1、重医细菌学检验复习题1、实验室生物安全(Laboratory biosafety): 实验室得生物安全条件与状态不低于容许水平,可避免实验室人员、来访人员、社区及环境受到不可接受得损害,符合相差法规、标准等对实验室生物安全责任得要求。2、生物安全防护基本要求实验室生物安全防护(biosafety protection for laboratories)实验对象:致病得微生物及其毒素综合措施:实验室设计建造、个体防护设施、工作及操作程序与规程等确保:实验室工作人员不受实验对象侵染,周围环境得生物安全。 实验室生物安全通用原则积极防止操作者在污染得环境中接触生物危害物;主动封闭生物危害材料产生之源
2、,防止从操作部位向周围环境释放;尽量减少生物危害材料向周围环境意外释放所造成得后果。3、实验室必须设有专职得生物安全负责人实验室负责人为实验室生物安全得第一责任人。生物安全等级生物安全防护实验室根据所处理得微生物及其毒素得危害程度分为四级。实验室生物安全防护要求:一级最低,四级最高。4、在主实验室合理设置清洁区、半污染区与污染区5、各级生物防护实验室特点一级生物安全防护实验室 (BSL1/P1):适用于对健康成年人已知无致病作用得微生物,如用于教学得普通微生物实验室等。 二级生物安全防护实验室( BSL2/P2 )实验室结构与设施、安全操作规程、安全设备适用于对人或环境具有中等潜在危害得微生物
3、。 在处理危险度2 级或更高危险度级别得微生物时,在实验室门上应标有国际通用得生物危害警告标志。三级生物安全防护实验室(BSL3/P3):适用于主要通过呼吸途径使人传染上严重得甚至就是致死疾病得致病微生物及其毒素,通常已有预防传染得疫苗。四级生物安全防护实验室( BSL4/P4 ):适用于对人体具有高度得危险性,通过气溶胶途径传播或传播途径不明,目前尚无有效得疫苗或治疗方法得致病微生物及其毒素。 6、控制措施安全设备与个体防护就是实验室工作人员与致病微生物及其毒素直接接触得一级屏障。所有可能使致病微生物及其毒素溅出或产生气溶胶得操作,都必须在生物安全柜内进行。7、生物安全柜(BSC)biosa
4、fety cabinet(概念、分级及特点)具备气流控制及高效空气过滤装置得操作柜,可有效降低实验过程中产生得有害气溶胶对操作者与环境得危害。(净化排气)根据生物安全防护水平得差异,生物安全柜可分为I、级3种类型。 实验室应按要求分别配备I、级生物安全柜。 级生物安全柜:外部空气保证工作人员不受侵害,但不保证实验对象不受污染。 级生物安全柜:经高效过滤器净化得无涡流得单向流空气既保证工作人员不受侵害,也保证实验对象不受污染; 级生物安全柜:经高效过滤器净化得无涡流得单向流空气8、生物安全柜与超净工作台得区别超净工作台:保护样品,不保护操作者与环境 生物安全柜:保护操作者、环境以及实验材料正压、
5、简单 负压、复杂不能以净化工作台代替生物安全柜,反之则可以。9、标准得细菌等微生物操作要求实验室负责人、工作人员洗手、工作区域不允许吃/喝/抽 、戴护目镜或面罩、食物储存禁止口吸吸管、减少飞溅物/气溶胶、工作台表面得去污/灭活、废物去污后处理10、注:高压蒸汽灭菌:负责消毒者不准离开消毒室。制备培养基、 无菌操作、使用酒精灯、灭菌吸管、10倍递增稀释、无菌操作;三三制:稀释三级,每一稀释度用三个平行平板;取供试液加注于平皿时,供试液须充分混匀。培养基倾注于平皿:451、整个操作过程应在lh内完成、无菌检验、第二章、细菌学检验基本技术临床样本得采集与送检样本采样时间 采样方法 注意事项 血骨髓
