1、高中生物第四章生物化学与分子生物学技术实践第10课时分子生物学技术同步备课教学案苏教选修1第10课时分子生物学技术学习导航1.结合教材了解PCR技术的基本操作。2.理解PCR扩增DNA片段的原理。3.结合教材，尝试进行目的DNA片段的体外扩增。重难点击1.了解PCR技术的基本操作。2.理解PCR的原理。一、使用PCR仪的安全措施和PCR反应程序1.DNA分子的结构(1)写出各个标号的名称：胞嘧啶；腺嘌呤；鸟嘌呤；胸腺嘧啶；脱氧核糖；磷酸基团；胸腺嘧啶脱氧核苷酸；氢键；碱基对；一条脱氧核苷酸链。(2)DNA的两条链是反向平行的，为了明确表示DNA链的方向，通常将DNA的羟基末端称为3端，将磷酸基
2、团的末端称为5端，按此原则在图上方框内标出两条链的方向。答案左链上5端，下3端；右链上3端，下5端。2.细胞内DNA复制条件分析条件组分作用模板DNA的两条单链提供复制的模板原料四种脱氧核苷酸合成DNA子链的原料酶解旋酶打开DNA双螺旋DNA聚合酶催化合成DNA子链能量ATP为解螺旋和合成子链供能引物RNA为DNA聚合酶提供合成的3端起点3.PCR技术(1)概念：在体外快速扩增特定基因或DNA序列(目的DNA片段)的技术称为PCR技术。(2)物质条件：DNA模板、四种脱氧核苷酸、TaqDNA聚合酶、引物。(3)PCR反应的过程及结果PCR反应程序a.变性：在94 高温下，作为模板的双链DNA解
3、旋成为单链DNA。b.退火(复性)：反应体系的温度降至55 ，引物与作为模板的单链DNA上的特定部位相互配对。c.延伸：反应体系的温度回升到72 左右，按照单链DNA上的脱氧核苷酸序列，4种脱氧核苷酸根据碱基互补配对原则，在TaqDNA聚合酶的作用下连接到引物之后，使引物链延伸，形成互补的DNA双链。结果a.PCR扩增一般要经历三十多次循环，每次循环都包括变性、退火、延伸三步。b.两引物之间的固定长度的DNA序列呈指数扩增。1.PCR原理PCR反应与体内DNA复制的引物在化学本质上是否相同？请分析原因。答案不相同。体内DNA复制所需引物为RNA聚合酶合成的一小段RNA，但PCR反应时所用引物一
4、般是人工加入的一小段单链DNA。2.PCR反应过程(1)PCR反应中需要解旋酶和DNA聚合酶吗？若需要，则与细胞内DNA复制有何区别？答案PCR反应不需要解旋酶，但需要DNA聚合酶。由于PCR反应中需要高温使DNA解旋，因此PCR所需的DNA聚合酶能耐高温。(2)PCR的每次循环中应如何控制温度？请分析原因。答案每次循环中先高温解旋，再低温使引物与模板结合，最后适当升温有利于Taq DNA聚合酶发挥作用。(3)结合下图分析PCR过程中DNA复制的方向是怎样的？答案DNA的羟基(OH)末端为3端；磷酸基团的末端为5端。当引物与DNA母链通过碱基互补配对结合后，DNA聚合酶就能从引物的3端开始延伸
5、DNA链，DNA的合成方向总是从子链的5端向3端延伸。归纳总结PCR扩增与DNA复制的异同项目DNA复制PCR扩增不同点时期有丝分裂间期或减数第一次分裂的间期任何时期场所活细胞内细胞外酶解旋酶、DNA聚合酶耐高温的Taq DNA聚合酶引物有转录，产生RNA作引物，无需人工加入无转录，无引物产生，需人工加入两种DNA引物特点边解旋边复制先全部解旋后开始复制缓冲液不需缓冲液配制缓冲液代替细胞核液设备无控制温度变化的温控设备相同点原理严格遵循碱基互补配对原则引物都需要分别与两条模板链相结合的两种引物模板DNA的两条链为模板特点半保留复制原料游离的四种脱氧核苷酸1.下列关于DNA复制和PCR技术的描述
