1、遗传学实验 用GUS基因表达观察启动子功能用GUS 基因表达观察启动子功能摘要 通过GUS 基因表达染色程度判定启动子关键序列。1. 引言在真核生物中，主要通过顺式调控元件启动子和反式作用因子转录因子的相互作用，对基因表达进行调控。启动子的功能可以利用报告基因进行检测。报告基因GUS 基因存在于E.coli 等一些细菌基因组内，编码-葡萄糖苷酸酶。-葡萄糖苷酸酶是一个水解酶，以-葡萄糖苷酸酯类物质为底物，其反应产物可用多种方法检测出来。由于绝大多数植物没有检测到葡萄糖苷酸酶的背景活性，因此这个基因被广泛应用于植物基因调控的研究中。科研工作中发现，盐芥液泡焦磷酸酶基因启动子（TsVP1）在除了种
2、子以外的所有组织中都有活性，它的活性在根和叶中能被盐诱导，尤其在根尖中。为了研究启动子的关键序列，构建了盐芥液泡焦磷酸酶基因启动子（TsVP1）不同长度启动区控制的-葡萄糖苷酸酶（GUS ）载体pCAMBIA1391z （PTsVP:GUS），转染拟南芥，获得转基因拟南芥PT1，PA1和P7。发现PT1，PA1和P7具有不同的GUS 活性及盐诱导活性。表明启动区长度对启动子功能有影响，由此推测启动子的关键序列及诱导特点。2. 实验材料2.1实验材料 2.1.1材料拟南芥种子PT1、PT2、PT7、PT82.1.1试剂配制MS 培养基所需的母液，琼脂，蔗糖，1 mol/L的NaOH 溶液，70乙
3、醇，无菌水， 10次氯酸钠，琼脂粉，NaCl ，1mol/L GUS染色液。2.1.1器具量筒，移液枪，烧杯，天平，玻璃棒，滴管，pH 计，500 mL锥形瓶，高压蒸汽灭菌锅，培养皿，EP 管，人工培养箱，吸管，吸水纸。2.2实验方法 2.2.1配制MS 培养基MS 培养基：Murashige 和Skoog 于1962年为烟草细胞培养设计的，其特点是无机盐和离子浓度较高，是较稳定的离子平衡溶液，它的硝酸盐含量高，其养分的数量和比例合适，能满足植物细胞的营养和生理需要, 因而适用范围比较广，多数植物组织培养快速繁殖用它作为培养基的基本培养基。MS 培养基组成： 配制母液的优点是：1、避免每次配制
4、培养基都要对几十种成分进行称量。2、减少了称量微量元素造成的误差。配制MS 培养基：（1）用量筒和移液枪从各种母液中分别取出所需的用量：母液（大量元素 20）为10 mL，母液（微量元素 200）、（铁盐 200）、（有机成分 200）各1mL ，加入烧杯中，再加入蔗糖6g ，加蒸馏水至175mL 左右。（2）用滴管吸取物质的量浓度为1 mol/L的NaOH 溶液，逐滴滴入溶化的培养基中，边滴边搅拌，并随时用pH 计测培养液的pH ，一直到pH 为5.8为止(培养基的pH 必须严格控制在5.8 。（3）在大量筒中定容至200mL ，倒入锥形瓶，加入1.6g 琼脂粉。（4）同样的方法配制200m
5、L 含盐的培养基，在第（1）步中加入2.34g NaCl。 （5）称0.005g 左右的琼脂粉与10mL 蒸馏水混合，配成0.05%琼脂液。 （6）高压灭菌第一，码放锥形瓶。将装有培养基的锥形瓶直立于金属小筐中，再放入高压蒸气灭菌锅内。第二，放置其他需要灭菌的物品。将其他需要灭菌的物品也放入高压蒸气灭菌锅内，如用牛皮纸包裹的培养皿、枪头、无菌水、琼脂液等。第三，灭菌。待需要灭菌的物品码放完毕，盖上锅盖。在98 kPa、121.3 下，灭菌20 min。第四，灭菌后取出锥形瓶，让其中的培养基自然冷却凝固，或立即倒平板。2.2.2培养拟南芥幼苗（1）培养皿分装培养基将锥形瓶中的培养基加热融化，在超
6、净工作台上将其趁热倒入四个培养皿，令其自然冷却凝固。（2）种子灭菌种子在EP 管内经体积分数70乙醇漂洗l min ，无菌水洗l 次，等量无菌水和10次氯酸钠混合浸洗10 min ，无菌水洗5遍，最后加入质量分数005的琼脂液悬浮，分别均 匀撒于平板上。（3）适宜环境培养培养条件：在人工气候室培养，调节温度20，湿度75%,光照300mol/s m 2，光周期 16h 光照/8h黑暗 （4）盐处理将MS 培养基上培养一周多的植株取10株左右转移到含有200mmol L -1NaCl 的培养基上 相同条件下培养16小时，剩下一半原条件继续培养。3. 结果 PT1染色深于PT2，说明PT1中启动子
7、多于PT2的序列能增强GUS 基因的表达。而PT2的小叶未被染色，说明PT2缺失的部分基因可能与GUS 基因在小叶中的表达有关。 PT7染色与PT2相似，说明PT7相对PT2缺失的启动子序列对于GUS 基因表达作用效果影响相对较小。但是PT7中小叶染色，因此说明在所缺失中的启动子序列中存在调控GUS 基因在小叶中表达的序列，同时根据PT2与PT1的对比，说明PT2相对PT1中缺失的序列与PT7相对PT2缺失的序列共同影响GUS 基因在小叶中的表达。 PT8相对PT7染色较浅，说明PT8相对PT7缺失的序列对GUS 表达有增强作用。而PT8中根基本无染色，说明缺失部分序列对GUS 基因表达影响较大。PT2 经盐处理后， 染色明显加深， 而且小叶中也出现轻微染色， 说明盐处理能促进 GUS 基因的表达。 P T7 经 过盐处理后，染色也出 显的加深，说明 GUS 基 启动子仍然活性较强。 现明 因的 PT8 经盐处理后，染色稍加深，但对比不明显，说明 PT8 上存留的启动子 序列对 GUS 基因表达的作用已经不是很强烈了。 4.讨论 4.讨论 经结果讨论推断，启动子关键序列有可能存在与 PT7 与 PT8 序列之间，但是由于 7、8 号拟南芥染色差别不明显，因此，不能十分确定，也有可能关键序列在 PT8 剩余的序列内， 如需确定，还应经过进一步实验确定。
