1、西洋参土壤菌株的分离与拮抗菌株的筛选与鉴定西洋参病害土壤细菌和真菌的分离与拮抗菌株的筛选鉴定邓华宁 指导教师：孙艳（陕西师范大学 生命科学学院，陕西 西安，710119）摘 要：为了寻找解决西洋参连作障碍的生物防治方法，我们分离出4年生西洋参病害土壤里的真菌和细菌，依据形态学特征，我们得到15株真菌，并用马丁氏培养基斜面保存，得到114株细菌并保种于甘油里，在4冰箱保存，初筛是用细菌的发酵液来检测细菌是否抑制真菌的生长，具体的做法是在真菌培养皿中涂布上真菌孢子悬液，然后将培养基过中心均匀划分为6个区域，每个区域内用打孔机打出8mm直径的小孔，其中5个里面注入不同细菌的发酵液，剩下的一个小孔注入
2、蒸馏水作空白对照，通过此抑菌实验筛选出具有抑制真菌生长的细菌有：C1抑制P7，C11、B2抑制P6，A40抑制C1，A14、B45、B28抑制J3，A22抑制J4，C14抑制J6，A5抑制J10，将产生拮抗效果的细菌和真菌进行种类鉴定，细菌采用16sRNA比对的方法进行鉴定，真菌采用ist比对的方法进行鉴定；上述结果将会为西洋参产业化生产扫清障碍，也会帮助到种植西洋参的农民，当然，也对菌种种类的鉴定和作用机理的探索打好了基础。关键字：西洋参；拮抗菌；筛选 西洋参（Panax quinquefolium L.）属于五加科人参(Panax)属植物，多年生草本或木本植物，根部呈梭子形，根表面光滑细腻
3、并显浅黄色，平均长度为25cm，切成参片有透喉效果，切面光滑且有纹理。能较好的生长于海拔1000米左右的山坡，散射光能更好的促进其生长，沙子含量高的土壤是其适宜的生长地1。最早发现于威斯康辛州（美国）的森林地带，加拿大南部与中国都生长着一些。西洋参植株根部人参皂苷含量最高2-3，在我国河北、北京、陕西和山东等地已形成规模化种植4，具有调节中枢神经、提高免疫力、抗肿瘤、保护心血管系统等作用5。近年来西洋参的市场需求量不断增大，但其种植方面问题突出，深受连作障碍困扰6。栽过一年西洋参的土壤微生物区系平衡被破坏，导致西洋参特别容易被侵染；目前国内对西洋参土壤菌群的研究论文较少，对陕南地区的研究几乎空
4、白7-10，本文对陕南地区四年生西洋参根系土壤菌种进行研究，以期寻找出一些拮抗菌种11，对西洋参未来的产业化生产提供一些参考。1 材料及方法1.1 土壤及器材汉中市留坝县四年生西洋参病害土壤。恒温箱、高压锅、400个培养皿、废旧报纸、天平、各种玻璃容器等。1.2 培养基马丁氏培养基：磷酸二氢钾 1.0 g、葡萄糖 10.0 g、硫酸镁 0.5 g、Agar 18.0 g、蛋白胨 5.0g、蒸馏水 1 000.0 ml；此培养液1000.0ml加1%孟加拉红水溶液3.3ml；临用时每100.0ml培养基加1%链霉素0.3ml。、牛肉膏蛋白胨培养基（NA）：氯化钠 5.0 g、蛋白胨 10.0 g
5、、Agar 15.0 g、牛肉膏培养基 3.0 g、蒸馏水 1 000.0 mL、pH值 7.07.2。 NA 液体培养基：蛋白胨 10 g、氯化钠 5.0 g、牛肉膏 3.0 g、水 1 000 mL，pH 值 7.07.2。 营养肉汁琼脂（LB）：酵母浸粉 5.0 g、氯化钠 5.0 g、Agar 15.0 g、蛋白胨 10.0 g、蒸馏水 1 000.0 ml、pH值 7.0。BPY培养基：蛋白胨 10.0 g、酵母膏 5.0 g、氯化钠 5.0 g、Agar 15.0 g、牛肉膏 5.0 g、蒸馏水 1 000 ml、pH值 7.0。1.3 真菌的分离1.3.1 最适挑菌浓度的探索在无
6、菌室，取2 g、4 g、 6 g、8 g、病害土壤分别置于200 ml三角瓶中，并分别添加45 ml蒸馏水，用纱布缠好瓶口，保持三角瓶内无菌并有宜的通氧量，放入200220rpm的摇床中，30min后取出，静置10min后取上清液备用；用梯度稀释法对上述上清分别进行稀释，每一个质量的土壤做四个梯度，依次稀释十倍，分别为10-1、10-2、10-3、10-4，每个质量的土壤做四个梯度总共得到16个浓度的菌悬液，之后用灭菌好的涂布棒将这些菌悬液涂布到马丁氏培养基中，接种量为0.1ml，每个浓度做三个重复。将涂布好的培养皿放入28C的恒温箱中培养，并在培养箱内放入一盘无菌水，保持培养箱内的湿度，以防
