1、基因工程 基因工程 概述100多年前：Mendal 遗传因子：半个世纪后Morgan 基因；1944年Avery 证明了基因的物质基础是DNA；1953年 揭示了DNA的双螺旋分子的结构。基因工程：又称为重组DNA技术(DNA recombination)、分子克隆(molecular cloning) 广义： DNA重组技术的产业化设计与应用，包括上游技术和下游技术。 狭义： 将一种或多种生物体（供体）的基因与载体在体外进行剪接重组，然后转入另一种生物体（受体）内，使之按照人们的意愿遗传并表达出新的性状。基因工程的三大要素：供体、载体、受体基因工程的基本过程：基因工程的上游操作过程可简化为：
2、切、接、转、增、检。（1）切：从供体细胞中分离出基因组DNA，用限制性核酸内切酶分别将外源DNA(包括外源基因和目的基因）和载体分子切开。（2）接：用DNA ligase将含有外源基因的DNA片段接到载体分子上。(3)转：借助于细胞转化手段将DNA重组分子导入受体细胞中。(4)增：短时间培养转化细胞，以扩增DNA重组分子或使其整合到受体细胞的基因中。(5)检：筛选和鉴定经转化处理的细胞，获得外源基因高效稳定表达的基因工程菌或细胞。1.1.3 基因工程的基本原理 分子遗传学、分子生物学、生化工程学是基因工程原理的三大基石 主要的基因工程产品：P6表1-1基因工程的研究意义：（1）大规模生产生物分
3、子；（2）设计构建新物种；（3）搜寻、分离、鉴定生物体尤其是人体内的遗传信息资源。基因工程的基本过程：载体选择目的基因的提取体外DNA重组引入受体细胞无性繁殖的转化子筛选重组DNA检测 Chapter 2 DNA重组克隆的单元操作DNA重组克隆的主题思想是外源基因的分离、克隆、扩增、表达。DNA重组克隆一般包括切、接、转、增、检五大单元操作。2.1 DNA重组的载体 绝大多数分子克隆实验所使用的载体是DNA双链分子。DNA重组的载体功能： （1）为外源基因提供进入受体细胞的转移能力：任何DNA分子可物理渗透，但效率极低；外源基因与载体剪接所形成的DNA重组分子进入受体细胞的概率高，可达数个数量
4、级。（2）为外源基因提供在受体细胞中的复制能力或整合能力。 （3）为外源基因提供在受体细胞中的扩增和表达能力：载体的高拷贝自主复制能力；所需的调控元件一般由载体分子提供。上述三大功能并非所有的载体分子都必须具备，DNA重组克隆的目的不同，对载体分子的性能要求也不同。但对于所有不同用途的载体而言，为外源基因提供复制或整合能力是必不可少的。通常选择天然存在的质粒以及噬菌体或病毒DNA作为载体蓝本。一个理想的载体至少应具备下列四个条件：（1）具有对受体细胞的可转移性或亲和性，以提高载体导入受体细胞的效率；（2）具有与特定受体细胞相适应的复制位点或整合位点，使得外源基因在受体细胞中稳定遗传；（3）具有
5、多种单一的核酸内切酶识别切割位点，有利于外源基因的剪接插入；（4）具有合适的选择性标记，便于重组DNA分子的检测。1、质粒载体质粒（plasmid）是一类存在于细菌和真菌细胞中能独立于染色体DNA而自主复制的共价、闭合、环状DNA分子（covalently closed circular DNA），也称为cccDNA，其大小通常在1-100kb范围内。质粒的基本特性 野生型质粒具有下列基本特性：（1）自主复制性（2）可扩增（3）可转移性（4）不相容性人工构建的载体质粒根据其功能和用途可分为下列几类：（1）克隆质粒：这类质粒常用于克隆和扩增外源基因。（2）测序质粒：这类质粒通常高拷贝复制，并含有