6、中，正确的是()A.DNA聚合酶不能从头开始合成DNA，只能从5端延伸DNA链B.DNA复制不需要引物C.引物与DNA母链通过碱基互补配对进行结合D.PCR扩增的对象是氨基酸序列答案C解析DNA聚合酶不能从头开始合成DNA，故DNA复制需要引物。DNA聚合酶只能从3端延伸DNA链，而不能从5端延伸DNA链。引物通过碱基互补配对原则与DNA母链相结合。PCR扩增的对象是DNA，不是氨基酸序列。2.PCR技术有效地解决了因为样品中DNA含量太低难以对样品进行研究的问题，而被广泛应用，与细胞内的DNA复制相比，PCR可以快速扩增所需的DNA片段，请分析回答下列有关问题：(1)体内DNA复制过程中用解
7、旋酶打开双链DNA，而PCR技术中的解旋原理是 。(2)此过程需要一种Taq DNA聚合酶。该酶是从 中分离的。(3)与普通DNA聚合酶相比，Taq DNA聚合酶具有的特性是 。(4)与体内DNA复制相比较，PCR反应要在 中才能进行，并且要严格控制 条件。(5)PCR中加入的引物有 种，加入引物的作用是 。答案(1)DNA的热变性原理(2)水生耐热细菌Taq(3)耐高温(4)一定的缓冲溶液温度(5)2作为DNA复制的起点解析(1)PCR技术中用高温使DNA分子中的氢键打开，从而解旋，其原理是DNA的热变性原理。(2)Taq DNA聚合酶是从水生耐热细菌Taq中提取的。(3)与普通DNA聚合酶
8、相比，Taq DNA聚合酶在90 以上的环境中不变性，具有耐高温的特性。(4)PCR反应需要适宜的温度和pH，因此PCR反应要在一定的缓冲溶液中进行，并需严格控制好温度条件。(5)PCR需要两种引物，引物的识别位点决定了PCR扩增的DNA片段。PCR中加入的引物一般是一小段单链DNA，作用是引导DNA复制，可以使游离的脱氧核苷酸与之结合形成磷酸二酯键，成为DNA复制的起点。一题多变细胞内的DNA复制需要适宜的温度和pH吗？若需要，是如何实现的？答案需要。细胞内的适宜温度和pH与内环境的稳态有关，低等生物与环境因素有关。易错提醒与PCR原理有关的三个易错点(1)酶的作用位点：解旋酶的作用是使DN
9、A两条链之间的氢键断开；DNA聚合酶与DNA连接酶的作用都是催化形成磷酸二酯键。不要误认为解旋酶也作用于磷酸二酯键。(2)DNA聚合酶和DNA连接酶：DNA聚合酶是将单个核苷酸连接到已有的单链片段的3端上，需要模板；而DNA连接酶连接的是两条DNA片段的缺口，不需要模板。(3)PCR中的解旋过程：PCR过程中不需要解旋酶，需要升高温度才能打开氢键，但此时的温度不会破坏磷酸二酯键，因此，DNA加热变性后变为单链，并未分解成单体。二、目的DNA片段的体外扩增与鉴定1.DNA片段的PCR扩增(1)准备器材：PCR仪、台式高速离心机、0.2 mL PCR微量离心管、自动取液器、模板DNA等。(2)在0
10、.2 mL PCR微量离心管中加入5 L 10倍浓缩的PCR缓冲液，4种脱氧核苷酸的溶液各5 L,1 L模板DNA,5 L引物1和5 L引物2,29 L双蒸水。(3)煮沸5 min之后冰浴2 min，低速离心，按照1单位/L加入TaqDNA聚合酶。(4)扩增DNA片段的反应程序：将微量离心管放入PCR仪中，盖上样品池盖。在94 的条件下预热5 min，再设置反应程序为：94 ，30 s55 ，30 s72 ，1 min(以上过程循环30次)。最后一次延伸条件为72 ，1 min。(5)按照PCR仪器操作要求运行反应程序。2.DNA分子的测定(1)配制二苯胺试剂：分别配制A液(1.5 g二苯胺溶