7、培养基干裂，每天换一次水（蒸馏水），三天后取出，观察菌落的生长情况，选择出最合适的稀释浓度，并拍照留作记录。1.3.2 真菌的挑取用上述探索出来的最佳稀释浓度在无菌操作台制备好菌悬液，用近自然法涂布6个马丁氏培养基，接种量为0.1ml，培养方法同上，三天后挑取形态不同的菌株进行转接，再转接三次确定为纯培养后进行斜面保种；再用普通法按照上述方法挑取一次。近自然法12-13：提高微生物可培养性关键在于为微生物提供合适的生活条件，尤其是各种生化因子。土壤中存在大量的微生物，但实验室传统培养基只能培养出其中的1%左右。若将人们还不很清楚其全部成分的土壤溶液加入到培养基中，则有可能提高微生物的可培养性。
8、将土壤溶液加入到培养基中，则能提高微生物的可培养性。1.4 细菌的分离在无菌室，取5 g病害土壤置于200 ml三角瓶中，并添加45 ml蒸馏水，用纱布缠好瓶口，保持无菌并有宜的通氧量，放入200220rpm的摇床中，30min后取出，静置10min后取上清备用，用梯度稀释法对上面得到的上清进行5个梯度的稀释，分别为10-1、10-2、10-3、10-4、10-5，之后用灭菌好的涂布棒将这些菌悬液涂布到NA培养基中，接种量为0.1ml，三次重复；将涂布好的培养皿放入28的恒温箱中培养一天，选出适宜的稀释梯度。用适宜浓度的土壤菌悬液涂布6个NA培养基，培养一天后用灭过菌的半根牙签挑取单个菌落于装
9、有NA液体培养基的96孔板里震荡培养过夜，得到的菌悬液用灭过菌的接种环蘸取进行划线培养，每接种一株细菌过后要对接种环进行彻底的烧烤灭菌，划线的好的培养皿放入28恒温箱继续培养，如此划线培养三次确定为单克隆后用30%甘油于4冰箱保种。1.5 拮抗细菌的筛选1.5.1 拮抗菌株的初筛14 将保存好的细菌吸取2ml于装有2ml LB液体培养基的摇菌管里，活化三小时，再以5%的接种量接种到200 ml装有50mlBPY培养基的三角瓶中，在34、185 rpm的条件下振荡12h，收集发酵液。 准备400个马丁氏培养基平板，在背面用马克笔过培养皿中心将其等分成六份，马克笔的线画在培养皿的背面，然后用打孔器
10、在每个区域里打上8mm的小孔，每个孔离培养基中心的距离相等，正好呈圆形排列；在培养基的中心接种上真菌，5个孔里分别用移液枪打入0.1ml细菌菌液，另一个小孔注入0.1ml无菌水作对照，每一株真菌接种25个平板，每个平板接种五种细菌。 1.5.1 拮抗菌株的复筛用上述方法收集好发酵液，在12000rpm的离心机里离心十分钟，收集上清液，用0.22m的细菌过滤器过滤，保存过滤液供拮抗活性检测；菌体接种方法同上，但每个8mm小孔里的细菌菌液换成过滤掉菌体的无菌发酵液。1.6 真菌与细菌种类的鉴定 1.6.1 细菌种类的鉴定 将具有抑制效果的细菌接种到BPY培养液中，28、210rpm震荡培养15h，
11、收集菌液。 取3 ml的培养菌液,在10000 r/m离心机上离心5分钟,除去上清液，用150l的SP Buffer充分使菌体悬浮起来。 加入20l的Lysozyme溶液,让其跟菌体充分混合后在室温条件下静置5分钟，再注入30l的EDTA Buffer,混匀后室温静置5分钟。注进200l的Solution A,强烈摇晃后65C保温10分钟，打入400l的Solution B,强烈摇晃15秒。加入650l的Solution C,上下颠倒均匀混合。12000r/m离心1min。首先除去上层有机相,然后将下层水相溶液转移到1.5ml离心管上的Filter Cup中,12000r/m离心1分钟。除去F
12、ilter Cup,在过滤出的液体中加入450l的DB Buffer,混匀。 12000r/m离心1分钟洗脱DNA。检测DNA纯度。PCR扩增通用引物为: 16S1F: 5-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3 16S1R: 5-TACGGCTACCTTGTTACGACTT-3以提取的DNA为模板,进行PCR扩增,用以获得目的片段,PCR反应体系如下:PCR扩增体系(50l): 基因组DNA 2l dNTP(10mmol/L) 2l 10Buffer 5l 16S1F 2l 16S1R 2l Taq 酶(2.5U4il) 2l 双蒸水 35lPCR扩增条件:(35个循环) 94 预变
