1、基因工程复习重点绪 论 基因克隆所需的工具酶 一、限制性内切酶1限制性核酸内切酶:是一类能够识别双链DNA分子中的某种特定核苷酸序列， 并由此切割DNA双链结构的核酸内切酶。它们主要是从原核生物中分离纯化出来的。限制作用：是指一定类型的细菌可以通过限制性酶的作用，破坏入侵的外源DNA(如噬菌体DNA等)，使得外源DNA对生物细胞的入侵受到限制修饰作用：生物细胞(如宿主)自身的DNA分子合成后，通过修饰酶的作用：在碱基中特定的位置上发生了甲基化而得到了修饰，可免遭自身限制性酶的破坏。2核酸内切限制酶的类型 ：I型、II型、III型4.型核酸限制性内切酶的基本特性：a. 在DNA分子双链的特异性识
2、别序列部位，切割DNA分子产生链的断裂；b. 2个单链断裂部位在DNA分子上的分布，通常不是彼此直接相对的；c.? 因此，断裂的结果形成的DNA片段，也往往具有互补的单链延伸末端。一、识别位点：绝大多数的II型核酸内切限制酶，都能够识别由48个核苷酸组成的特定的核苷酸序列。我们称这样的序列为核酸内切限制酶的识别序列。切割位点都具有相同的双重旋转对称的结构形式（回文结构）。二、切割类型：（1）两条链上的断裂位置是交错地、但又是对称地围绕着一个对称轴排列，这种形式的断裂结果形成具有粘性末端的DNA片段；（2）两条链上的断裂位置是处在一个对称结构的中心，这样形式的断裂是形成具有平末端的DNA片段。三
3、、产生的末端特征：1、粘性末端：是指DNA分子在限制酶的作用之下形成的具有互补碱基的单链延伸末端结构，它们能够通过互补碱基间的配对而重新环化起来。（平末端的DNA片段则不易于重新环化。）2、同裂酶：有一些来源不同的限制酶识别的是同样的核苷酸靶序列，这类酶特称为同裂酶。3、同尾酶：与同裂酶对应的一类限制性内切酶,它们虽然来源不同，识别的靶序列也各不相同,但都能产生相同的粘性末端,特称为同尾酶。4、由一对同尾酶分别产生的粘性末端共价结合形成的位点，特称之为“杂种位点”。四影响核酸内切限制酶活性的因素：(1) DNA的纯度。提高核酸内切酶对低纯度DNA的反应效率，一般采用如下三种方法： 增加核酸内切
4、限制酶的用量，平均每微克底物DNA可高达10单位甚至更多些。 扩大酶催化反应的体积，以使潜在的抑制因素被相应地稀释。 延长酶催化反应的保温时间。(2) DNA的甲基化程度：核酸内切限制酶是原核生物限制修饰体系的组成部分，因此识别序列中特定核苷酸的甲基化作用，便会强烈地影响酶的活性。为避免产生这样的问题，在基因克隆中使用的是失去甲基化酶的大肠杆菌菌株制备质粒DNA。 (3) 酶切消化反应的温度：大多数核酸内切限制酶的标准反应温度都是37。消化反应的温度低于或高于最适温度，都会影响核酸内切限制酶的活性，甚至最终导致完全失活。(4) DNA的分子结构(5) 核酸内切限制酶的缓冲液：核酸内切酶的标准缓
5、冲液的组份包括：氯化镁、氯化纳或氯化钾、Tris-HCl,?-巯基乙醇或二硫苏糖醇(DTT)以及牛血清白蛋白（BSA）等。酶活性的正常发挥，是绝对地需要二价的阳离子，通常是Mg2+。pH=74时，最佳1、星号活性：EcoRI限制酶的这种特殊的识别能力，通常叫做星号活性，以EcoRI*表示。 二DNA连接酶1、种类：、T4噬菌体DNA连接酶：可连接 1，两个带有互补粘性末端的双链DNA分子 2，两个带有平末端的DNA双链DNA分子 3，一条链带有切口的DNA分子 4，RNA：DNA杂合体中RNA链上的切口，也可将RNA末端与DNA链连，底物广泛。、大肠杆菌DNA连接酶 1.底物是一条链带有切口的
