶活性的正常发挥，是绝对地需要二价的阳离子，通常是Mg2+。不正确的NaCl或Mg2+浓度，不仅会降低限制酶的活性，而且还可能导致识别序列特异性的改变。 缓冲液TrisHCl的作用在于使反应混合物的pH恒定在酶活性所要求的最佳数值的范围之内。对绝大多数限制酶来说，在pH=74的条件下，其功能
15、最佳。 巯基试剂对于保持某些核酸内切限制酶的稳定性是有用的，而且还可保护其免于失活。但它同样也可能有利于潜在污染杂质的稳定性。 有一部分核酸内切限制酶对于钠离子或钾离子浓度变化反应十分敏感，而另一部分核酸内切限制酶则可适应较广的离子强度的变化幅度。 4、酶切反应的温度 DNA酶切反应的温度，是影响核酸内切限制酶活性的另一个重要因素。不同的核酸内切限制酶，具有不同的最适反应温度，而且彼此之间有相当大的变动范围。大多数核酸内切限制酶的标准反应温度都是37。 但也有许多例外的情况，它们要求37以外的其它反应温度。其中有些核酸内切限制酶的最适反应温度低于标准的37，例如Sma I是25、Apa I是3
16、0。 有些核酸内切限制酶的最适反应温度则高于标准的37，例如Mae I是45、Bcl I是50、Mae lII是55；还有些核酸内切限制酶的最适反应温度可高达60以上。 消化反应的温度低于或高于最适温度，都会影响核酸内切限制酶的活性，甚至最终导致完全失活。酶切的方式：1、完全酶切：内切酶在DNA上的所有识别位点都被切开。2、不完全酶切：只有有限数量的酶切位点被切开，可以通过缩短保温时间、降低反应温度或减少酶的用量可达到局部消化的目的。第二节 连接酶（ligase)连接酶的作用机理与反应条件：1、作用机理：（1）ATP（NAD+)提供激活的AMP（2）ATP与连接酶形成共价“连接酶-AMP”复合
17、物，并释放出焦磷酸PPi。（3）AMP与连接酶的赖氨酸e-氨基相连。（4）AMP随后从连接酶的赖氨酸 -氨基转移到DNA一条链的5端P上，形成“DNA-腺苷酸”复合物。（5） 3-OH对磷原子作亲核攻击，形成磷酸二脂键，释放出AMP。2、反应条件（1）必须是两条双链DNA，如果为粘性末端，末端必须配对。（2）DNA的3端有游离的-OH，5端有一个磷酸基团（P）。（3）需要能量： 动物或噬菌体中：ATP 大肠杆菌中： NAD+连接酶的种类：T4-DNA连接酶、E.coli DNA连接酶、T4-RNA连接酶、连接酶的活性单位与定义：一般采用 Weiss 单位来衡量 T4 DNA 连接酶的活性。在
18、37 下 20 分钟催化 1 nmol 32p 从焦磷酸根置换到，,32PATP 所需的酶量，定义为 1 个 Weiss 单位。该定义方法基于 ATP 和焦磷酸的交换，是最常用的连接酶单位， 但该定义所展示的直观生物学意义不显著。 New England Biolabs 公司也提出了一种定义方式，通过粘性末端的连接效率来表示。即，在 20l 反应体系中于 16 ，使 Hind 切过的 DNA （300g/ml，0.12M 5 末端）在 30 分钟内连接 50% 所需的酶量为 1 个 NEB 单位。 1 NEB 单位等于 0.015 Weiss 单位， 1 Weiss 单位等于 67 NEB 单
19、位。影响连接酶效果的因素 1、酶切片段的状态： 粘性末端连接效率比平端至少大100倍 5突出粘性末端大于3突出粘性末端 不同的限制性内切酶片段连接效率不同，以Hind III最好。2、插入片段与载体的浓度比例： 一端与另一端的连接可认为是双分子反应，在标准条件下，其反应速度完全由互相匹配的末端的浓度决定。不论末端位于同一分子（分子内连接）还是位于不同分子（分子间连接），都是如此。现考虑一种简单的情况，即连接混合物中只含有一种，也就是用可产生粘端的单个限制酶切割制备的磷酸化载体。 如果反应中浓度低，则配对的两个末端为同一分子的机会较大（因为分子的一个末端找到同一分子的另一末端的概率要高于找到不同
