1、基因工程 复习总结总结第一章1. 简述基因操作、基因重组和基因工程的关系。基因操作: 对基因进行分离、分析、改造、检测、表达、重组和转移等操作的总称。基因工程:专指为实践应用而进行的基因重组事件，产生的基因工程体可以用作生物反应器，或改变了生物性状的工程体等。基因工程（基因操作）：主要是利用DNA 重组技术，将生物的某个基因或一个DNA片段通过基因载体（DNA载体）运送到另一生物的活性细胞中，然后经过克隆（clone）和行使正常功能（表达），从而创造生物新品种或新物种的遗传学分子技术（从细菌到高等生物）。2. 为什么说基因工程是生物学和遗传学发展的必然产物？（1）基因的提出与基因和DNA关系的
2、建立，为基因重组打下物质基础（2）DNA结构的阐明和DNA在生命活动中作用的认识，为基因操作打下了理论基础（3）基因操作技术的发展直接导致基因工程的诞生和发展（4）人们研究的热情和对基因工程产品的迫切需求，进一步推动了基因工程的快速发展3. 简述基因的结构组成对基因操作的影响。(1)基因及其产物的共线性 (2)基因及其产物的非共线性(3)基因的重叠与基因的可变性 (4)启动子和终止子4. 重组DNA技术包括哪些步骤分-分离制备目的基因切-切割目的基因和载体接-目的基因与载体连接转-将重组DNA导入宿主细胞筛-筛选并检定含有重组DNA分子的受体细胞克隆表-克隆基因在受体细胞中进行复制与表达5.
3、基因工程的流程目的基因的分离制备与载体体外重组遗传转化转化子筛选提取目的基因测序 获得优良品种 表达特定蛋白产物导入宿主细胞将目的基因克隆到表达载体6.基因工程中所用酶类及作用特点(1)限制性核酸内切酶：在DNA分子内部的特异性的碱基序列内部进行切割(2)DNA连接酶：将两条以上的线性DNA分子或片段催化形成磷酸二酯键连接成一个整体(3)DNA聚合酶I：通过向3端逐一增加核苷酸以填补双链DNA分子上的单链裂口，即53DNA聚合酶活性与35及53外切酶活性(4) Klenow DNA聚合酶:是从全酶中除去53外切活性的肽段后的大片段肽段，而聚合活性和35外切活性不受影响。(5)反转录酶:以RNA
4、或DNA链为模板合成互补的cDNA链(6)DNA末端转移酶:将寡聚物尾巴加到了线性双链或单链DNA分子的3OH末端或DNA的3末端(7)碱性磷酸酶:去除DNA,RNA,dNTP的5磷酸基团(8)降解酶S1:降解单链DNA或RNA,产生带5磷酸的单核苷酸或寡聚核苷酸，同时也可切割双链核酸分子的单链(9)Taq DNA 聚合酶：能在高温（72）下以单链DNA为模板，从53方向合成新的互补链。（10）多核苷酸激酶：催化将把一个磷酸分子加到多核苷酸链的5OH末端上（11）核酸外切酶III:降解DNA3OH末端的核苷酸残基（12）脱氧核糖核酸酶：内切核酸酶，水解单链或双链DNA7. 常用的目的基因的获取
5、方法 构建基因组文库；构建cDNA文库；人工合成DNA技术；PCR扩增8. 碱裂解法提取质粒原理高pH使质粒DNA和染色体DNA变性，同时沉淀蛋白质。再将pH值调至中性，质粒DNA较小，很容易复性成双链。而染色体DNA较大，不会复性，缠结成网状不溶物质，从而可以通过离心除去。9. 常用的目的基因与载体的连接方法（1）黏性末端连接：将靶基因DNA片段和载体DNA经过相同的限制酶进行切割，使他们两端产生相同的黏性末端，然后经黏性末端碱基配对和DNA连接酶的作用，共价连接成为新的重组DNA分子。（2）平头末端连接:将平末端的DNA分子在T4连接酶的作用下，催化DNA5磷酸基与3羟基之间形成磷酸二酯键
6、相互连接。（3）人工接头法：利用人工接头加在平端的DNA片段的两端，然后用相应的限制酶切割人工接头以产生黏性末端，再与带有相同黏性末端的载体进行连接。（4）同源多聚尾连接法：在末端脱氧核苷酸转移酶催化下，在线性载体分子的两端加上单一核苷酸如dG组成的多聚尾，而在目的基因的分子两端加上dC多聚尾，两者混合退火，然后经DNA聚合酶I或) Klenow DNA聚合酶填补裂口处缺失的核苷酸，再通过DNA连接酶修复成环状的双链DNA。第二章1. 什么是细菌的限制修饰系统，其功能是什么？细胞中存在位点特异性限制酶和特异性甲基化酶，即细胞中有限制修饰系统(R-MRestriction-modificatio