6、双链DNA分子 2.具有同源互补粘性末端的不同DNA片段 3.几乎不能催化两个平末端的不同DNA片段 4.底物要求严格，假阳性背景底4、携带特殊的遗传标记6、受体细胞应具备的条件：限制性缺陷型、重组整合缺陷型、具有较高的转化效率、具有与载体选择标记互补的表型、感染寄生缺陷型三、DNA聚合酶1、DNA聚合酶I是一个多功能酶，它包括三种不同的酶活力： (1) 5-3，聚合酶活性： 催化单核苷酸结合到DNA模板的3，一OH末端，以ssDNA作模板，沿引物的3，一OH方向按模板顺序从5，一3延伸。 (2) 5， - 3，外切酶活性：Eco1i DNA 聚合酶1也能从游离的5，末端降解dsDNA成为单核
7、苷酸。 (3) 3，- 5，外切酶活性：DNA聚合酶I还能从游离的3，OH末端降解dsDNA或ssDNA成为单核苷酸。 缺口转移：指在DNA分子的单链缺口上，DNA聚合酶I的5-3，核酸外切酶活性和聚合作用可以同时发生。当外切酶活性从缺口的5，一侧移去一个核苷酸之后，聚合作用就会在缺口的3，一侧补上一个新的核苷酸。但由于PolI不能够在3，OH和5，P之间形成一个键，因此随着反应的进行，5，一侧的核苷酸不断地被移去，3，一侧的核苷酸又按序地增补，于是缺口便沿着DNA分子按合成的方向移动。这种移动特称为缺口转移。2 Klenow片段Klenow聚合酶的主要用途：标记DNA末端。 ）修补经限制酶消
8、化的DNA所形成的3隐蔽末端； ）?标记DNA片段的末端；3. T4DNA聚合酶T4DNA聚合酶，是从T4噬菌体感染的大肠杆菌培养物中纯化出来的一种特殊的DNA聚合酶。具有两种酶催活性，即5，-3，的聚合酶活性和3，-5，的核酸外切酶活性。4.TaqDNA 聚合酶 从极度嗜热菌提出。具有5 3聚合酶活性和3 5外切酶活性。主要用于PCR扩增。四、 逆转录酶1、又称RNA依赖的DNA聚合酶。这是一种有效的转录RNA成为DNA的酶。产物DNA又称cDNA 2、逆转录酶的主要用途是转录mRNA成为cDNA制备基因片段。另外，它也可用ssDNA或RNA做模板制作制备，杂交探针。3、逆转录酶的酶活性：(
9、1) RNA依赖的DNA聚合酶 以RNA链为模板， 以带3，一OH末端的DNA片段为引物，沿5，-3，方向合成DNA链。(2) DNA依赖的DNA聚合酶 以ssDNA为模板，以带有3一OH末端的DNA片段为引物，从5-3方向合成DNA链。(3)外切RNA酶活性 底物是RNADNA杂交分子中的RNA链，有两种活性形式。从RNA链5末端外切的称5-3外切RNA酶，从RNA链3末端外切的称3，-5，外切RNA酶H。 第三章 基因克隆载体 1、载体：指携带外源基因进入受体细胞的这种工具。（载体的本质是DNA）2、基因工程中所用的载体：(1)? 质粒(Plasmid)，主要指人工构建的质粒。(2)噬菌体
10、且的衍生物。(3)cosmid(柯斯质粒)。(4)单链DNA噬菌体M13。（5） 动物病毒。 3、作为基因工程用的载体，以下三方面是它们共有的特性和基本要求： (1)在宿主细胞中能独立自主的复制，即本身是复制子。 (2)容易从宿主细胞中分离纯化。 (3)载体DNA分子中有一段不影响它们扩增的非必需区域，插在其中的外源基因可以象载体的正常组分一样进行复制和扩增。 一、质粒载体1、质粒：是染色体以外能自主复制的双链闭合环状DNA分子，它广泛存在于细菌细胞中。在霉菌、蓝藻、酵母和不少动植物细胞中也发现有质粒存在。 5、在没有选择压力的情况下，两种亲缘关系密切的不同质粒，不能在同一宿主细胞中稳定地共存