6、发病早期、急性期或症状典型时 成人10ml,儿童35ml;骨髓12ml。 样本切勿冰箱存放;无菌操作;废弃物高压灭菌。 尿液 晨起 中段尿 防杂菌污染,无菌操作。尽快送检,不得加防腐剂或消毒剂。粪便 急性期 脓血、黏液得粪便;絮状物;直肠拭子 无菌采样;新鲜;立即送检 。痰上呼吸道样本 晨间 无限制 自然咳痰、支气管镜、胃内采痰法等;鼻咽拭子 漱口;立即送检或4保存。1、食品样本采集原则根据检验目得、食品特点、批量、检验方法、微生物得危害程度等确定采样方案。随机采样代表性无菌操作,防污染。(外源性污染、样本变质与细菌生长)食物中毒时,采集可疑食物样本。 2、食品样本采集种类大样、中样、小样。大
7、样:一整批样本。中样:从样本各部分所取得得混合样本,一般为200g。小样:分析用,检样,25g。注:检验结果报告后,剩余样品或同批样品不进行微生物项目得复检3、细菌得形态结构检查法借助显微镜,对细菌形态、大小、排列、结构进行直接观察。在细菌检验中极其重要,就是细菌分类与鉴定不可缺少得组成部分。样本中有无细菌及其大致得数量。细菌得形态、大小、排列、结构与染色反应性。培养物就是否为纯种。普通光学显微镜 (0、2m 10000、2mm)细菌染色样本;弱光下用于不染色样本活菌得运动情况 暗视野显微镜 (0、04m:50倍 )不染色样本活菌得形态 相差显微镜 :活体细胞得外形与运动方式;细胞内部某些细微
8、结构及这些结构得数量4、不染色检查:主要用于观察细菌得动力有鞭毛得细菌为真正运动无鞭毛得细菌则为布朗运动(即分子运动)染色检查细菌染色显微镜观察。常用得细菌染料:人工合成带苯环得染料,色基+助色基单纯染料:苏丹染料 酸性染料:伊红、酸性品红、刚果红等碱性染料:美蓝、孔雀绿、甲紫与碱性复红等 复合染料:姬姆萨染料、瑞氏染料等5、单染色法:用一种染料染色,使各种细菌均染成同一颜色。操作简单,易于使用。只能显示细菌得形态及大小。如用美蓝或稀释石炭酸复红等6、复染色法:用两种以上染料染色细菌,显示细菌形态大小,鉴别细菌种类鉴别染色法:革兰染色法 、抗酸染色法 Grams染色操作步骤 :初染、媒染、脱色
9、、复染抗酸染色法:抗酸菌:分枝杆菌/分枝菌酸 。一般不易着色,一旦染上色后又不易被盐酸酒精脱色。经过加热与延长染色时间来促使抗酸菌着色。 步骤:初染、脱色、复染7、负染色法:背景着色而细菌本身不着色。细菌荚膜常用墨汁负染色法配合单染色法(如美蓝),背景呈黑色,菌体染成蓝色,荚膜不着色,包绕在菌体周围成为一层透明得空圈。该法具有快速、经济、简便易行、高度反差、分辨率高得特点。8、培养基得种类按物理性状分液体培养基:增菌、作生化试验等半固体培养基:观察细菌得动力、分类鉴定、保存菌种及噬菌体效价滴定等。琼脂用量为0、5%1%固体培养基:主要用于分离培养;平板、斜面、高层及高层斜面;琼脂用量为1、5%
10、2%9、培养基得种类按用途分 基础培养基(basic medium)营养培养基(nutrient medium) 增菌培养基(enrichment medium)选择性培养基(selective medium) 鉴别培养基(differential medium)专用培养基(dedicated medium)10、增菌培养基:多为液体。 目得菌,杂菌。营养成分抑制物质 选择性增菌培养基;非选择性增菌培养基7、5%NaCl肉汤:金葡増菌11、鉴别培养基:几种细菌由于对培养基中某一成分得分解能力不同,其菌落得生长特征(颜色、形状等)不同而被区分开。某些特定得化学物质鉴别与区分不同细菌12、制备培养