6、多酶切口的接头片段，便于各种DNA片段的克隆与扩增。pUC18/19系列；M13mp系列。（3）整合质粒：这类质粒含有整合酶编码基因以及整合特异性的位点序列，克隆在这种质粒上的外源基因进入受体细胞后，能准确的重组整合在细胞染色体DNA的特定位点上。（4）穿梭质粒：克隆在此类质粒上的外源基因可以不用更换载体直接从一种受体菌转入另一种受体菌中复制并且遗传。（5）探针质粒：被设计用来筛选克隆基因的表达调控元件，如启动子和终止子等。（6）表达质粒：pSPORT系列和pSP系列。质粒的分离与纯化 质粒是一种细菌染色体外的、具有自主复制能力的、共价闭合环状超螺旋结构的小型DNA分子。碱裂解法提取质粒是实验
7、室常用的方法。碱溶法 原理：依据cccDNA与线性染色体DNA在拓扑结构上异同来进行分离步骤：（1）将菌体悬浮在含有EDTA的缓冲液中；（2）加入溶菌酶裂解细胞壁；（3）加入SDS-NaOH混合液，去膜释放细胞内含物；（4）加入高浓度的酸钾缓冲液沉淀染色体，去除染色体DNA及大部分蛋白质；（5）离心取上清液，用苯酚-氯仿溶液处理，去除灭火痕量的蛋白质和核酸酶；（6）用乙醇或异丙醇沉淀水相的质粒；（7）用不含有DNAase的RNAase降解残余的RNA小分子。pH12.5-线性染色体DNA的双螺旋结构解开而变性；质粒DNA的氢键虽然断裂但两条互补链仍彼此缠绕在一起。乙酸钾pH恢复至中性染色体DN
8、A分子难以复性，而质粒DNA分子很快复性。离心染色体DNA与细胞碎片一起被沉淀出来，而质粒DNA则留在上清液中。用异丙醇或乙醇沉淀后洗涤，可得到较纯的质粒DNA2、双链噬菌体DNA载体噬菌体的生物学特征 ： 噬菌体是比细菌还小得多的微生物，和病毒侵犯真核细胞一样，噬菌体侵犯细菌，也可以认为它是细菌里的“寄生虫”。它本身是一种核蛋白，核心是一段DNA，结构上有一个蛋白质外壳和尾巴，尾巴上的微丝可以把噬菌体的DNA注入细菌内。 -噬菌体的生物结构： -噬菌体是大肠杆菌的温和型噬菌体，（1）由外壳包装蛋白和-DNA组成 ；（2）线性dsDNA病毒，具有末端互补的12nt（cos末端），感染细菌后粘端
9、互补成双链环状；（3）全长48502个核苷酸；（4）-DNA上至少有50多个基因（-DNA的基因顺序组织 P17 图2-3）噬菌体DNA的4个分区 （1）结构区：A J共19个基因，长约20kb，其中的基因编码构成头部、尾部、尾丝对组装完整噬菌体所需要的蛋白质；(2）重组区 ：att、int及xis，长约20kb，是DNA整合和切除溶原生长所需的序列；（3）调控区:长约10kb，包括启动子、终止子和N、CI基因。控制溶菌和溶原生长最重要的调控基因和序列、以及DNA复制均在该区域内；（4）O-R 为裂解区-噬菌体侵犯细菌时，只是DNA侵入，然后利用细菌的酶来复制、转录、翻译。入侵E.coli后，
10、可以按裂解或建立溶原两种生活方式生存和繁殖。裂解:噬菌体在宿主内进行独立复制，在1个菌体内生长出100个左右的新噬菌体，并冲破（杀死）细菌释放出来，再度感染其它活菌，称为裂解。溶原（lysogen）:噬菌体侵入菌体后，把自身DNA加进细菌DNA里（整合），作为细菌基因的一部分，随菌的细胞分裂而增殖，这种生活状态称为溶原（lysogen）。-噬菌体的侵染过程：吸附注入复制包装裂解-DNA载体的构建 野生型的-DNA本身存在着种种缺陷，必须对其进行多方面的改造，才能满足一个理想载体的要求，这些改造内容包括： （1）缩短野生型-DNA的长度，提高外源DNA片段的有效装载量；（2）删除重复的酶切位点，
11、引入单一的多酶切位点接头序列，增加外源DNA片段克隆的可操作性；（3）灭活某些与裂解周期有关的基因，使-DNA载体只能在特殊的实验条件下感染裂解宿主细菌，以避免可能出现的生物污染；（4）引入合适的选择性标记基因，便于重组噬菌体的检测。野生型-DNA上约有40-50%的片段是复制和裂解所非必需的。根据切除片段长度的不同，可将-DNA分成两大类载体：（1）插入型载体；（2）取代型载体（置换型载体）允许外源 DNA 片段替换非必须 DNA 片段的载体，称为置换型载体（replacement vectors）。一般情况下，置换型载体克隆外源片段的大小范围是 9-23kb ，故而该载体主要用来构建基因组