7、n system)。R-M系统是细菌安内御外的积极措施。限制作用就是限制酶降解外源DNA，维护宿主遗传稳定性的机制。甲基化是常见的修饰作用，可使腺嘌呤A 成为N6 甲基-腺膘呤，胞嘧啶C 成为5 甲基胞嘧啶。修饰作用是通过甲基化酶来的甲基化作用，是宿主细胞能识别自身遗传物质和外来遗传物质的机制。2. 说明限制性内切核酸酶命名原则（举例）。3. 限制内切核酸酶的星活性是指什么？星星活性（star activity）:在极端非标准条件下，限制酶能切割与识别序列相似的序列，这个改变的特殊性称星星活性。星星活性是限制性内切酶的一般性质，任何一种限制酶在极端非标准条件下都能切割非典型位点。4. T4 D
8、NA ligase 和E.coli ligase 有什么异同？同：(1)催化DNA5磷酸基与3羟基之间形成磷酸二酯键。(2)反应底物为粘端、切口、平端的RNA或DNA。(3)低浓度的聚乙二醇PEG（一般为10%）和单价阳离子（150-200 mM NaCl）可以提高平端连接速率。(4)连接反应需要ATP.若在16反应，大约需4小时；若在4反应，则需反应过夜。不同：E.coli ligase需NAD+参与，且其平端连接效率低，常用于置换合成法合成cDNA。作cDNA克隆时，不会将RNA连接到DNA，不连接RNA。5. 连接酶的反应温度如何选择，为什么？连接酶最适的反应温度应是37。但在这一温度下
9、粘性末端的氢键结合不稳定，温度过高，虽然酶反应速度快，但是连接-断开是双向的，动态平衡，可能由于热运动的关系，断开速度也快，温度过低，连接速度太慢。4度过夜也是有很高的连接效率。因此连接反应常采用的最佳温度一般在4-16间，通常多选用12-16 30分钟到16小时。6. 什么是Klenow酶？有什么作用？Klenow DNA聚合酶:是从全酶中除去53外切活性的肽段后的大片段肽段，而聚合活性和35外切活性不受影响。也称为Klenow片段（Klenow frgment），或E.coli DNA聚合酶大片段（E.coli DNA polymeraselargefragment）。Klenow DNA
10、聚合酶作用 补平3凹端，如果使用带标记的dNTP，则可对DNA进行末端标记。 抹平DNA3凸端在35外切活性 通过置换反应对DNA进行末端标记 在cDNA克隆中合成第二链 随机引物标记 在体外诱变中，用于从单链模板合成双链DNA7. 分子克隆的基本流程 8. 什么是限制性内切酶？可划为哪几个类型？识别序列有结构特点？限制性核酸内切酶是由细菌产生的一类能够特异性识别双链DNA的特定碱基序列，并且能在识别位点切割磷酸二酯键的核酸内切酶。限制酶的识别和切割位点序列的长度一般为4-8个碱基，最常见的为6个碱基，且具有回文序列的DNA片段，主要产生5、3突出的黏性末端或平末端。当一个样本DNA被一个特定
11、的限制酶切割后，可以产生一批相同的碱基序列的DNA片段，进而可以被用于基因重组、克隆、核酸分子杂交和序列分析等。10. 简述质粒的基本性质？（1）质粒的复制：质粒含有复制起始区和复制调控原件。可实现自主复制（2）质粒的拷贝数：质粒分为严谨性和松弛型，因而拷贝数不同（3）质粒的不相容性：两个质粒不能共存于同一个宿主细胞（4）质粒的转移性：通过细菌的接合作用，质粒可以被转移到新宿主细胞中11. DNA聚合酶有哪些种类？各有什么活性？大肠杆菌DNA聚合酶I: 5-3 DNA 聚合酶活性 5-3 DNA外切核酸酶活性 3-5 DNA外切酶活性Klenow酶:5-3 DNA 聚合酶活性 3-5 DNA外