13、5min 94 1 min 56 30s 70 90s 72 延伸 lOmin反应终止后,取10lPCR产物,采用电泳检测拓增产物,分离出目的片段进行回收。 用凝胶回收试剂盒对扩增出来的序列进行收集,将扩增出目的片断的菌液进行序列测定。1.6.2 真菌种类的鉴定 挑取保存的菌株接种于马丁氏平板上，30条件下培养，用棉签刮取培养的真菌，置于装有1ml生理盐水的微量离心管中，制成1 麦氏浓度的菌液，于12 000rpm离心 1分钟，去掉上清，向菌体中加入600l山梨醇Buffer 和50U溶壁酶，充分混匀，30处理120min ,破除丝状真菌的细胞壁。本实验引物为针对真菌核糖体RNA基因序列的通用
14、引物Its1和Its4。Its1 的碱基序列为 5-TCCGTAGGTGAACCTGCGG-3Its4 碱基序列为5-TCCTCCGCTTATTGATATGC-3。反应体积为50l： 模板DNA 5l 引物Its1 1l 引物Its4 1l dNTP Mixture（各2.5mmol/L） 4l 10PCR Buffer 5l 5 U/l Taq酶 0.5l 灭菌蒸馏水 33.5l;反应条件: 94 预变性5min；94 30s、55 30 s、72 1 min，共30各循环，72延伸7min。2.1 真菌分离结果得到土壤最适稀释浓度为4 g 、10-2（图1），具体做法是称取4g土壤于200
15、ml三角瓶中，然后加入45ml蒸馏水，稀释到10-2。 图 1 土壤梯度浓度稀释 分离纯化到15株真菌，分别是J1、J3、J4、J5、J6、J8、J10、P1、P2、P3、P4、P5、P6、P7、C1（图2、图2.1）。以字母J开头编号的真菌是通过近自然法分离出来的，以字母P和C开头编号的真菌是通过普通法分离出来的。 图 2 病害土壤的分离出的真菌 图 2.1 病害土壤的分离出的真菌2.2 细菌分离结果得到114株细菌，编号分别是A1A50、B1B50、C1C14。2.3 拮抗菌筛选结果C1抑制P7，C11、B2抑制P6，A40抑制C1，A14、B45、B28抑制J3，A22抑制J4，C14抑
16、制J6，A5抑制J10；其中抑制作用比较明显的事C1，B2，B28，C14;抑制作用中等的是C11，A40，B45,;抑制作用最弱的是A14，A22。3讨论 中国西洋参连续种植土传病害问题制约了可持续发展的行业，用西洋参农药，虽然能缓解疾病的入侵，但长期使用化学杀虫剂和抗生素，对西洋参参种植场所和西部环境带来影响，不能有效地控制西部种植西洋参连作困扰问题，预防和控制西洋参土壤传染病方法已成为未来的发展趋势，开发生产生物防治人员准备在这方面大展宏图。本实验从西洋参根际土壤细菌从我国西洋参在西部有不同影响细菌的分离筛选，拮抗细菌初步分类在梯度板，面对分离细菌、西洋参土壤净化和9株拮抗菌株对病原菌的
17、拮抗作用不同。在筛选过程中本实验的困难也是显而易见的，J3、J8、J10等真菌都是些含有孢子的真菌，生长过程中孢子会乱飞，以至于抑菌实验中不能均匀的铺满整个平板，而导致细菌的抑菌圈不能明显的出现，为此我们改进了实验方案，直接在平板上涂布真菌的孢子，当然孢子的收集工作同时也加大了实验的难度。抗菌株C1、C11、B2、A14、B45、B28、A22、C14、A5。9种拮抗细菌。然后对九种细菌和七种真菌进行了种类鉴定，本实验的创新之处也在于此，首先做拮抗实验，确定出哪些细菌抑制哪些真菌之后再对菌种进行鉴定，此举可以有效减少工作量，本实验的意义就在于找出拮抗菌株，因为成功的抵抗作用将是未来研究的关键和
18、保护。参考文献：1 赵树清,载新荣.西洋参研究进展J.广东药学,2005,15(6):63-65. 2 王蕾,王英平,许世泉等.西洋参化学成分及药理活性研究进展J.特产研 究,2007,29(3):73-77.3 陈军辉,谢明勇,傅博强等.西洋参中无机元素的主成分分析和聚类分析 J.光谱学与光谱分析,2006,26(7):1326-1329.4 田义新.药用植物栽培学M.第3版.北京：中国农业出版社，2011. 5 马宝兰,秦绪花,史载祥,等.西洋参临床药理研究进展J.江西中医学院学 报,2011,23(5):88-92.6 金慧,于树莲,曹志强,等.老参地、农田改造,连续栽培人参、西洋参J世