11、于100 mL 冰醋酸中，再加入1.5 mL浓硫酸，用棕色瓶保存)和B液(体积分数为0.2%的乙醛溶液)。将0.1 mL B液加入10 mL A液中，混匀。(2)条件：取一定量扩增前和扩增后的溶液分别放入等量的二苯胺试剂，混匀后观察颜色变化。用沸水浴加热上述溶液。(3)现象：出现蓝色现象。3.定量分析方法：如果需要进行定量分析，可以采用紫外分光光度法或琼脂糖凝胶电泳法。前者需要使用紫外分光光度计，后者需要使用电泳仪等。1.实验过程分析(1)离心的目的是什么？在离心的过程中，微量离心管的盖子为什么一定要盖严？答案离心的目的是使反应液集中在离心管底部，提高反应效率。微量离心管的盖子一定要盖严，防止
12、实验中脱落或液体外溢。(2)在离心前要用手轻轻弹击管的侧壁，目的是什么？答案离心前用手轻轻弹击管的侧壁目的是使反应液混合均匀。(3)PCR实验中使用的微量离心管、取液器、缓冲液以及蒸馏水等在使用前必须进行高压蒸汽灭菌，为什么这样操作？还有哪些操作与此目的相同？答案为避免外源DNA等的污染。在微量离心管中添加反应成分时，每吸取一种试剂后，取液器上的枪头都必须更换。2.结果检测(1)实验中为什么要测定DNA的含量？答案实际操作过程中会有许多因素影响DNA含量，所以需要对DNA含量进行测定。(2)如何判断DNA扩增成功？答案可以通过计算DNA含量来评价扩增的效果。电泳检测的方法，可以通过在紫外线下直
13、接观察DNA带的分布及粗细程度来评价扩增的效果。(3)PCR扩增过程可能会出现哪些异常结果？答案样品产物少，或产生新的DNA。3.进行PCR反应的具体实验操作顺序应为()设计好PCR仪的循环程序按配方准备好各组分用微量移液器向微量离心管中依次加入各组分进行PCR反应离心使反应液集中在离心管底部A. B.C. D.答案C 解析PCR反应的操作步骤一般分为准备(包括配制配方及将各配方放于实验台上)移液混合离心反应。PCR仪是一种自动控制温度的仪器，设计好循环程序就可以进行反应了。4.近20年来，PCR技术(多聚酶链式反应)成为分子生物学实验室的一种常规实验手段，其原理是利用DNA半保留复制，在试管
14、中进行DNA的人工复制(如图)，在短时间内，将DNA扩增几百万倍甚至几十亿倍，从而使实验室所需要的遗传物质不再受限于活的生物体。(1)加热使DNA双链间的 键完全打开，称为 ；而在细胞中是在 酶的作用下进行的。(2)如果只需要大量克隆模板DNA中间的某个特定区段，应该加入 种特定的引物。当温度降低至55 时，引物与两条“舒展”的模板链的特定位置结合，在DNA聚合酶的作用下，只能在引物的 端连接脱氧核苷酸，两条子链的延伸方向都是 。(3)PCR技术的必需条件，除了模板、原料、酶之外，至少还有三个条件，即液体环境、适宜的 和 ，前者由 自动调控，后者则靠 来维持。(4)通过PCR技术使DNA分子大
15、量复制，如果将一个用15N标记的DNA分子放入试管中，以14N标记的脱氧核苷酸为原料，连续复制四次之后，则15N标记的DNA分子占全部DNA分子总数的比例是 。问题导析(1)解旋是使DNA双链间的氢键断裂，PCR技术是利用DNA的热变性原理，细胞内是在解旋酶的作用下解旋。(2)DNA分子不论复制几次，含有15N标记的DNA分子都只有2个。答案(1)氢解旋解旋(2)两3从子链的5端向3端延伸(3)温度酸碱度PCR仪缓冲液(4)1/8解析(1)PCR技术利用热变性原理使DNA双链之间的氢键断裂，称为解旋，而在细胞内是在解旋酶的作用下使氢键断裂。(2)PCR分为三个基本反应步骤：变性(94 )、退火