11、，这一现象称为质粒的不亲和性，也称不相容性。6、质粒载体的基本条件(1) 能自主复制，即本身是复制子(2) 具有一种或多种限制酶的单一切割位点，并在此位点中插入外源基因片段，不影响本身的复制功能； (3) 在基因组中有12个筛选标记，为寄主细胞提供易于检测的表型特征。(4) 分子量要小，多拷贝，易于操作。7、载体的功能：运送外源基因高效转入受体细胞、为外源基因提供复制能力或整合能力、为外源基因的扩增或表达提供必要的条件8、载体应具备的条件（共有特性）：(1) 在宿主细胞中能独立和稳定的自我复制，即本身是复制子。(2) 具有合适的限制性内切酶位点。(3) 具有合适的选择标记基因，来筛选重组体DN
12、A9、质粒：是生物细胞内固有的、能独立于寄主染色体而自主复制、并被稳定遗传的一类核酸分子。（质粒常见于原核细菌和真菌中，绝大多数的质粒是DNA型的）绝大多数的天然DNA质粒具有共价、封闭、环状的分子结构，质粒能利用寄主细胞的DNA复制系统进行自主复制，10、根据在每个细胞中的分子数（拷贝数）多寡，质粒可分为：严紧型松弛型复制控制的质粒 、松弛型复制控制的质粒11、质粒的基本特性：1、质粒的自主复制性2、质粒的不相容性3、质粒的可转移性12、革兰氏阴性菌的质粒可分成两大类：接合型质粒（能在天然条件下自发地从一个细胞转移到另一个细胞结合作用）、非接合型质粒 （不能在天然条件下独立地发生接合作用）
13、13、实验室一般使用下列三种方法制备质粒DNA： 1、氯化铯密度梯度离心法 2、沸水浴法 3、碱溶法 14、按照基因组的结构，可将动植物病毒分成四大类：单链DNA病毒、双链DNA病毒、单链RNA病毒、双链RNA病毒15、考斯质粒：是一类人工构建的含有l-DNA cos序列和质粒复制子的特殊类型的载体。16、考斯质粒载体的特点：*能像l-DNA那样进行体外包装，并高效转染受体细胞 *能像质粒那样在受体细胞中自主复制*重组操作简便，筛选容易*装载量大（45 kb）且克隆片段具有一定的大小范围*不能体内包装，不裂解受体细胞二、各种基因工程受体第四章 目的基因的分离克隆一、目的基因的获取：化学合成法、
14、cDNA文库、基因组DNA文库、聚合酶链式反应二、基因克隆，主要包括以下几个过程：1.DNA片段的分离、纯化，即目的基因的制备；2.外源DNA片段与载体DNA分子的体外连接；3.人工构建的重组体向寄主细胞内的转移；4.重组克隆的筛选和鉴定。 三、化学法合成目的基因 适用于已知核苷酸序列的、分子量较小的目的基因的制备1、聚合酶链式反应（PCR)：是利用单链寡核苷酸引物对特异DNA片段进行体外快速扩增的一种方法。2、PCR基本技术的三步：（1）变性：即双链DNA在94下通过热变性使其双链间氢键断裂而解离成单链。（2）退火：即当变性温度突然降至引物Tm值以下时，引物与模板DNA互补序列杂交。（3）延
15、伸：即在DNA聚合酶、4种脱氧核糖核苷酸、底物及Mg2+存在的条件下，DNA聚合酶依赖其5， 3，的聚合酶活力，以引物为起始，互补的DNA链为模板，使引物序列得以延伸，形成模板DNA的互补链。PCR产物的大小则取决于两引物退火位点5端之间的距离。3、PCR反应体系：（1） DNA模板（2）引物(3)脱氧核苷三磷酸(4). 耐热性聚合酶4、设计引物时应注意以下几个因素：（1）应选择在进化过程中可能保守的区域及不被内含子间隔的区域(如进行目的基因的cDNA克隆时)；（2）应选择密码子简并少的氨基酸序列，如选择只有一个密码子的色氨酸而非6个密码子的丝氨酸；5、PCR反应条件的选择：（1）变性 （2）
16、退火（3）延伸为满足实验的需要所采用的PCR条件是：94初变性5 min，94 30 s、55 30 s、72 1 min，2530个循环，72C保温10min后，4下停止反应。 6、在PCR反应中由于反应体系或条件的不适常会出现两种极端的现象，一种是非特异性扩增严重，产生许多不确定的产物甚至无目的条带；另一种是扩增不到任何产物。这时需要通过改变模板浓度、引物用量、dNTP浓度、Mg2+浓度、缓冲液pH值等加以优化。其中尤以Mg2+浓度最为重要，其直接影响着引物退火的特异性、产物特异性以及酶的催化能力和准确性，Mg2+的最佳有效浓度为15mmolL，但也随模板和引物的不同而有所改变，可从05