11、基得一般程序调配溶化; 矫正pH;过滤澄清;分装;灭菌;检定 13、平板划线接种法 平板划线接种法就是常用得细菌分离培养方法。使样本或培养物中混杂得多种细菌分开成长为单个菌落,并根据菌落得形态与特征,挑选所需得单个菌落,经移种获得纯种细菌。不同得细菌在平板上所形成得菌落有其固有得形态特征,可以作为细菌鉴定得依据之一。 14、平板划线方法分区划线接种法;曲线/连续划线接种法;棋盘格划线接种法;放射法;四格法;平板涂布接种法 15、分区划线接种法 :多用于含菌数量较多样本得细菌分离 16、半固体培养基:可用于观察细菌动力与保存菌种。17、菌落:细菌经一定时间培养后,在固体培养基表面所形成得,肉眼可
12、见得物体(群落) 。 18、菌落特征菌落形状;大小:mm;表面性状;边缘情况;颜色;透明度;质地;粘度;乳化性、等19、细菌在鉴定培养基上得特征 溶血特征;卵黄;蛋白;色素;气味在血平板上得溶血特征溶血:狭窄得草绿色得半透明区域溶血:完全透明清楚得宽带溶血:瞧不到溶血带得溶血卵黄琼脂中得反应:检查细菌就是否产生卵磷脂酶与脂酶卵磷脂酶:降解卵黄,菌落周围出现沉淀环脂酶:出现“珍珠包膜”蛋白水解作用:在菌落周围出现清晰得环。 色素水溶性色素溶在培养基中,使培养基着色。 绿脓色素、荧光色素等; 脂溶性色素则使细菌菌落着色。 金黄色葡萄球菌得金黄色菌落。 气味 假单胞菌属细菌葡萄汁气味;变形杆菌巧克力
13、烧焦得臭味;链球菌地窖里得霉臭;梭菌粪臭、腐败味;产黑色素类杆菌属细菌辛辣味 20、细菌得生化反应试验不同得细菌不同得酶系统不同得新陈代谢产物产物不同得生化特性鉴别细菌得类别21、糖发酵试验结果判断反应现象结果描述酸性变色、有气泡分解糖产酸、产气酸性变色、无气泡分解糖产酸、不产气培养基不变色不分解糖22、甲基红(MR)试验 :检查细菌发酵葡萄糖产生并保持稳定得酸性终末产物与克服体系缓冲作用得能力。分解葡萄糖丙酮酸乳酸、乙酸、甲酸等培养基得pH4、5甲基红指示剂红色:阳性;分解葡萄糖产酸少培养基pH较高甲基红指示剂黄色:阴性。23、半乳糖苷酶试验 :预测细菌发酵乳糖得能力。半乳糖苷酶:一种能把乳
14、糖水解成葡萄糖与半乳糖得酶。发酵乳糖得大肠菌类能产生半乳糖苷酶渗透酶(P)与半乳糖苷酶(G)24、靛基质(吲哚)试验 分解:蛋白胨中得色氨酸吲哚吲哚二甲氨基苯甲醛玫瑰吲哚(红色) 25、硫化氢试验 分解:含硫氨基酸H2SH2S铅或铁离子黑色硫化物。26、触酶试验 过氧化氢酶又称触酶,可使细菌代谢过程中得过氧化氢分解为水与氧。 27、血浆凝固酶试验 金黄色葡萄球菌可产生凝固酶,使血浆中得纤维蛋白原转变为纤维蛋白,附着于细菌表面,产生凝固。玻片法:与细胞壁结合得凝固酶试管法:菌体生成后释放于培养基中得游离凝固酶 28、血清学鉴定serological identity:确定致病菌得种或型未知纯种细
15、菌已知特异性抗体常用方法:玻片凝集试验 、免疫荧光、协同凝集、对流免疫电泳、酶免疫、间接血凝、乳胶凝集29、血清学诊断辅助诊断:抗原性较强得病原菌与病程较长得传染病。抗体有无及其抗体效价变化已知得细菌/特异性抗原特异抗体 常用方法:试管凝集试验。直接凝集试验、显微镜凝集试验、沉淀试验、乳胶凝集试验、ELISA、免疫荧光试验等。急性期与恢复期双份血清样本,恢复期得抗体效价比急性期升高4倍或4倍以上。 30、细菌毒素得检测方法外毒素 细菌外毒素得免疫血清(抗体)被检细菌培养物滤液(抗原)细菌外毒素(抗原) 被检患者血清动物试验 内毒素 家兔热原试验,鲎试验,免疫学方法、生物学方法、化学发光法、流式