16、(55 )、延伸(72 )，其特异性依赖于与靶序列互补的引物，引物是两段与待扩增DNA序列互补的片段，两引物之间的距离决定扩增片段的长度。由于DNA聚合酶不能从头开始合成DNA，只能从引物的3端延伸DNA链，则DNA的合成方向总是从子链的5端向3端延伸。(3)PCR技术与细胞内的DNA复制不完全相同，除了需要模板、原料、酶以外，至少还需要液体环境(稳定的缓冲溶液)，每一个步骤都需要适宜的温度和酸碱度等。(4)一个DNA分子连续复制四次之后，形成16个DNA分子，15N标记的DNA分子有2个，则15N标记的DNA分子占全部DNA分子总数的比例为1/8。1.PCR利用了DNA的哪种特性来控制DNA
17、的解聚与结合()A.特异性 B.稳定性C.热变性 D.多样性答案C2.符合PCR反应条件的一项是()稳定的缓冲液环境DNA模板合成引物四种脱氧核苷酸DNA聚合酶DNA解旋酶限制酶温控设备A. B.C. D.答案D解析PCR反应模拟了生物细胞内DNA复制的条件，只是无需解旋酶(可热变性)，也不需要基因工程的工具酶(限制酶)。3.下列关于PCR的描述中，正确的是()PCR是一种酶促反应引物决定了扩增的特异性扩增DNA利用了热变性的原理扩增的对象是氨基酸序列A. B.C. D.答案D解析PCR是一种体外迅速扩增DNA片段的技术，在高温条件下，把DNA的双链打开，缓慢冷却后，又重新结合，需要耐高温的D
18、NA聚合酶，同时，还需要引物，从引物的3端连接脱氧核苷酸。4.如图所示为PCR扩增的产物，请分析此产物是哪次循环的产物()A.第一次循环 B.第二次循环 C.第三次循环 D.第四次循环答案A解析在PCR反应中，以引物为标记，第一次循环时，以加入的DNA为模板，两条DNA链可分别由引物和引物与其结合并在DNA聚合酶的作用下延伸，所以形成的DNA中只有一种引物；从第二次循环开始，上次产生的DNA分子又可作为模板参与反应，所以会形成DNA分子两端均含引物的情况，如下图所示，因此题干中所出现的情况是第一次循环的产物。5.多聚酶链式反应(PCR)是一种体外迅速扩增DNA片段的技术。请回答下列问题：(1)
19、DNA的两条链是反向平行的，通常将 的末端称为5端，当引物与DNA母链通过碱基互补配对结合后，DNA聚合酶就能从引物的 开始延伸DNA链。(2)PCR利用了DNA的热变性原理解决了打开DNA双链的问题，但又导致了DNA聚合酶失活的新问题。到20世纪80年代，科学家从一种Taq细菌中分离到 ，它的发现和应用解决了上述问题。要将Taq细菌从其他普通的微生物中分离出来，所用的培养基叫 。(3)PCR的每次循环可以分为 三步。假设在PCR反应中，只有一个DNA片段作为模板，请计算在5次循环后，反应物中大约有 个这样的DNA片段。(4)简述PCR技术的主要应用： (要求至少答两项)。答案(1)磷酸基团3
20、端(2)耐高温的Taq DNA聚合酶选择培养基(3)变性、退火和延伸32(4)遗传疾病的诊断、刑侦破案、古生物学、基因克隆和DNA序列测定等解析一条脱氧核苷酸链一端是游离的羟基，另一端是游离的磷酸基团，含羟基的一端是3端，含磷酸基团的是5端。引物的5端与模板链的3端结合，然后沿着引物的3端延伸。耐高温的Taq DNA聚合酶的发现是实现PCR的关键，该酶可以利用选择培养基从一些微生物中分离出来。PCR一次循环要经历变性、退火和延伸三个阶段。课时作业学考达标1.PCR技术扩增DNA，需要的条件是()目的基因引物四种脱氧核苷酸DNA聚合酶等mRNA核糖体A. B.C. D.答案C解析PCR技术需要目