17、mmolL到10 mmolL。在Tm值允许的范围内，适当提高反应的退火温度可使PCR产物的特异性增强。 四、PCR技术在基因克隆方面的应用（1）目的基因的直接克隆，（2）通过RT-PCR进行cDNA的克隆；（3）制备DNA探针，进行分子检测等。利用PCR技术，只需增加一步逆转录反应，便可从少数的mRNA构建cDNA文库。以mRNA为模板，以oligo(dT)为引物，在依赖于RNA的DNA聚合酶催化下体外合成cDNA第一链之后，可通过PCR扩增此链。1、RT-PCR：是指以mRNA在反转录酶作用下合成的cDNA第一链为模板的PCR。2、目前常用的反转录酶主要有两种：一种是来源于禽成髓细胞性白血病
18、病毒的AMV反转录酶，另一类是来源于莫洛尼鼠白血病病毒的MMLV反转录酶。3、cDNA末端的快速克隆(RACE技术)：是一种通过PCR进行cDNA末端快速克隆的技术，是以mRNA为模板反转录成cDNA第一链后用PCR技术扩增出某个特异位点到3，或5，端之间未知序列的方法。4、RACE原理：利用特异性引物对mRNA进行反转录形成cDNA第一链；以RNaseH分解掉cDNARNA杂交体中RNA；在T4RNA连接酶的作用下将单链cDNA环化或首尾相连物；用两对基因特异性引物：A1、S1及A2、S2分别进行二次PCR扩增得到所需目的片段5、反向PCR：PCR通常用于扩增位于两寡核苷酸引物之间的DNA区
19、段，但是经特殊设计的PCR也可用来扩增那些位于已知序列外侧的序列，这就是反向PCR6、2. PCR操作步骤：（1）反应体系的准备(20ul体积) (2) PCR程序（3）电泳检测五、基因文库技术分离目的基因1、文库：是指一种全体的集合。2、基因文库：则是指某一种生物类型全部基因的集合。这种集合是以重组体形式出现。全部DNA片段克隆的集合体即为该生物的基因文库3、基因文库构建包括以下基本程序： DNA提取及片段化，或是cDNA的合成。 载体的选择及制备。 DNA片段或cDNA与载体连接。 重组体转化宿主细胞。 转化细胞的筛选。 4、基因文库的类别：基因组文库和cDNA文库。5、基因组文库：是指将
20、某生物的全部基因组DNA切割成一定长度的DNA片段克隆到某种载体上而形成的集合。6、cDNA文库：是指某生物某一发育时期所转录的mRNA经反转录形成的cDNA片段与某种载体连接而形成的克隆的集合。7、基因组文库与cDNA文库的区别在于cDNA文库是有时效性的。8、从基因文库的功能上看可分为克隆文库及表达文库。9、克隆文库：由克隆载体构建。载体中具复制子、多克隆位点及选择标记，可通过细菌培养使克隆片断大量增殖。10、表达文库是用表达载体构建。载体中除上述元件外，还具有控制基因表达的序列(如启动子、SD序列、ATG、终止子等)，可在宿主细胞中表达出克隆片段的编码产物。11、表达载体又有融合蛋白表达
21、载体及天然蛋白表达载体之分。12、人工染色体载体是利用真核生物染色体或原核生物基因组的功能元件构建的能克隆大于50kbDNA片段的人工载体。13、核基因组文库构建主要使用噬菌体载体或粘粒载体。14、随机文库指代表基因组各部分DNA的摩尔数相等的文库。对于随机文库: N = ln(1-P) ； ln（1-x/y）N：克隆数目 P：设定的概率值(如：099，表示在片段随机分布时，从文库中找到任一序列的概率不低于099) x：插入片段平均大小(1520kb) y：基因组的大小(以kb计)15、应用于cDNA文库构建可产生以下效果： 能够从极其有限的起始材料中构建cDNA文库 可以以总RNA为模板合成