12、文库。-DNA载体的构建 ： (1)缩短野生型 -DNA的长度，提高外源DNA片段的有效装载量；（2) 删除重复的酶切位点,增加一些单一的多酶切位点接头序列，增加外源DNA片段克隆的可操作性；（3）灭活某些与裂解周期有关的基因，使-DNA载体只能在特殊的实验条件下感染裂解宿主菌，以避免可能出现的生物污染；（4）构建琥珀密码子的突变体；（5)加装选择标记,加装于-DNA克隆载体上的选择标记主要有下列两类：免疫功能类标记 Imm434 ；颜色反应类标记 lacZ-DNA载体的分类及用途根据功能及用途不同，-DNA载体可分为以下几个家族： （1）Charon系列：为克隆外源DNA大片段而设计的取代型
13、载体；（2）EMBL系列：同上，其克隆位点位于BamH I；（3）DASH系列：含有互为反向的两套多克隆位点接头序列，形成-半乳糖苷酶融合蛋白；（4）gt系列：插入型表达载体，可用来克隆表达外源cDNA-DNA的分离与纯化 （1）将大肠杆菌在含有麦芽糖的培养基中培养至对数生长期，加入噬菌体或重组噬菌体的悬浮液，37培养1小时用新鲜培养基稀释，继续培养4 -12小时。这时噬菌体颗粒密度已达1013 -1014 / L，大肠杆菌细胞已完全裂解；（2）超速离心，沉淀噬菌体 ；（3）苯酚抽提，释放-DNA；（4）乙醇或异丙醇沉淀-DNA -DNA作为载体的优点 （1）在体外包装成噬菌体颗粒，能高效转染
14、大肠杆菌；（2）装载能力为25 kb，远远大于质粒的装载量；（3）重组-DNA分子的筛选较为方便；（4）重组-DNA分子的提取较为简便；（5）-DNA载体适合克隆和扩增外源DNA片段，但不适合表达外源基因。因而-DNA可通过人工加入序列的方法构建pET载体。M13单链噬菌体DNA载体M13噬菌体的生物学特性： M13噬菌体的外型呈丝状，由外壳包装蛋白和正链DNA组成，不裂解宿主细胞，但抑制其生长，M13 DNA全长6407个核苷酸，上面至少有10个基因。M13 DNA载体的特点 ： （1）使克隆的DNA片段以特定单链的形式输出受体细胞外，这在DNA定向突变中非常有用。 （2）M13重组分子筛选
15、简便。（3）被M13噬菌体感染的受体细胞生长缓慢，形成混浊斑，易于辨认挑选。而且重组分子越大，混浊斑的混浊度亦越大。（4）M13-DNA载体的最大缺陷是装载量小，只有1.5kb。人造染色体载体 （1）细菌人造染色体（BAC）；（2）酵母人造染色体（YAC):装载量最大DNA的体外重组（切与接） 需要有功能各异的工具酶来完成，如限制性核酸内切酶、T4-DNA连接酶、Klenow DNA聚合酶等。限制性核酸内切酶-“分子手术刀”限制性核酸内切酶（restriction endonuclease）几乎存在于任何一种原核细菌中，可在特异位点上催化双链DNA分子的断裂，产生相应的限制性片段。（不同生物来
16、源的DNA具有不同的酶切位点和不同的位点排列顺序特征性的限制性酶切图谱，可用于生物分类、基因定位、疾病诊断、刑事侦查等）宿主细胞的限制和修饰作用 两种不同来源的噬菌体(K和B) ，能高频感染各自大肠杆菌宿主细胞（ K株和B株 ） ，当它们分别与其它宿主菌交叉混合培养时，（K-B， B-K）感染下降数千倍，一但 K噬菌体在B株感染成功，由B株繁殖出K后代，则可以感染B株而不能再感染原来的K株.限制和修饰作用的分子机制 1.大肠杆菌宿主细胞K株，B株 ，有各自的限制和修饰系统。1）它们均有三个连续的基因位点控制，hsdR; hsdM; hsdS. 2）hsdR编码限制性核酸内切酶-识别DNA分子特