21、的基因作为扩增的模板，DNA聚合酶催化反应的进行，而引物是满足DNA聚合酶起作用的需要，四种脱氧核苷酸是该过程的原料，以及一定的缓冲溶液和能严格控制温度的温控设备。2.下列有关PCR反应的叙述，正确的是()A.PCR反应所需要的引物只是RNAB.PCR反应所需要的材料是核糖核苷酸C.PCR反应所需要的酶在60 会变性D.PCR反应需要在一定的缓冲溶液中进行答案D解析PCR反应需要的引物一般是DNA，反应所需要的材料是脱氧核苷酸，PCR所需要的酶是耐高温的，在60 不会变性。3.下列各项属于引物作用的是()A.打开DNA双链B.催化合成DNA子链C.使DNA聚合酶能够从引物的3端开始复制D.提供
22、模板答案C解析DNA分子的复制具有方向性，即只能从子链的5端3端方向进行复制。当引物与DNA母链结合后，DNA聚合酶就能从引物的3端开始延伸DNA链。4.PCR一般要经过三十多次循环，从第二轮循环开始，上一次循环的产物也作为模板参与反应，由引物延伸而成的DNA单链作模板时()A.仍与引物结合进行DNA子链的延伸B.与引物结合进行DNA子链的延伸C.同时与引物和引物结合进行子链的延伸D.无需与引物结合，在酶的作用下从头合成子链答案B解析当由引物延伸而成的DNA单链作模板时，此单链引物固定端为5端，因此与它互补的子链应从另一端开始合成，即与引物结合延伸DNA子链。5.PCR仪实质上是一台自动调控温
23、度的仪器，它调控不同温度的目的是()94 ，使DNA分子变性，磷酸二酯键断开94 ，使DNA分子变性，解开螺旋55 时，使DNA分子开始复制、延伸55 时，引物与DNA单链结合72 时，使DNA分子开始复制、延伸72 ，使DNA分子恢复双螺旋结构，恢复活性A. B. C. D.答案C解析PCR利用了DNA的热变性原理，通过控制温度来控制双链的解聚与结合。PCR仪实质上是一台能够自动调控温度的仪器。当温度上升至94 时，DNA分子变性，解开双螺旋结构；温度下降到55 时，引物与DNA单链结合，恢复活性；温度上升至72 时，DNA分子开始复制、延伸，根据碱基互补配对原则合成新的DNA链。6.下列有
24、关PCR过程的叙述中，不正确的是()A.在PCR的变性过程中破坏的是DNA分子内碱基对之间的氢键，DNA在人体细胞内复制时可利用解旋酶实现B.退火过程中引物与DNA模板链的结合是依据碱基互补配对原则完成的C.延伸过程中需要耐高温的DNA聚合酶、ATP、四种核糖核苷酸D.PCR与细胞内DNA复制相比所需要酶的最适温度较高答案C解析变性是为了使DNA内部的氢键断裂，双螺旋打开，DNA在人体细胞内复制时借助解旋酶来实现；根据碱基互补配对原则，引物可与 DNA模板链结合；延伸是形成新的DNA分子，需要以四种脱氧核苷酸为原料；PCR过程所需温度较高，会导致一般的DNA聚合酶失活，需特定的耐高温的DNA聚
25、合酶。高考提能7.有关下列操作过程的叙述，错误的是()A.PCR实验中使用的微量离心管、取液器、缓冲液以及蒸馏水等在使用前必须进行高压灭菌B.PCR所用的缓冲液和酶应分装成小份，并在20 储存C.PCR所用的缓冲液和酶从冰箱拿出之后，迅速融化D.在微量离心管中添加反应成分时，每吸取一种试剂后，取液器上的枪头都必须更换答案C解析在冰箱中放置的缓冲液和酶从冰箱中取出后应放在冰块上缓慢融化，而不能迅速融化，即C项错误。8.“X基因”是DNA分子上一个有遗传效应的片段，若要用PCR技术特异性地拷贝“X基因”，需在PCR反应中加入两种引物(注：引物的作用是与模板链形成双链后在DNA聚合酶的作用下可以继续