22、cDNA，无需mRNA的纯化，不仅简化操作，而且避免了低丰度信息分子的丢失。 能够提高cDNA文库的完整性，获得那些低水平表达的基因的cDNA克隆。16、常见人工染色体：酵母人工染色体、细菌人工染色体、P1噬菌体及其衍生人工染色体、可转化人工染色体、哺乳动物人工染色体、人类人工染色体、植物人工染色体、17、线状染色体自我复制、分离和传递至少依赖于染色体上3个关键序列：(1) 自主复制DNA序列(，ARS) ARS的生物功能是确保染色体在细胞周期中能够自我复制，维持染色体在细胞世代传递中的连续性。(2) 着丝粒DNA序列(CEN) 着丝粒确保复制了的染色体能够平均分配到子细胞中。(3) 端粒DN
23、A序列(TEL) 端粒的功能是与端粒酶结合，完成染色体末端复制。18、mRNA差别显示技术是对组织特异性表达基因进行分离的一种快速并行之有效的方法之一。mRNA差别显示技术也称为差示反转录PCR，简称为DDRT-PCR。它是将mRNA反转录技术与PCR技术相互结合发展起来的一种RNA指纹图谱技术。19、共有12种oligo(dT)12MN引物，用这12种引物分别对同一总RNA样品进行cDNA合成，即进行12次不同的反转录反应，每一种3，端锚定引物，都能够把总mRNA群体的112分子反转录成mRNA-cDNA杂交分子。这样可以将整个mRNA群体在cDNA水平上，分成大致相等但序列结构不同的12份
24、亚群体。这一过程叫做差异显示反转录，即DDRT。还需要另外一种由10个核苷酸组成的5端随机引物。这种5，随机引物可以同特定细胞类型的总mRNA群体中的一部分分子发生杂交作用，而且杂交部位是随机地分布在距每条新合成的cDNA链3，端的不同位置上。20、mRNA差别显示技术的优点：简便性、灵敏度高、可重复性较好 第五章、重组体的构建、转化及鉴定一、 质粒DNA的分离纯化1.细菌培养物的生长2.细菌的收集和裂解：a.离心收集菌体b.将沉淀溶于蔗糖-Tris-EDTA缓冲液，震荡。裂解细胞方法很多，共同步骤加溶菌酶和EDTA，破坏胞壁和膜。 c.加入SDS一类去污剂溶解球形，温和溶菌。d.离心，使质粒
25、DNA分子与细胞碎片分开。e.大质粒和小质粒3.质粒DNA的分离与纯化a.离心后得到含质粒DNA上清液，用异丙醇沉淀得到粗品。b.纯化的方法（1）聚乙二醇（2）氯化铯密度梯度离心4、氯化铯密度梯度离心法：用含有EDTA的缓冲液悬浮菌体加溶菌酶裂解细菌细胞壁，加CsCl和溴化乙锭，超速离心过夜，在紫外灯下吸取cccDNA，稀释沉淀cccDNA5、沸水浴法：用含有EDTA和Triton X-100的缓冲液悬浮菌体，加溶菌酶裂解细菌细胞壁，沸水浴40秒钟，离心，用无菌牙签挑去沉淀物，乙醇或异丙醇沉淀质粒DNA6、外源DNA片段同载体分子连接的方法，即DNA分子体外重组技术，主要是依赖于核酸内切限制酶
26、和DNA连接酶的作用7、 在选择外源DNA同载体分子连接反应程序时，需要考虑到下列三个因素：（1）实验步骤要尽可能地简单易行，(2) 连接形成的“接点”序列，应能被一定的核酸内切限制酶重新切割，以便回收插入的外源DNA片段，(3) 对转录和转译过程中密码结构的阅读不发生干扰。 8、将外源重组体分子导入受体细胞的途径，包括转化、转染、显微注射和电穿孔等多种不同的方式。转染和转化主要适用于细菌一类的原核细胞和酵母这样的低等真核细胞，而显微注射和电穿孔则主要应用于高等动植物的真核细胞。 9、转化：严格地说是指感受态的大肠杆菌细胞捕获和表达质粒载体DNA分子的生命过程。10、转染：则是专指感受态的大肠
