1、正常人外周血淋巴细胞凋亡受体的表达与细胞凋亡的关系正常人外周血淋巴细胞凋亡受体的表达与细胞凋亡的关系 作者：胡静, 何小军, 冯永东, 杨长永，韩中博, 龚建平【摘要】 本研究检测凋亡受体Fas、TNFR、TNFR在人外周血淋巴细胞(PBL)增殖进程中的表达情况及其细胞周期特异性，并探讨其与凋亡受体途径介导的细胞周期特异性细胞凋亡的关联性。应用双参数流式细胞术检测人外周血淋巴细胞在G0期和经植物凝集素刺激(PHA)进入细胞周期后Fas、TNFR、TNFR的表达情况和细胞周期特异性，同时检测肿瘤坏死因子 、抗Fas抗体诱导人外周血淋巴细胞的凋亡。 结果表明： 经植物凝集素刺激24小时后的外周血淋
2、巴细胞Fas、TNFR、TNFR表达率较G0期外周血淋巴细胞别离增加了（）%，（）%，（）%，均具有显著性不同(P<，而且主要表达在G1期； 未经植物凝集素刺激的外周血淋巴细胞停留在G0期，TNF 和anti Fas诱导后没有发生凋亡，而刺激后进入细胞周期的淋巴细胞经TNF 和anti Fas诱导后发生凋亡，其凋亡主要在G1期。 结论： 凋亡受体在外周血淋巴细胞中的表达与凋亡受体途径介导的细胞凋亡有明显的量效关系，凋亡受体途径介导细胞凋亡的细胞周期特异性与凋亡受体表达的细胞周期特异性有关，细胞凋亡的发生与细胞是不是进入细胞周期有关。 【关键词】 细胞周期 细胞凋亡 人外周血淋巴细胞 细胞
3、增殖Relationship of Apoptotic Receptor Expression in Normal Human Peripheral Blood Lymphocytes to Cell Apoptosis Abstract The aim of this study was to detect the expression and cell cycle specificity of Fas,TNFRand TNFR in human peripheral blood lymphocytes (PBL)， and to study the potential role of Fa
4、s ,TNFRand TNFR in cell cycle specific apoptosis. The improved double parameter flow cytometry was used to detect the expressions of Fas, TNFRand TNFR and cell cycle specificity in PBL which were incubated for 24 hours in the presence or absence of phytohaematoagglutinin (PHA) respectively. Apoptosi
5、s induced by IgM type anti Fas and TNF was detected by API method. The results showed that compared with PBL treated in the absence of PHA in G0 phase, the ratio of Fas, TNFRand TNFR expressions in PHA stimulated PBL entering cell cycle increased （）%，（）%，（）% respectively (P<, and mainly appeared
6、at G1 phase; no apoptosis was induced by anti Fas and TNF in G0 phase PBL cultured in the absence of PHA. On the contrary, the apoptosis was induced by anti Fas and TNF in PBL which entered cell cycle after stumulation with PHA and mainly initiated at G1 Phase. It is concluded that there is evident
7、dose effect relationship between apoptotic receptor and receptor mediated apoptosis. Moreover, the cell cycle specificity of receptor mediated apoptosis is correlated with the cell cycle specific expressions of apoptotic receptor. The induction of apoptosis by apoptotic factors (anti Fas and TNF ) d
8、epends on whether cell entering cell cycle or not. Key words cell cycle; apoptosis; human peripheral blood lymphocytes; cell proliferation J Exp Hematol 2007; 15(3):533-536 细胞周期是指持续割裂的细胞从一次有丝割裂结束到下一次有丝割裂完成所经历的整个进程，是细胞的增殖的基础。细胞凋亡是机体维持正常细胞群体数量稳态的重要手腕，它是基因调控的细胞程序性的死亡，是正常机体去除不需要的细胞的严格调控的生理进程1。细胞凋亡的途径主要包