17、定位点，将双链DNA切断。3）hsdM编码产物是DNA甲基化酶-催化DNA分子特定位点的碱基甲基化反应。4）hsdS表达产物的功能是-协助限制性核酸内切酶和甲基化酶，识别特殊的作用位点。2.入噬菌体长期生长在大肠杆菌宿主细胞 K株，B株 中。1）宿主细胞甲基化酶，将染色体DNA和噬菌体DNA 特异性保护。2）封闭自身所产生的核酸内切酶的识别位点。-（修饰）3当外来DNA入侵时，遭到宿主限制性内切酶的特异降解 -（限制）4. 由于降解不完全，外来少数DNA分子在宿主细胞繁殖过程中被宿主细胞的甲基化酶修饰，虽然是外来却不被降解。 5但丧失在原宿主细胞中的存活能力，因为接受了新宿主菌甲基化修饰的同时
18、丧失了原宿主菌修饰的标记(一但K 噬菌体在B株成功，由B株繁殖出K后代，能感染B株, 不能感染原来K株.) 限制性内切酶的分类：（三大类） I类， II类，III类。 I类，III类为限制-修饰酶： 限制性内切活性和甲基化活性，都作为亚基的功能单位包含在同一酶分子中。II类限制性内切酶与甲基化酶是分离的，切割位点专一，适合于DNA重组。II类限制性核酸内切酶的基本特征II类限制性核酸内切酶 1968年Smith等人在流感嗜血杆菌d型菌株中发现，该类酶是一种相对分子质量较小的单体蛋白，其双链DNA的识别与切割活性仅需要Mg2+，且识别切割位点的序列大都具有严格的特异性，故而在DNA重组及分子生物
19、学实验中被广泛应用。特点：（1）识别序列 为 4，5 或 6个碱基对；（2）180度旋转对称回文结构，对称轴在第三，四碱基之间。（3）任何一个DNA分子，每9对碱基出现一个II类酶切口。（4）实际上，由于不同生物的DNA碱基含量不同，因此酶识别位点的分布及概率也不同。II类限制性核酸内切酶的切割方式（1）以酶切特点来分 同位酶：识别相同序列，但切点不同。 同裂酶：识别位点与切割位点相同，酶的来源不同。也叫同切点酶，isoschizomers，如SstI与SacI、HindIII与HsuI。 同尾酶：识别位点不同，切出片段有相同末端序列。（2）以切出片段末端性质不同可分，粘性末端和平末端。 粘性
20、末端：（Cohesive Ends）两个突出末端可退火互补DNA是分子重组的基础甲基化酶的基本特征类限制性内切酶有相应甲基化酶伙伴 a)限制性内切酶，甲基化酶的识别位点相同，序列内使碱基甲基化，封闭酶切口。b)甲基化酶封闭一个限制性内切酶切口同时产生另一种酶切口。c）大肠杆菌内存在着两种DNA甲基化酶 DNA腺嘌呤甲基化酶 Dam (DNA adenine methylase) 、DNA胞嘧啶甲基化酶 Dcm (DNA cytosine methylase)其他作用于DNA重组的工具酶Klenow酶Klenow酶（大肠杆菌聚合酶）在其单一多肽链上具有如下活性：（1）5-3聚合酶活性；（ 2）3
21、-5外切酶活性。（3）5-3核酸外切酶活性；（4）核酸内切酶活性Klenow酶在分子克隆中的主要用途：1）修复限制性内切酶造成3凹端，使之成为平末端。2）以含有同位素的脱氧核苷酸为底物，对DNA片段进行标记。3）用于催化cDNA第二链合成。4）用于双脱氧末端终止法测定DNA序列。末端脱氧核苷酰转移酶（TdT) 来源于小牛胸腺，它是一种不需要模板的DNA聚合酶，其合适的底物形式为带有3游离羟基的双链DNA分子。在人工黏性末端的构建中极有用处。S1核酸酶特征：1）降解单链DNA或RNA；2）反应方式为外切和内切；3）酶量大时降解双链核酸作用：切平突出单链末端, 和发卡结构中环状。制作S1图谱Bal