12、切酶活性T4 DNA聚合酶:3-5DNA外切酶活性T7 DNA聚合酶:5-3 DNA 聚合酶活性 3-5 DNA外切酶活性（强）反转录酶:53 DNA聚合酶活性5-3 RNA外切核酸酶活性 3-5RNA外切酶活性12. 什么是重组子筛选？有哪些方法？重组DNA导入受体细胞后，检测目的基因是否表达的第一个步骤就是筛选。方法：（1）抗药性标记及其插入失活选择法 （2）-半乳糖苷酶显色反应选择法 第三章1. 作为一个最基本的载体，它必须具备哪些功能元件？ (1) 具有复制起点，可在宿主细胞中进行独立复制。(2) 具有抗菌素抗性基因，便于筛选。(3) 具若干限制酶单一识别位点，可以进行特异性酶切。(4
13、) 具有较小的分子量和较高的拷贝数，便于制备。2. 何为-互补，其基本原理是什么？在载体构建中有何作用？-互补（-complementation）：是指lacZ基因上缺失近操作子基因区段的突变体与带有完整的近操作子基因区段的-半乳糖苷酶基因的突变体之间实现互补。-互补是基于在两个不同的缺陷-半乳糖苷酶之间可实现功能互补而建立的。在lacZ 编码区上游插入一小段DNA 片段（如51 个碱基对的多克隆位点），不影响-半乳糖苷酶的功能内互补。若在该DNA 小片段中再插入一个大片段，导致产生无-互补能力的-半乳糖苷酶片段。利用这一互补性质，可用于筛选在载体上插入了外源片段的重组质粒。3. 蓝白斑筛选的
14、原理大肠杆菌的乳糖lac 操纵子中的lacZ 基因编码-半乳糖苷酶。lacZM15 基因是编码缺失了-半乳糖苷酶中第11-41 个氨基酸的lacZ 基因无酶学活性。对于只编码N-端140 个氨基酸的lacZ 基因（称为lacZ) ，其产物也没有酶学活性。这两个无酶学活性的产物混合在一起时，可恢复-半乳糖苷酶的活性，实现基因内互补。在lacZ 编码区上游插入一小段DNA 片段（如51 个碱基对的多克隆位点），不影响-半乳糖苷酶的功能内互补。若在该DNA 小片段中再插入一个大片段，导致产生无-互补能力的-半乳糖苷酶片段。利用这一互补性质，可用于筛选在载体上插入了外源片段的重组质粒。在相应的载体系统
15、中，lacZM15 放在F 质粒上,随宿主传代； lacZ 放在载体上, 作为筛选标记。4. 丝状噬菌体载体克隆中经常遇到哪些问题？(1)较大的外源DNA片段被克隆以后，在噬菌体扩增过程中往往不稳定，很容易发生缺失的现象，这可能是由于感染较短的噬菌体比长的噬菌体更具竞争优势所致。(2)单链载体分子感染的细胞中往往单双链混杂，纯化某种类型的分子(尤其是双链分子)比较费力，同时由于重组DNA容易产生缺失，培养时间不能长，故所得DNA的量有限。(3)重组中，经常出现一些能以两种可能方向插入的载体却仅以一种特定方向插入外源DNA片段的情况，这是因为外源DNA反向链的序列，在不同程度上干扰了载体基因间区
16、域的功能所致。5. 解释下列名词: 基因工程载体：将外源DNA或基因携带入宿主细胞(host cell)的工具.载体是基因工程技术的核心细菌的质粒、酵母的质粒、噬菌体、病毒DNA的衍生物等，经过改造都可以成为载体。插入失活：通过插入失活进行筛选的质粒主要有pBR322 ，该质粒具有四环素抗性基因（tetr）和氨苄青霉素抗性基因（ampr）两种抗性标记。当外源DNA 片段插入tetr 基因后，导致tetr 基tet tet 因失活，变成只对氨苄青霉素有抗性。这样就可通过对抗生素是双抗还是单抗来筛选是否有外源片段插入到载体中。琥珀突变：在基因的编码区中，若某个密码子发生突变后变成终止密码子，则称这
17、样的突变为赭石突变（突变为UAA），或琥珀突变（突变为UAG），或乳白突变（突变为UGA）。噬菌粒: 在质粒中插入丝状噬菌体的主要基因区域(1.3kb)，构成一种特殊的质粒载体，其基因区包括： a.噬菌体DNA合成起始和终止区。b.丝状噬菌体颗粒装配所需的序列c.带有E.coli的复制点(ori)，因此可像质粒一样扩增。6.简述M13KO7辅助噬菌体的遗传学特性和生物学功能？遗传学特性：基因II基因突变，由G变为T。突变的基因II产物减弱了与自身携带的噬菌体复制起点的作用。生物学功能：当与噬菌粒载体共同存在于宿主细胞时M13KO7表达后的基因产物优先作用于噬菌粒，使其进行单链复制。第四章1.