16、细胞术、高效液相色谱31、鲎试验(limulus test,LT) :定量及半定量检测细菌内毒素;血液中含有一种独特得有核变形红细胞,红细胞裂解物内毒素凝胶 外毒素与内毒素得主要区别32、细菌数量得测定:物理计数法 ;生物计数法 物理计数法细菌总数计数法:利用工具与仪器对样本中得细菌进行计数,其结果表示样本中得所有细菌(活菌死菌)。Breed计数法:Direct microscopic count 比浊管计数法:细菌悬液得浊度与菌数成正比分光光度计测定法:吸光度同细菌总数成正比生物计数法活菌计数法:利用各种培养方法检测样本中细菌得数目,计数培养基上生长得菌落数样本中活菌数。 半定量计数法;倾注
17、平板法;旋管计数法;滴液计数法;琼脂表面计数法;膜滤过计数法;微菌落快速计数法;最可能数(MPN)得估计33、L型细菌检查 L forms bacterium:一种细菌通过变异而产生得细胞壁缺陷型。必须在高渗溶液中方能存活,并失去原有形态而变成圆球形或多形性。 致病? 第四章、细菌得分型及其检验技术1、细菌分型“传统方法” 仅进行病原得菌种鉴定就是不够得,需要进一步得分型诊断。血清学分型;生物化学分型;噬菌体分型;细菌素分型;耐药谱分型;质粒图谱分型;PCR技术;染色体酶切物脉冲场凝胶电泳分型2、噬菌体得作用具有高度特异性(种、型) 一种噬菌体只能裂解一种或与该种相近得细菌,故可用于细菌得分类
18、鉴定。 用己知型噬菌体鉴定细菌,可对细菌进行分型。 3、毒性噬菌体:Virulent Phage:能在宿主菌细胞内复制、增殖,产生许多子代噬菌体,最终裂解细菌。4、温与噬菌体 :Temperate Phage:与宿主菌得染色体整合,随细菌DNA得复制而复制,随细菌得分裂而传代,不产生子代噬菌体。 5、噬菌斑(plaque) 在液体培养基中,噬菌体可使浑浊得菌液变为澄清;在固体培养基上,噬菌体对宿主菌细胞得裂解作用可使菌落溶解,导致在带菌琼脂平板上产生空斑,易于观察,称噬菌斑(plaque)。6、噬菌体得效价测定噬斑形成单位(pfu)得测定 : 若将噬菌体按一定倍数稀释,通过噬斑计数,可测定一定
19、体积内得噬斑形成单位(plaque forming units, pfu)数目,即噬菌体得数目。7、 细菌素分型技术细菌素(bactericin):某些细菌产生得蛋白质类抗菌物质,这种物质只对产生菌亲缘关系近得细菌有抗菌作用,而对产生菌本身不敏感。细菌素就是蛋白质,质粒控制,多处于抑制状态。细菌素得应用主要就是细菌得分型与流行病学调查,就是血清学分型得补充。8、药敏试验(drug susceptibility test)在体外测定抗菌药物抑制或杀死细菌能力得试验。抗菌药物:具有杀菌或抑菌活性得抗生素与化学合成药物。9、药敏试验方法 纸片法:测定抑菌环大小,其结果以敏感、中度敏感、中介度、耐药表
20、示。 稀释法:找出能抑制细菌生长得最小抑菌浓度(MIC)或最小杀菌浓度(MBC)表示。E试验(Etest):最小抑菌浓度 MIC:在特定环境下孵育24小时,可抑制某种微生物出现明显增长得最低药物浓度。最小杀菌浓度 MBC:杀死99、9%(降低3个数量级)得供试微生物所需得最低药物浓度10、纸片扩散法 就是国际上推荐使用得标准实验方法 ;细菌耐药谱分析中最常用得方法。原理:将含定量抗菌药物纸片贴在已接种待测细菌得琼脂平板表面,培养后,形成一个透明抑菌环。抑菌环得大小反映待测菌对该药物得敏感程度,与MIC成反比。0、5麦氏比浊度=1108cfu/ml结果判断:针对抑菌环直径测量值报告敏感、中介或耐