9、括线粒体途径和凋亡受体途径。凋亡受体途径介导的细胞凋亡是细胞凋亡的重要途径之一，当凋亡因子（如FasL、TNF ）与凋亡受体（如Fas、TNFR、TNFR）结合后通过级联反映激活一系列的caspase，最终致使细胞凋亡2。本研究以人正常人外周血淋巴细胞（peripheral blood lymphocytes， PBL）细胞为研究对象，探讨凋亡受体在G0期PBL中和进入细胞周期后的PBL中的表达情况及其与凋亡受体途径介导PBL细胞凋亡之间的关联性。 中国实验血液学杂志 J Exp Hematol 2007; 15(3)人外周血淋巴细胞凋亡受体的表达与细胞凋亡的关系材料和方式 细胞及主要试剂 外
10、周血淋巴细胞(peripheral blood lymphocyte, PBL)取自健康志愿者。异硫氰酸酯荧光素(FITC)标记的膜联蛋白V(Annexin V)、植物血凝素(phytohaematoagglutinin, PHA)购自晶美公司， 肿瘤坏死因子(TNF )为英国EC公司产品，抗Fas抗体(Clone DX2)、FITC Fas、TNFR抗体、TNFR抗体是Becton Dickinson公司产品，淋巴细胞分离液为中国医学科学科院血液研究所产品。 细胞处置 取正常人外周血液10 ml，加等体积生理盐水，缓慢加于淋巴细胞分离液上， 300g离心20分钟后，取白膜层，加少量生理盐水，
11、 200g离心10分钟，将清洗干净的淋巴细胞别离置于2瓶含有10 ml/L的胎牛血清、抗生素（青霉素10104 U/L和链霉素100 mg/L）和RPMI 1640培育液中悬浮培育，1瓶加有丝割裂原植物凝集素（PHA），培育液中淋巴细胞应用终浓度为10 g/ml，刺激其生长割裂，另1瓶不加PHA，悬浮培育24小时。 PHA刺激的外周血淋巴细胞(3105/ml)别离加入TNF (50 ng/ml)、anti Fas g/ml)培育24小时后收获细胞；对照组(未加PHA的外周血淋巴细胞)做一样处置 Fas 、TNFR、TNFR表达和细胞周期特异性的检测 Fas、TNFR、TNFR的免疫荧光单标直接
12、标记法标记 离心去除细胞培育液，用PBS(pH 7. 4)洗涤，悬浮制成单淋巴细胞悬液(1106ml)，取50 l该悬液加入荧光FITI标记的单克隆抗体 l，对照组用PBS孵育，4避光反映1小时，用PBS 3 ml混匀， 80g离心10分钟，弃上清，用PBS再洗1次,用500 l PBS悬浮细胞，避光反映1小时后上流式细胞仪检测。 Fas、TNFR、TNFR表达的细胞周期特异性的免疫荧光双标直接标记法检测 前期Fas、TNFR、TNFR的标记同前，接着用1%不含甲醇的甲醛固定20分钟，用PBS 3 ml混匀， 80g离心10分钟，弃上清，用PBS再洗1次，加PI液500 l，避光反映1小时后上
13、流式细胞仪检测。 细胞凋亡周期特异性的API法检测 向收获细胞加入Annexin V FITC 5 l后， 室温避光30分钟，以预冷的binding buffer洗涤1次，加入1 ml 1%不含甲醇的甲醛，冰上固定30分钟后以binding buffer洗涤2次，加入 ml PI染液(50 g/ml PI， 500 g/ml digitonin， 10 mmol PIPES， 2 mmol CaCl2， mol NaCl)，1小时后上流式细胞仪检测。 统计学处置 应用SAS for windows统计分析软件进行t查验。 结 果 加入PHA的正常人外周血淋巴细胞进入细胞周期的鉴定 DNA直方图
14、显示处于静止期的外周血淋巴细胞加入PHA后进入细胞周期出现了明显的S、G2-M期细胞(图1)。 Figure 1. Cell cycle change of PBL cultured in the absence of PHA and PBL stimulated with PHA for 24 hours. Fas 、TNFR、TNFR表达 正常人外周血淋巴细胞经PHA刺激后Fas、TNFR、TNFR 表达明显增高，即FITC标记的荧光高度增加(图2) ，而且Fas、TNFR、TNFR 表达率较G0期PBL别离增加了（）%，（）%，（）%，不同均具有显著性(P<(图3)。 Fas 、T
15、NFR、TNFR表达的细胞周期特异性 经PHA刺激后，正常人外周血淋巴细胞Fas、TNFR、TNFR表达在G1期(图4)。 细胞凋亡的细胞周期特异性 TNF 、 anti Fas诱导的PHA刺激的外周血淋巴细胞，细胞凋亡发生在G1期，对照组未加PHA， 经TNF 、 anti Fas诱导24小时后，没有明显的凋亡细胞(图5)。 讨 论 增殖与分化是正常机体生命活动发展的一面，其中细胞周期是增殖的前提和基础3，凋亡则是机体生命活动衰退的一面。凋亡和增殖分化对立统一于正常机体的生命活动当中。以前研究表明，细胞凋亡是一个细胞周期事件4,5。凋亡受体途径介导细胞凋亡是凋亡发生的主要途径之一。在此途径中
16、，凋亡受体的表达和参与细胞周期途径中的主要物质，如细胞周期蛋白（cyclin)、依赖细胞周期蛋白的激酶（CDK）等起着重要的作用 2,6。可是，凋亡受体途径介导的细胞凋亡的细胞周期特异性与凋亡受体的表达是不是有关，凋亡受体途径介导的细胞凋亡与细胞周期的运行之间存在着何种关联，一直未得以阐明。鉴于此，本实验室通过对PBL的凋亡受体表达及其是不是进入细胞周期与诱导凋亡发生之间的关系进行了研究分析。 实验研究发现，在用TNF 、anti Fas别离诱导G0期PBL和经PHA刺激后进入细胞周期的PBL时，G0期细胞未发生凋亡，而进入细胞周期后的PBL能发生凋亡。这一证据有力地证明了细胞周期与细胞凋亡之