18、大容量克隆载体有哪些种类，各有何特点？黏粒载体（cosmid）；酵母人工染色体载体（YAC）；细菌人工染色体载体(BAC)； P1噬菌体载体(P1)；P1人工染色体载体(PAC)2. 简述黏粒、YAC、BAC克隆载体基本构成元件。黏粒：质粒复制起点（ColE1）、抗性标记（ampr）、cos位点。YAC：自主复制序列（autonomously replicating sequence， ARS）、用于有丝分裂和减数分裂功能的着丝粒（centromere, CEN）和两个端粒（TEL）。BAC：复制单元的特殊性:来自F质粒，包括严谨型控制的复制区oriS，启动DNA复制的由ATP驱动的解旋酶（R
19、epE）以及3个确保低拷贝质粒精确分配至子代细胞的基因座（parA、parB和parC）。低拷贝性可以减小外源基因的表达产物对宿主细胞的毒副作用。标记基因:氯霉素抗性基因3. 黏粒载体具有哪些优缺点？优（1）同时具有噬菌体和质粒载体的特性（2）具有高容量的克隆能力缺（1）两个粘粒之间，当存在同源序列时，可能会发生重组，结果使克隆的外源DNA片段重排或丢失。（2）含不同重组DNA的菌落生长速度不一。当柯斯质粒文库复制扩增时，由于不同的插入片段对宿主细胞作用的情况不同，结果会出现各种外源DNA片段间的比例失调。另外不同重组柯斯质粒的产量相差悬殊。（3）包装蛋白制备过程较复杂，每批包装蛋白的包装效率
20、不稳定。而且，购买包装蛋白的费用较高。5. 简述P1噬菌体载体的基本构成元件。 复制元件：质粒复制子和裂解性复制子 环化和包装信号：2个loxP重组位点和包装识别位点pac,用于体外包装 标记基因：kanr;果聚糖蔗糖酶基因sacB，含sacB的大肠杆菌在蔗糖培养基上不能存活，用于插入失活筛选重组子。 克隆位点： sacB内部 填充片段：11kb腺病毒，作为填充物弥补外源DNA片段长度。第五章1. 以大肠杆菌为例，表达载体比克隆载体多了哪些功能元件，各有什么生物学功能？ 启动子：转录是由RNA聚合酶在启动子部位启动RNA转录的过程。当转录启动以后，RNA聚合酶对启动子下游要转录的序列是无法识别
21、的，这就为利用强启动子来表达目的基因提供了可能。 终止子：转录会受到模板RNA序列结构的影响，当遇到颈环结构时转录便会停止，或遇到因子介导的终止信号转录也会停止。 核糖体结合位点： 细胞中的核糖体必须在mRNA上找到有效的核糖体结合位点（RBS）以及其中的Shine-Dalgarno序列（SD序列），从而启动邻近其下游的翻译起始密码子的蛋白质翻译。2. 简述表达载体构建的一般原则。表达载体实际上是在克隆载体的基础上增加了表达所需的元件，当外源基因被接入合适的位点后，在宿主中启动表达，因此表达载体的构建原则主要体现在表达元件的选择和利用。（1）启动子选择A.超量表达：以获得最大限度的目的产物，则
22、选择高强启动子，在适当条件下可使外源基因高水平表达，如大肠杆菌的Plac。B.使某关键基因表达：使宿主表现出一种特殊性或启动其他产物合成。可使用基因自身启动子或宿主相关性状基因的启动子。（2）转录有效性A.在载体上设法除去衰减序列或插入转录终止序列，以防止转录提前终止。B.在终止密码子之后增加终止序列，使转录确有效终止。（3）翻译的有效性A.选用最佳密码子AUG B.SD序列相似或相同 C.采用UAA终止密码子3. 何为穿梭载体，在遗传结构上有何特点？穿梭载体（shuttle vector）是能够在两类不同宿主中复制、增殖和选择的载体，如有些载体既能在原核细胞中复制又能在真核细胞中复制，或能在