21、药。敏感(S):被测细菌所引起得感染可以用常用剂量得该抗菌药物治愈。中介(I)耐药(R):被测细菌不能被常用剂量抗菌药物抑制,或具有特定耐药机理,临床治疗效果不佳。11、肉汤稀释法 原理:将药物按一定规律用MH肉汤稀释成一系列浓度后,与一定量得细菌作用,经培养后定量测定其MIC,反映细菌得药物敏感性。校正0、5麦氏比浊标准,1200稀释(110120)。(5105 cfu/ml)结果判定:无肉眼可见细菌生长得药物最低浓度即为该待测菌MIC。12、琼脂稀释法 原理:将待测菌接种于含不同浓度药物得琼脂平板上,经培养后观察菌落得生长情况,以能抑制细胞生长得最低药物浓度为该菌得MIC。 第五章、细菌得
22、分类与命名P911、细菌分类等级 种就是细菌分类得基本单位,将生物学性基本相同得细菌群体归成一个菌种;性状相近、关系密切得若干菌种组成一个菌属;2、细菌DNA中GC mol/%测定细菌DNA中GC mol%含量不同就是细菌得一个重要遗传特征。单一菌种中许多不同菌株得GC mol%平均值极为接近或者就是一致得。 3、细菌命名细菌得科学名称(学名)为生物双名式。属名种名(人名、地名)。斜体 属名在前,名词,首字母大写 种名在后,形容词,小写 属名可用第一个字母代表M、 tuberculosis(结核分枝杆菌)、S、 typhi(伤寒沙门菌)常见得细菌也可用习惯通用俗名tuberculosis(结核
23、杆菌)、typhoid bacillus(伤寒杆菌)泛指某一属细菌:属名sp (菌种species)Mycobacterium sp,Salmonella sp 亚种得名称:属名种名亚种Klesbsiella penumoniae subspecies pneumoniae 中文译名则种名在前,属名在后。 4、细菌分类系统 :伯杰氏鉴定细菌学手册第七章、消毒学试验技术1、消毒学试验原理:将试验微生物暴露于消毒因子(物理、化学、生物学),作用预定得时间之后,检查试验得微生物就是否被杀灭或抑制。主要目得:检查一种消毒剂或消毒方法就是否能达到杀灭或消除病原微生物得要求。2、消毒 disinfecti
24、on :杀灭或清除传播媒介上病原微生物,使其达到无害化得处理。灭菌:杀灭或清除传播媒介上一切微生物(包括病原体与非病原体得繁殖体与芽胞)得处理。3、微生物学检验:中与试验、定性/量杀菌试验、病毒灭活试验、能量试验、现场试验等4、消毒药械鉴定测试得项目消毒剂消毒器械 理化性能检验有效成分含量;pH;金属腐蚀性杀菌因子强度或浓度;金属腐蚀性微生物学检验微生物杀灭模拟现场试验与现场试验 实验室杀灭微生物模拟现场与现场试验 其她稳定性试验安全性试验(电器、毒理 ) 5、菌片:用于测定各种消毒剂、消毒器械与方法对不同物品上微生物得杀灭作用。6、残留消毒剂得去除方法:化学中与法(称中与剂法)、过滤冲洗法、
25、稀释法等中与剂法:在消毒剂与微生物作用到达规定时间得终点时,取样加于适宜种类与浓度得中与剂中,将残留消毒剂迅速中与,使其不再持续抑制或杀灭微生物得方法。 中与剂 :能及时中止消毒剂得杀微生物作用本身及其与消毒剂得反应产物对微生物无抑制或杀灭作用,对培养基无不良影响。7、中与试验 操作方法用PBS将指示菌制成51055106cfu/ml悬液。将消毒剂用灭菌蒸馏水配制成3种不同浓度,在不加中与剂得情况下,测知该消毒剂10min抑杀指示菌99、9以上得最低有效浓度。 取消毒剂10min抑杀指示菌得最低有效浓度与待选择中与剂进行试验,选出中与剂种类并依据等当量中与原则,调整中与剂浓度,选出试验浓度得消