17、间的关系即细胞只有进入细胞周期后才能诱导其凋亡。这一现象与咱们在临床肿瘤化疗和生物学医治中发现G0期肿瘤的耐药和复发与G0期细胞存在有关是相吻合的 7。 在本实验进程中，咱们对正常人凋亡受体表达的周期特异性和凋亡受体介导的细胞凋亡的周期性进行了分析和比较发现，凋亡受体的表达和凋亡受体途径介导的细胞凋亡均发生在G1期。这一现象可能说明，凋亡受体虽然普遍存在PBL各期，可是只有表达在G1期PBL细胞膜上的凋亡受体才为有功能的受体。S期，G2/M期的细胞膜上虽然也有凋亡受体的存在，但它们因没有功能而不能与凋亡因子结合，从而不能参与凋亡受体介导的细胞凋亡。结合以前的研究咱们以为，只有G1期PBL细胞膜
18、上才存在有功能的凋亡受体，只有在此情况下凋亡受体的凋亡区域才具有自我聚集而形成三聚体的趋向，而在其他各期PBL细胞则没有该功能8。同时，虽然G0期PBL表达有功能的凋亡受体，但因PBL未进入细胞周期，所以凋亡受体介导的细胞凋亡也不能发生。这一现象说明凋亡受体介导PBL凋亡必需同时具有两个条件： 细胞膜上存在可以与凋亡因子相结合的有功能的凋亡受体； 细胞已进入细胞周期。这一观点从侧面反映了cyclin、CDK的活性在凋亡受体介导的细胞凋亡中的作用，同时也阐明了凋亡受体途径介导细胞凋亡的细胞周期特异性的可能发生机制，固然这一观点还需要进一步论证和具体论述。 在本实验中，咱们还发现正常人PBL进入细
19、胞周期后，其凋亡受体的表达量较G0期细胞表达量显著增加，说明凋亡受体途径介导的细胞凋亡与凋亡受体表达可能存在着量效关系，即凋亡受体途径介导的细胞凋亡率增加可能与细胞膜上凋亡受体的增加有关。而在临床肿瘤研究中发现，肿瘤转移与细胞膜表面上的凋亡受体表达量减少有关，从而逃避了凋亡因子诱导其凋亡9，10，本实验进一步论证了这一点。 综上所述，咱们以为凋亡受体的表达与凋亡受体途径介导的细胞凋亡及其细胞周期特异性有关，而细胞是不是进入细胞周期可能决定着细胞凋亡诱导成功与否。因为凋亡受体途径介导的细胞凋亡在肿瘤形成，自身免疫性疾病的发生和神经系统退化疾病的演变进程中担当着重要的角色 11 ，本实验研究结果为
20、通过调控凋亡受体介导的细胞凋亡而达到医治疾病的目的提供了靠得住的理论依据和方式。【参考文献】 1King KL, Cidlowski JA. Cell cycle and apoptosis: common pathways to life and death. J Cell Biochem, 1995; 58:175-1802Nagata S. Apoptosis by death receptor. Cell, 1997; 88:355-3653Hipfner DR, Cohen SM. Connecting proliferation and apoptosis in developme
21、nt and disease. Nat Rev Mol Cell Biol, 2004; 5:805-8154吴伟康. 细胞增殖、分化、凋亡异样与疾病. 见:陈主初.病理生理学. 北京:人民卫生出版社. 2005:17-335薛军，林茂芳. 调控抗凋亡基因 survivin 表达的因素研究. 中国实验血液学杂志，2005; 13:969-9746Borgne A, Golsteyn RM. The role of cyclin dependent kinases in apoptosis. Prog Cell Cycle Res, 2003; 5: 453-4597Fukuoka K, Usu
22、da J, Iwamoto Y, et al. Mechanisms of action of the novel sulfonamide anticancer agent E7070 on cell cycle progression in human non small cell lung cancer cells. Invest New Drugs 2001; 19:219-2278Huang B, Eberstadt M, Olejniczak ET, et al. NMR structure and mutagenesis of the Fas (APO 1/CD95) death
23、domain. Nature, 1996; 384(6610): 638-6419Owen Schaub LB, van Golen KL, Hill LL, et al. Fas and Fas ligand interactions suppress melanoma lung metastasis. J Exp Med, 1998;188:1717-172310Nagao M, Nakajima Y, Hisanaga M, et al. The alteration of Fas receptor and ligand system in hepatocellular carcinomas: how do hepatoma cells escape from the host immune surveillance in vivo? Hepato logy, 1999; 30:413-42111Shintani T, Klionsky DJ. Autophagy in health and disease: a double edged sword. Science, 2004; 306(5698):990-995