20、分子的末端的概率）。 因此，在浓度低时，质粒重新环化将卓有成效。如果连接反应中浓度有所增高，则在分子内连接反应发生以前，某一个分子的末端碰到另一分子末端的可能性也有所增大。因此在浓度高时，连接反应的初产物将是质粒二聚体和更大一些的寡聚体。 进行克隆时，VectorDNA和InsertDNA的摩尔数比一般为1：210，增加插入片段与载体的接触机会，减少载体自我连接的现象。 3、反应温度： 37连接酶活性最高，但37时粘性末端DNA分子形成的配对极不稳定，故最佳12-16，最大限度地发挥连接酶的活性，又要有助于短暂配对结构的稳定。 4、反应液中的成分（特别针对平端连接）：由于很容易成为平端，所以这
21、是一个极为有用的酶学物性。有了这样的物性，才能使任何分子彼此相连。然而，相对而言，平端连接是低效反应，它要求以下个条件：）低浓度（0.5mmol/L）的ATP ）不存在亚精胺一类的多胺）极高浓度的连接酶（50Weiss单位ml） ）高浓度的平端。凝聚剂： 反应混合物中加入一些可促进大分子群聚作用并可导致分子凝聚成集体的物质，如聚乙二醇或氯化六氨全高钴,可以使如何取得适当浓度的平端的总是迎刃而解。在连接反应中，这些物质具有两作用：）它们可使平端的连接速率加大个数量级，因此可使连接反应在酶浓度不高的条件下进行。）它们可以改变连接产物的分布，分子内连接受到抑制，所形成的连接产物一律是分子间连接的产物
22、。第三节 DNA聚合酶（原理、用途）聚合酶的种类：1、依赖DNA的DNA聚合酶：大肠杆菌DNA聚合酶、Klenow fragment、T7 DNA聚合酶、T4 DNA聚合酶和修饰过的T7 DNA聚合酶 2、不依赖DNA的DNA聚合酶：末端转移酶 3、依赖RNA的DNA聚合酶：反转录酶 4、依赖DNA的RNA聚合酶：E.coli RNA聚合酶，phage SP6、T7和T3 RNA聚合酶 5、不依赖DNA的RNA聚合酶：polyA聚合酶 DNA聚合酶1、DNA聚合酶I：聚合酶活性：5 3，需要引物 外切酶：5 3 3 5校正功能应用：缺平移探针标记 2、Klenow fragment： 聚合酶活
23、性：5 3，需要引物 外切酶：3 5用途：A：末端标记法 B：合成cDNA的第二链C：随机引物（6nt）标记 D：末端终止法进行DNA序列分析 3、T4-DNA聚合酶 ： 聚合酶活性：5 3， 外切酶：3 5 外切酶活性较klenow片段的活性大200倍，对单链DNA的活性大于双链DNA。特点：当没有dNTP时，T4DNA聚合酶行使3 5外切酶功能，制造出3隐蔽端。如果只有一种dNTP，则降解到该dNTP的位置。用途：A、填补或标记限制酶切割DNA后产生的凹缺3B、末端标记带3突出末端的DNA：利用3 5外切酶活性作用于所有末端形式的3端（平端、3隐蔽端、5隐蔽端）制造出3隐蔽端，再利用它的5
24、 3聚合酶活性补平，并加入放射性标记的dNTPC、标记用作杂交探针的DNA片段D、将双链DNA的末端转化成平E：体外诱变 4、T7-DNA聚合酶:从T7噬菌体感染大肠杆菌细胞中纯化出来的，由两个亚基组成：（1）T7基因5编码的大亚基：有5 3聚合酶和3 5外切酶活性。（2）大肠杆菌编码的小亚基：硫氧还蛋白，增加大亚基对模板的亲和性 T7-DNA聚合酶的用途：A、用填补或交换（取代）反应快速进行末端标记；B、将双链DNA的末端转化成平末端；C、复制较长的模板进行引物延伸反应，在测序中读出较长的序列。 5、修饰的T7DNA聚合酶 通过修饰使3 5外切酶活性下降99%以上，但聚合能力不受影响，修饰后
25、的T7DNA聚合酶在聚合反应中有很高的持续性；进一步改进的基因工程生产的测序酶2.0，完全没有核酸外切酶花性。 用途：（1）DNA序列分析，可读出较长的序列，（2）标记DNA 3隐蔽末端和更有效地补平末端。6、末端转移酶：罕见的DNA聚合酶：从小牛胸腺中纯化出的碱性蛋白质，催化单链或双链DNA分子的3-OH末端添加一个至多个脱氧核苷酸的反应。用途：（1）在载体或cDNA上加换互补的同源多聚尾，以便连接。（2）标记DNA片段的3末端 。（3）快速扩增cDNA末端（RapidAmplificationofcDNAEnd简称为RACE）。7、反转录酶（依赖RNA的DNA聚合酶）（Reverse tr