23、E.coli中复制又能在革兰氏阳性细菌中复制。这类载体主要是质粒载体。大肠杆菌-酿酒酵母穿梭质粒载体，含有分别来自大肠杆菌和酿酒酵母的复制起点与选择标记，另有一个多克隆位点区。此类型的载体既可在大肠杆菌细胞和酿酒酵母细胞中复制，可实现在两种不同的寄主细胞之间来回转移基因，并单独或同时在两种宿主细胞中研究目的基因的表达活性及其它的调节功能。4. 将人的某个基因在大肠杆菌中表达应注意哪些问题？（1）序列为去掉内含子的cDNA序列（2）要用原核启动子。检查真核基因密码子偏好是否存在原核表达系统的稀有密码子。稀有密码子的地方会成为表达瓶颈，对其进行点突变。（3）若单独的蛋白无活性，考虑是否统一起到克服
24、分子伴侣的基因（4）控制表达条件，尽量不要形成包涵体5.利用原核细胞表达真核基因的难点在哪？（1）真核基因含有内含子序列，原核细胞中无法切除内含子，从而无法表达蛋白产物。（2）细菌的RNA聚合酶无法识别真核启动子。（3）表达出的真核蛋白产物易被细菌的蛋白酶降解。（4）在原核细胞中，真核基因所表达出的蛋白往往不能进行正常的折叠，而形成没有活性的包涵体。6.分离纯化RNA应注意什么？（1）由于RNA是单链，易受到核酸酶的攻击，应尽量避免RNA的降解。（2）尽量简化操作步骤，缩短时间。（3）防止机械剪切和高温对RNA的伤害，剪切和高温可能会导致降解。（4）维持pH410，防止核酸在碱性条件下降解。7
25、. 简述PET表达系统的特点及工作原理特点：表达载体pET-5a是典型的pET载体，含T7噬菌体启动子序列，当外源基因插入其下游的几个酶切位点后，就可在特定的宿主细胞中诱导表达。（1）T7噬菌体启动子只能由T7噬菌体的RNA聚合酶识别并启动转录，而大肠杆菌的RNA聚合酶不能作用于T7噬菌体启动子。（2）用于表达的宿主细胞必须能表达T7噬菌体的RNA聚合酶。（3）大肠杆菌BL21（DE3）是常用的pET表达载体的宿主菌，该菌对T7 RNA聚合酶和目的基因的转录实行多层次的调控。（4）控制外源基因严谨表达的2个系统A.通过宿主控制T7 RNA聚合酶的量来实现的在宿主细胞中引入一个带有T7噬菌体的溶
26、菌酶编码基因的质粒，它们表达T7噬菌体的溶菌酶。该溶菌酶可抑制T7 RNA聚合酶的活性，从而减少在未诱导情况下外源基因的表达。B.使启动子的控制效应更严谨。在pET载体上装载lac基因，提高阻抑物的浓度。也可利用T7-lac启动子。在当阻抑物结合在lacO位点时，即使存在T7 RNA聚合酶，外源基因也无法表达。只有当诱导物存在时，才能解开T7 RNA聚合酶基因和外源基因表达的双重阻遏。工作原理：pET载体进入大肠杆菌BL21（DE3）中后，由于宿主细胞的的lac I基因表达产生阻遏物，从而抑制T7 RNA聚合酶基因的表达，在载体上的目的基因也无法表达，当IPTG诱导物加入时，使阻遏物失去抑制作
27、用，T7 RNA聚合酶基因可以表达，从而启动T7启动子控制外源基因的表达。8.简述利用T7噬菌体启动子的表达系统的表达调控模式。（1）在表达载体上使用T7启动子，在宿主细胞中表达T7 RNA聚合酶，构成了表达系统。（2）T7启动子的转录活性和宿主T7 RNA聚合酶的转录活性均受IPTG的诱导、第八章1. 简述PCR扩增的原理和过程？如果要扩增某基因，需要知道什么信息?原理：利用生物体内DNA的半保留复制原理。在体外采用变性、退火、延伸过程，以含有目的片段的DNA为模板，根据目的基因序列设计引物，在DNA聚合酶作用下实现目的基因扩增。目的基因的基本信息：片段大小、序列和碱基特点等。据此来决定PC