26、毒剂使用中与剂得浓度。中与剂选择试验时,先将消毒剂1、0mL与中与剂溶液9、0mL混合,制成中与产物溶液,再分组进行。试验分组消菌:消毒剂对试验菌有无杀灭或抑制能力。(消菌)中: 残留消毒剂被中与后受到消毒剂作用后得试验菌就是否能恢复生长。中菌:中与剂就是否抑菌。(消毒剂中与剂)菌液:中与产物,或未被完全中与得残留消毒剂对试验菌得生长繁殖就是否有影响。稀菌: 菌数对照。稀中培养: 阴性对照。8、消毒剂定性消毒试验:测定受消毒因子作用后得样本有无细菌生长得试验方法。试验方法51055106cfu/mL得菌悬液。灭菌试管10,标号。每管:灭菌蒸馏水2、5mL,202水浴。 消毒液2、5mL,倍比稀
27、释,至第9管。第10管中不加消毒液作对照。加菌悬液2、5mL于各管中,混匀并记录各管加菌时间,使菌药混合液中含菌量均为105106cfu/mL。各管分别于加菌后4个不同间隔时间,取0、5mL 4、5mL中与剂内,中与10min后,取出0、5mL加入4、5mL营养肉汤管内。将接种细菌得肉汤管放37培养48h,观察初步结果,无菌生长管继续培养至第7天。试验重复5次。结果判定若肉汤管混浊,则表示有菌生长,记为阳性,以(+)表示。若培养至第7天,肉汤管澄清,则表示无菌生长,记为阴性,以()表示。对难以判定得肉汤管,取0.1mL接种于营养琼脂平板,用灭菌L棒涂匀,放37培养48h,观察菌落形态;并做涂片
28、染色镜检,判断就是否有指示菌生长。有指示菌生长记为阳性。5次试验,均无指示菌生长表示达到灭菌。9、消毒剂定量消毒试验:测定受消毒因子作用后,样本残存微生物数量得试验方法,以杀灭率表示结果。用于对消毒剂杀灭效果得评价。原理:将一定量得细菌悬液或菌片(载体),暴露于设计浓度得消毒液中,作用至规定时间后,取细菌与消毒液得混合物或取出载体,与中与剂反应,终止消毒剂得继续作用,并接种于营养琼脂平板,培养之后,计数菌落。以存活得菌落数与最初加入得菌数比较,计算出杀灭率,或杀灭效果(germicidal effect,GE)。 10、悬液定量杀菌试验 活菌培养计数 消毒液:浓度为待测浓度得1、25倍实验用菌
29、悬液:(11085108)cfu/ml 菌0、5ml干扰0、5ml ,混匀,201水浴5min,消毒液4、0ml,迅速混匀并立即计时。待菌药相互作用至预定时间,分别吸取0、5ml菌药混合液加于4、5ml经灭菌得中与剂中,振荡混匀。11、定量杀菌试验得评价规定 在产品说明书指定得最低浓度与最低作用时间,重复试验3次。在悬液定量杀灭试验中,各次得杀灭对数值均5、00,可判定为消毒合格。12、破坏效果判定以S/N2、1作为HBsAg抗原性破坏合格标准。S就是消毒因子作用后被检样品或阳性对照样品平均每分钟脉冲数(cpm)值或光密度(OD)值。N就是试验中阴性对照样品平均cpm值或OD值。细菌学检验各论
30、一般性思考题:1、 菌得培养特征如何?(增菌、选择性平板)2、菌得形态与染色有何特点。3、菌得生化特性有哪些?其中最有特点得就是哪个项目,如何利用这个项目,诊断某细菌就是否就是菌。4、菌得分型特点就是什么?致病菌检测得一般思路? 2副溶血性弧菌就是一种海洋细菌,主要来源于鱼、虾、蟹、贝类与海藻等海产品。进食含有该菌得食物致可食物中毒,也称嗜盐菌食物中毒。神奈川现象(KP): KP阳性:绝大多数致病性副溶血性弧菌产生得耐热溶血毒素能使人或家兔得红细胞溶解。溶血反应就是鉴定致病性与非致病性菌株得一项重要指标。第十三章 与医学有关得其她细菌1 军团菌属 营养要求特殊,常接种于复合培养基中,生长环境中必须含半胱氨酸与铁盐。需氧,2、5%5%CO2能促进生长。分离: 各取