26、anscriplase, RT）用途：合成cDNA。以oligo dT为引物（与mRNA的polyA尾巴互补结合）。四、RNA聚合酶：1、依赖DNA的RNA聚合酶 包括：E.coli RNA聚合酶，phage SP6、T7和T3RNA聚合酶 以DNA为模板，从启动子开始，经过延伸、终止，合成转录产物。 用途：A：合成单链RNA探针 B：体外翻译，基因表达分析 2、不依赖DNA的RNA聚合酶 ：多聚（A）聚合酶，ATP存在下，催化在单链RNA3末端加上AMP，任何RNA可作底物 。用途：A：在RNA末端加上多聚（A）尾，以合成cDNA； B：标记RNA的3端 。第四节 修饰酶修饰酶：主要为三类：
27、末端转移酶（在DNA聚合酶中已述），碱性磷酸酶，多核苷酸激酶多核苷酸激酶的用途：DNA5-OH端磷酸化、标记DNA的5端。碱性磷酸酶（alkaline phosphatase，AP） 种类：细菌性碱性磷酸酶、小牛肠碱性磷酸酶用途：A：载体5末端脱磷，防止载体自我环化。B：在RNA/DNA末端除去5磷酸，便于标记5末端 。 四 基因工程技术 凝胶电泳技术电泳（electroghoresis）：带电物质在电场中向相反电极移动的现象 。电泳技术：就是利用在电场的作用下，由于待分离样品中各种分子带电性质以及分子本身大小、形状等性质的差异，使带电分子产生不同的迁移速度，从而对样品进行分离、鉴定或提纯的技
28、术。电荷效应：分子筛效应：一个含有各种分子的样品溶液缓慢地流经凝胶色谱柱时，各分子在柱内同时进行着两种不同的运动：垂直向下的移动和无定向的扩散运动。大分子物质由于直径较大，不易进入凝胶颗粒的微孔，而只能分布颗粒之间，所以在洗脱时向下移动的速度较快。小分子物质除了可在凝胶颗粒间隙中扩散外，还可以进入凝胶颗粒的微孔中，即进入凝胶相内，在向下移动的过程中，从一个凝胶内扩散到颗粒间隙后再进入另一凝胶颗粒，如此不断地进入和扩散，小分子物质的下移速度落后于大分子物质，从而使样品中分子大的先流出色谱柱，中等分子的后流出，分子最小的最后流出，这种现象叫分子筛效应。电泳迁移率：是指在单位电场强度（1V/cm）时
29、带电分子的迁移速度。迁移率与带电分子所带净电荷成正比，与分子的大小和缓冲液的粘度成反比。影响凝胶电泳迁移率的因素 （1）样品的物理性质 1、分子大小 ：线状双链DNA分子长度（碱基对数目bp）的对数（log10）与迁移距离成反比，以此来测定DNA片段（线性双链）的分子量准确且方便。 当DNA分子大小超过20kb时，普通琼脂糖凝胶就很难将它们分开。此时电泳的迁移率不再依赖于分子大小，因此，就用琼脂糖凝胶电泳分离DNA时，分子大小不宜超过此值。2、分子的空间构型：即使分子量相同，构型不同，其迁移率也不同。 共价闭合环状DNA（covalently close circular DNA，ccc DN
30、A，超螺旋构型） lDNA（linear form，线型，质粒的两条链均断裂；线性分子）ocDNA（开环DNA，open circularDNA，ocDNA，它的双链中的一条保持完整的环状结构，另一条单链上有一到几个切口）。 但是由于琼脂糖浓度、电场强度、离子强度和溴化乙锭等的影响，会出现相反的情况。3、带电量：核酸分子是两性解离分子，pH3.5是碱基上的氨基解离，而三个磷酸基团中只有一个磷酸解离，所以分子带正电，在电场中向负极泳动；而pH8.0-8.3时，碱基几乎不解离，而磷酸基团解离，所以核酸分子带负电，在电场中向正极泳动。不同的核酸分子的电荷密度大致相同，因此对泳动速度影响不大。 4、碱基组成：对迁移率影响不明显，单链DNA形成发头结构，影响迁移率，单链（1kb）小于双链DNA（1kb）不同浓度琼脂糖凝胶的有效分离范围 DNA在聚丙烯酰胺凝胶中的有效分离范围 DNA电泳带糊的原因：1、DNA降解，应 避免核酸酶污染；2、电泳缓冲液陈旧 电泳缓冲液多次使用后，离子强度降低，pH值上升，缓冲能力减弱，从而影响电泳效果。建议经常更换电泳缓冲液； 3、所用电泳条件不合适 电泳时电压不应超过20V/cm，温度30；巨大DNA链电泳，温度应15；核查所用电泳缓冲液