22、31核酸酶（1）3端外切酶活性；（2）5端外切和内切活性。作用：1）从双链DNA两端连续降解；2）单链DNA外切和内切；3）超螺旋结构的线性； 4）在分子克隆中可控制性截短DNA分子。碱性磷酸单脂酶BAP细菌的碱性磷酸单脂酶、CIP牛小肠的碱性磷酸单脂酶作用：1）催化核苷酸性5端除磷反应。2）重组DNA中用于载体的5末端除磷操作以提高重组效率。3）用于外源DNA片段5端除磷防止外源片段之间连接。T4-DNA聚合酶（1）5-3聚合酶活性 ；（2）3-5外切酶活性，对单链DNA作用远大于双链DNA （3）5-3外切酶活性 ；（4）核酸内切酶活性作用：修平非平头的cDNA分子以及由某些限制性核酸内切
23、酶水解产生的3突出末端内切酶：可以在DNA或RNA分子内部切断磷酸二酯键,称内切酶.外切酶：仅能水解位于核酸分子链末端的核苷酸叫外切酶DNA连接酶（DNA ligase）催化的基本反应形式： 将DNA双链上相邻的3羟基和5磷酸基团共价结合形成3,5-磷酸二酯键，使原来断开的DNA缺口重新连接起来。（E.coli DNA连接酶、T4噬菌体DNA连接酶）T4-DNA连接酶 由 T4 噬菌体基因编码，分子量60KD基本活性: 1）修复双链DNA上单链缺口；2）连接RNA-DNA杂交双链上DNA链缺口；3）连接完全断开两个平头双链DNA分子。DNA切接反应的影响因素限制性核酸内切酶的切割反应绝大多数I
24、I类限制性内切酶对基本缓冲系统的组成要求相同：1）pH7.5，10-50mM的Tris-HCl；2）10mM MgCl2；3）1mM DTT（二巯基苏糖醇）基本缓冲系统的组成区别：各种酶对盐浓度的要求有区别：低盐组（0-50mM）、中盐组（50-100mM）、高盐组（100-150mM） 同一种DNA分子大多情况下需要两种限制性内切酶切：1）如果两种酶对NaCl要求相同，原则上将两种酶同时加入反应体系中进行同步酶切；2）对于NaCl要求差别不大时，也可同时进行反应，只是选择对价格较贵的酶有利的盐浓度，另一种酶通过加大酶量方法来弥补活性的损失；3）对盐浓度要求差别较大时，操作方法如下：a、低盐组
25、的酶先切，然后加热灭活，补加NaCl至合适的最终浓度，再用高盐组酶切；b、一种酶反应结束后，加入0.1V的pH5.5，5M KAc溶液和2V的预冷乙醇，20放置15min，4离心15min干燥后再加入另一种酶缓冲液进行酶切。 有时会遇到两种酶不能同时进行酶切反应，必须先后进行，且先后次序对酶切效果也很关键。如两种酶的识别序列互相重叠限制性内切酶的星号活性（star activity）：虽然II类限制性内切酶具有特异性的识别序列和切割位点，但当酶解条件发生变化时，酶切反应的专一性可能会降低，导致同种酶识别多种序列，这种现象称为限制性核酸内切酶的star activity.（EcoR I，BamH
26、 I）酶单位：1个标准单位（U）的任何限制性核酸内切酶的定义为在最佳缓冲系统中，37反 应1h完全水解pBR322 DNA所需的酶量。一个标准的酶切反应设计为：0.1-1.0g DNA 5 L、10倍的缓冲液2L、酶1L，ddH2O12L，反应总体积为20L。T4-DNA连接酶的连接反应缓冲系统组成：pH7.5，50-100mM Tris-HCl，10mM MgCl2，5mM DTT以及1mM ATP。通常1国际单位（U）的T4-DNA连接酶定义为，在最佳缓冲系统及15、1h之内，完全连接1g-DNA的Hind III片段所需的酶量。连接反应的总体积一般在10-15L。重组率及其影响因素重组率