28、R策略。如果是已知序列，可设计引物，直接从含有目的基因序列的DNA中扩增；知道部分序列的，先PCR获得该序列，再采用RACE或反向PCR等技术获得全长序列。过程：（1）变性（denaturation）：将模板DNA置于92-96，使dsDNA在高温下解链成为ssDNA，且热变性不改变其化学性质（2）退火（annealing）：将温度降至37-72，使引物与模板的互补区相结合（3）延伸（extension）：在72条件下，DNA聚合酶将dNTP连续加到引物的3-OH端，合成DNA。这三个热反应过程的重复称为一个循环，经过20-40个循环可扩增得到大量位于两条引物之间序列的DNA片段。2. T/A
29、克隆的基本原理是什么？Tap DNA聚合酶有末端转移酶的活性，可在DNA片段的3末端添加一个核苷酸，通常为A。因此，Tap DNA聚合酶扩增的产物可与T-载体进行黏端互补连接，达到高效克隆的目的。3. PCR技术有哪些应用？4. PCR引物有哪些基本要求？ 长度：至少16 bp，通常为18-30 bp，更短的引物一般会降低扩增的特异性，但会提高扩增的有效性。 解链温度（Tm值）：两个引物之间的Tm值差异最好在2-5。 避免引物内部或引物之间存在互补序列（3个碱基） GC含量尽量控制在40%-60%之间，4种碱基的分布应尽可能均匀。尽量避免嘌呤或嘧啶的连续排列，以及T在3末端的重复排列。 引物的
30、3末端最好是G或C，但不要GC连排。第九章1. 简述化学降解法测序的基本原理以及主要应用范围。原理：将待测DNA片段的5端磷酸基团作放射性标记，再分别采用不同的化学方法对特定碱基进行化学修饰并在该位置打断核酸链，从而产生一系列长度不一且分别以不同碱基结尾的DNA片段，这些以特定碱基结尾的片段群通过并列点样（lane-bylane）的方式用凝胶电泳进行分离，再经放射自显影，即可读出目的DNA的碱基序列。核心原理:特定化学试剂可对不同碱基进行特异性修饰并在被修饰的碱基处（5或3）打断磷酸二酯键，从而达到识别不同碱基种类的目的。应用: Maxam-Gilbert化学降解测序法不需要进行酶催化反应，因
31、此不会产生由于酶催化反应而带来的误差；对未经克隆的DNA片段可以直接测序。化学降解测序法特别适用于测定含有如5-甲基腺嘌呤、GC含量较高的DNA片段以及短链的寡核苷酸片段的序列。 测定长度大约250个碱基。2. 简述Sanger双脱氧链终止法测序的原理。双脱氧核苷酸分子的脱氧核糖的3位置的-OH缺失，致使下位核苷酸的5磷酸基团无法与之结合。一旦双脱氧核苷酸整合到正在合成的DNA链中，该股DNA的合成就到此终止。第十一章1. 基因组DNA文库有哪些类型？其相关的特点是什么？ 质粒文库质粒载体所容纳的外源DNA片段一般在10kb以内。这类基因组DNA文库一般应用于“鸟枪法”全基因组测序研究和用于构建亚克隆文库或亚基因组文库。 噬菌体文库噬菌体文库是以细菌噬菌体基因组衍生的一系列载体系统构建的，常用的有l噬菌体载体、M13单链噬菌体载体、P1噬菌体载体及由噬菌体衍生