27、杆菌细胞捕获和表达噬菌体DNA分子的生命过程。11、常用5种方法来鉴定含重组质粒的细菌菌落： 1.PCRDNA测序鉴定。 2. 小规模制备质粒DNA进行限制酶切分析。 3. a互补。 4. 抗性的插入失活。 5. 杂交筛选。 12、核酸分子杂交技术：带有互补的特定核苷酸序列的单链DNA或RNA，当它们混合在一起时，其相应的同源区段将会退火形成双链的结构。13、如果彼此退火的核酸来自不同的生物有机体，那么如此形成的双链分子就叫做杂种核酸分子。能够杂交形成杂种分子的不同来源的DNA分子，其亲缘关系较为密切；反之，其亲缘关系则比较疏远。14、DNADNA的杂交作用，可以用来检测特定生物有机体之间是否
28、存在着亲缘关系。 15、杂交筛选的两个不同的步骤：第一，将核酸样品转移到固体支持物滤膜上，这个过程称为核酸印迹转移，主要的有电泳凝胶核酸印迹法。 第二，是将具有核酸印迹的滤膜同带有放射性标记或其它标记的DNA或RNA探针进行杂交。 16、印迹杂交：使在电泳凝胶中分离的DNA片段转移并结合在适当的滤膜上，然后通过同标记的单链DNA或RNA探针的杂交作用检测这些被转移的DNA片段称之为印记杂交技术。17、northern RNA吸印杂交技术：将RNA分子从电泳凝胶转移到硝酸纤维素滤膜或其它化学修饰的活性滤纸上，进行核酸杂交的一种实验方法。18、Western蛋白质杂交技术：将蛋白质从电泳凝胶中转移
29、并结合到硝酸纤维素滤膜上，然后同放射同位素125I标记的特定蛋白质之抗体进行反应。第六章 克隆基因的表达 1、原核生物基因表达的特点： 原核生物只有一种RNA聚合酶识别原核细胞的启动子，催化所有RNA的合成。 原核生物的表达是以操纵子为单位的。 由于原核生物无核膜，所以转录与翻译是偶联的，也是连续进行的。 原核基因一般不含有内含子(intron)，在原核细胞中缺乏真核细胞的转录后加工系统。 原核生物基因的控制主要在转录水平，这种控制要比对基因产物的直接控制要慢。 在大肠杆菌mRNA的核糖体结合位点上，含有一个翻译起始密码子及同16S核糖体RNA 3末端碱基互补的序列，即SD序列，而真核基因则缺
30、乏此序列。 2、调控区主要分为三个部分：操纵子、启动子及其他有调控功能的部位。3、RNA合成的控制有两种方式，一是起始控制(启动子控制)，二是终止控制(衰减子控制)。 4、将外源基因在原核细胞中表达，必须满足以下条件： 通过表达载体将外源基因导人宿主菌，并指导宿主菌的酶系统合成外源蛋白； 外源基因不能带有间隔顺序(内含子)，因而必须用cDNA或全化学合成基因，而不能用基因组DNA； 必须利用原核细胞的强启动子和S-D序列等调控元件控制外源基因的表达； 外源基因与表达载体连接后，必须形成正确的开放阅读框架； 利用宿主菌的调控系统，调节外源基因的表达，防止外源基因的表达产物对宿主菌的毒害。5、基因
31、表达的调控序列主要涉及启动子、S-D序列、终止子、衰减子等序列。 6、启动子是DNA链上一段能与RNA聚合酶结合并能起始mRNA合成的序列，没有启动子，基因就不能转录。7、启动子有两个保守区：（1）Pribnow盒（TATA盒或10区）（2）35区8、通常使用的可调控的强启动子有lac (乳糖启动子)、trp (色氨酸启动子)、PL和PR(噬菌体的左向和右向启动子)以及tac（乳糖和色氨酸的杂合启动子)等。9、S-D序列与起始密码子之间的距离，是影响mRNA转译成蛋白质的主要因素之一。10、终止子：在一个基因的3端或是一个操纵子的3端往往还有一特定的核苷酸序列，它有终止转录的功能，这一DNA序列称为转录终止子11、衰减子：是指在某些前导序列中带有控制蛋白质合成速率的调节区。12、前导序列：指位于编码区之前的不转译的mRNA区段。 13、在原核细胞中表达外源基因时，可产生融合型和非融合型两种表达蛋白。14、非融合蛋白：不与细菌的任何蛋白或多肽