27、：指在连接反应结束后，含有外源DNA片段的重组分子数与所投入的载体分子数之比。 如果外源DNA片段与载体DNA均用同一种限制性核酸内切酶切开，则连接反应产物可存在多种形式，如含有外源DNA片段的重组分子和自我连接的载体分子，后者成为载体的自我环化或空载。如何提高重组率：(1)提高外源DNA片段与载体DNA的分子数之比，增加外源DNA片段与载体分子之间的碰撞机会，降低载体自我环化的能力；(2)在连接反应前，先用碱性磷酸单酯酶处理载体DNA，去除5端磷酸基团;(3)在连接反应前，用TdT酶在载体分子的3羟基末端聚合一段同种碱基的寡聚核苷酸。DNA分子重组的方法DNA连接酶：一种能够催化在2条DNA
28、链之间形成磷酸二酯键的酶，即DNA连接酶(ligase)。这种酶需要在一条DNA链的3-末端具有一个游离的羟基(-OH)，和在另一条DNA链的5-末端具有一个磷酸基团(-P)，只有在这种情况下，才能发挥其连接DNA分子的功能作用。在大肠杆菌及其它细菌中，DNA连接酶催化的连接反应，是利用NAD烟酰胺腺嘌呤二核苷酸(氧化型)作能源的；而在动物细胞及噬菌体中，则是利用ATP腺苷三磷酸作能源。 DNA连接酶是封闭双螺旋DNA骨架上的切口(nick)，即在双链DNA的某一条链上两个相邻核苷酸之间失去一个磷酸二酯键所出现的单链断裂，不能够连接两条单链的DNA分子或环化的单链DNA分子。DNA连接酶的基本
29、性质（1）修复双链DNA上切口处的磷酸二酯键；（2）修复与RNA链结合的DNA链上切口处的磷酸二酯键；(3)连接多个平头双链DNA分子。分类大肠杆菌DNA连接酶T4DNA连接酶来源大肠杆菌T4噬菌体能源辅助因子NAD+ATP功能主要催化DNA黏性末端的连接黏性末端、平末端均可连接 （大肠杆菌染色体编码的叫做DNA连接酶，由大肠杆菌T4噬菌体DNA编码的叫做T4DNA连接酶)连接酶连接切口DNA的最佳反应温度是37，但是在这个温度下，黏性末端之间的氢键结合是不稳定的。因此，连接黏性末端的最佳温度，应是介于酶作用速率和末端结合速率之间，一般认为415比较合适。平末端的连接采用T4DNA聚合酶，可在
30、较高的温度进行，如22 。体外连接DNA片段的方式（1）黏性末端：1）同种内切酶产生的黏性末端的连接；2）同尾酶产生的黏性末端的连接 3）不同黏性末端的连接（p41） （具黏性末端的DNA片段的连接比较容易，也较常用。）（2）平末端的直接连接；（3）末端修饰后的连接；（4）加上连杆（ linker ），使之形成黏性末端后，再用DNA连接酶连接；（5）DNA接头(adapter)连接法平末端的连接：（1）直接用T4DNA连接酶连接；（2）先用末端核苷酸转移酶，给平末端DNA分子加上同聚物尾巴之后再用DNA连接酶进行连接；（3）用连杆连接平末端DNA分子；（4）DNA接头连接法。末端修饰后的连接：
31、 （1）DNA片段末端同聚物加尾后连接（用末端脱氧核苷酸转移酶（TdT）给具平末端的DNA片段加上poly(dA)、 poly(dT)、 poly(dC)、 poly(dG)尾巴之后，再用DNA连接酶将它们连接起来）；（2）黏性末端修饰成平末端后再连接连杆(linker)：是指用化学方法合成的一段由1012个核苷酸组成的、具有一个或数个限制酶识别位点的寡核苷酸片段。（DNA片段末端加上化学合成的连杆，能形成黏性末端，连接后可用内切酶进行切割。）DNA接头(adapter)：一类由人工合成的一头具有某种限制性内切酶粘末端，另一头为平末端的特殊的双链寡核苷酸片段。重组DNA分子的转化与扩增（转与增）重组DNA分子的转化（Transformation）：DNA分子在体外构建（切、接）完成后，必须导入特定的受体细胞，使之无性繁殖并高效表达外源基因或直接改变其遗传性状，这个导入过程及操作统称为重组DNA分子的转化。重组DNA导入受体菌:原核细胞：大肠杆菌；真核细胞：哺乳类动物细胞、酵母和昆虫细胞受体菌条件：（1）安全宿主菌;（