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22、t: In order to look for ways to solve the Panax quinquefolium L. continuous cropping obstacle of biological control, we isolated four years living Panax quinquefolium L. disease soil fungi and bacteria, the fungus had 15 strains and cant save, bacteria get 114 strains preserved in 4 glycerin, early
23、screening is using bacteria fermentation bacteria suspension to detect whether to inhibit the growth of fungi, bacteria specific practice is in the middle of the fungi culture dish to fungi, even within the limits of a circle and then in fungi play six holes, inject different bacteria fermented liqu
24、id inside, one of the holes into the distilled water as ck, selected by the bacteriostatic experiment has inhibited the growth of the fungus bacteria C1 suppress P7 and C11, B2 inhibits P6, A40 inhibition of C1, A14, B45, B28 suppress J3 and A22 inhibit J4, C14 inhibit J6, A5 J10 inhibition,Will pro
25、duce antagonistic effect of species identification of bacteria and fungi, bacteria use 16 srna comparison method for identification of fungus ist alignment methods identified; The above results will clear the way for Panax quinquefolium L. industrial production, will also help to farmers planting gi
26、nseng, of course, also to the identification of bacteria species and the exploration of mechanism laid the foundation.Key Words:Panax quinquefolium L. ; antagonistic bacteria; dressing by screening致 谢首先感谢我的导师孙艳教授，本论文从最开始的选题，设计实验，实验材料的准备，以及器材的准备都是在孙老师的悉心帮助和指导下完成的，在此我要向老师表示诚挚的感谢。感谢指导和帮助我的硕士师姐王苗，从课题的选择到实验的最终完成，她们都始终支持、鼓励和帮助我。师姐不仅在科研方法和技术上给我以精心指导，同时她们的处世态度也深深影响着我，在此谨向王苗师姐致以诚挚的谢意。感谢我的大学同窗让我受益良多也成长不少，所有的经历都会是我人生中一笔不小的财富。本实验思路不是很复杂但工作量极大，凭我一个人根本无法完成，王苗师姐全力帮助上面已经说过，在此我还想感谢我的两个学妹宋卓怡和黄祖贤，感谢她们辛勤的付出，同时也非常敬佩她们对科研的严谨和热忱。 最后，我要感谢培养我四年母校陕西师范大学，毕业之后我一定会继续奋斗，为母校争光，回报母校。