26、链的延伸)，两种引物及其与模板链的结合位置如图甲所示。经4轮循环后产物中有五种不同的DNA分子，如下图乙所示，其中第种DNA分子有几个()A.8 B.6 C.4 D.2答案A解析由图分析可知：X基因第一次复制得到两个两种DNA分子：和；X基因第二次复制得到四个四种DNA分子：复制得和、复制得和；X基因第三次复制得到八个五种DNA分子：复制得和、复制得和、复制得和、复制得和；X基因第四次复制得到16个五种DNA分子：复制得和、复制得和、两个复制得两个和两个、两个复制得两个和两个、两个得到4个。从上面的推测可知，第四轮循环产物中有8个。9.在PCR扩增DNA的实验中，预计一个DNA分子经过30次循
27、环后，应该得到230个DNA分子，但是结果只有约210个DNA分子，那么出现该现象的原因不可能是()A.Taq DNA聚合酶的活力不够，或活性受到抑制B.系统设计欠妥C.循环次数不够D.引物不能与母链结合答案D解析如果Taq DNA聚合酶活力不够，或活性受到抑制，则导致催化效率降低，得到的产物比预期的少，A项正确；如果PCR系统设计欠妥，则达不到预期的结果，B项正确；如果循环次数过少，产物的量比预期的少，C项正确；如果引物设计不合理，若不能与模板DNA结合，将造成无法进行扩增，而结果得到了210个DNA分子，D项错误。10.有关PCR技术的说法，下列叙述不正确的是()A.多聚酶链式反应，是一种
28、体外迅速扩增DNA片段的技术B.在用PCR技术扩增DNA时，DNA的复制过程与细胞内DNA的复制类似C.PCR反应只需在一定的缓冲溶液中提供DNA模板以及四种脱氧核苷酸D.PCR一般经历三十多次循环，每次循环分为变性、退火和延伸答案C解析PCR是多聚酶链式反应的英文缩写，是一种体外迅速扩增DNA片段的技术。在用PCR技术扩增DNA时，DNA的复制过程与细胞内DNA的复制类似，也需要提供模板(母链)、酶、原料、引物等条件。PCR一般要经历三十多次循环，每次循环可分为变性、退火和延伸三步。11.PCR(多聚酶链式反应)技术是一项在生物体外复制特定的DNA片段的核酸合成技术，下图表示合成过程，请据图
29、分析回答下面的问题。 (1)A过程高温使DNA变性解旋，对该过程的原理叙述正确的是 。A.该过程用到耐高温的解旋酶破坏氢键B.该过程用到限制酶破坏磷酸二酯键C.该过程不需要解旋酶的作用D.该过程与人体细胞的过程完全相同(2)C过程要用到的酶是耐高温的 。这种酶在高温下仍保持活性，因此在PCR扩增时可以 加入， (填“需要”或“不需要”)再添加。PCR反应除提供酶外，还需要满足的基本条件有： 。(3)如果把模板DNA的两条链用15N标记，游离的脱氧核苷酸不做标记，控制“94 55 72 ”温度循环3次，则在形成的子代DNA中含有15N标记的DNA占 。答案(1)C(2)DNA聚合酶一次不需要DNA模板、两种引物、四种脱氧核苷酸，通过控制温度和酸碱度使DNA复制在体外反复进行(3)25%解析(1)高温所起的作用类似于解旋酶，使双链DNA变为单链。(2)C过程是PCR技术的延伸阶段，当系统温度上升到72 左右，溶液中的四种脱氧核苷酸在耐高温的DNA聚合酶的作用下合成新的DNA链。这种DNA聚合酶在高温下不变性，所以一次性加入即可。(3)PCR技术遵循半保留复制的特点。经过三次循环，共产生8个DNA分子，其中有2个DNA分子含有15N标记。12.PCR是一种体外快速扩增DNA的方法，用于放大特定的DNA片段，数小时内可使目的基因片段扩增到数百万个。PCR需要模板
