1、结核分枝杆菌的试验室诊断结核分枝杆菌的试验室诊断安徽省立医院检验科安徽省立医院检验科 马筱玲马筱玲1结核疫情及诊断进展结核疫情及诊断进展 2l黛玉脸色苍白，瘦骨嶙峋，经不断咳嗽及吐血后，香消玉殒，结束了一场哀怨凄绝的爱情故事。3我国结核病疫情我国结核病疫情 全球结核病第二高负担国家，全球结核病第二高负担国家，结核病疫情表现有结核病疫情表现有“六多六多”。一、感染人数多5.5亿人感染过结核菌，约占全国人口 的45，高于全球平均水平。二、患病人数多活动性肺结核、传染性肺结核患病率 分别为367/10万和122/10万，三、新发患者多全国每年新发活动性肺结核患者145 万，其中传染性 肺结核患者65
2、万。四、死亡人数多全国每年约有13万人死于结核病。五、农村患者多全国约有80的结核病人集中在农村，主要在经济不发达的中西部地 区。六、耐药患者多全国结核病耐药率高达28。4结核病实验室结核病实验室诊断方法介绍诊断方法介绍5概述l结核病人的细菌学检查不仅是发现传染源的主要途径和手段，也是结核病确诊和制订抗痨方案，考核疗效、评价治疗效果的可靠标准。l由于结核菌的遗传特性决定其生长周期长，致使常规细菌学检查方法存在着灵敏度低、操作复杂，需时间较长和影响因素较多，不易标准化等缺陷，使细菌学诊断发展缓慢，无法充分满足临床诊断的需要。6实验室诊断方法l病原学诊断病原学诊断l辅助诊断辅助诊断 7病原学诊断病
3、原学诊断一、涂片抗酸染色镜检法，二、液基夹层杯结核杆菌检验三、荧光染色法四、培养法 五、液体培养显微镜观察药敏试验液体培养显微镜观察药敏试验六、快速培养检测法，七、色谱法 八、分子生物学法 九、噬菌体生物扩增法九、噬菌体生物扩增法8一、涂片抗酸染色镜检法：一、涂片抗酸染色镜检法：l国内大多采用厚涂片，比薄涂片法可提高阳性率；涂片萎尼抗酸染色法能保存较久，可备复查；l因费时、繁琐，综合医疗单位常因重视不够，致涂阳检出率低于5%，专业机构涂阳率可达到30%。l国外痰涂片阳性率可达30%40%，反复多次查，可增加到65%75%；9涂片优点涂片优点：简便、快速、价廉简便、快速、价廉 10 涂片的缺点涂
4、片的缺点l l敏感性低：敏感性低：敏感性低：敏感性低：500050001000010000条菌条菌条菌条菌mlmll l特异性差：所有分枝杆菌均可着色特异性差：所有分枝杆菌均可着色特异性差：所有分枝杆菌均可着色特异性差：所有分枝杆菌均可着色l l无法区别死菌与活菌：结果均为阳性无法区别死菌与活菌：结果均为阳性无法区别死菌与活菌：结果均为阳性无法区别死菌与活菌：结果均为阳性11痰菌假阴性原因l病变是封闭或开放；l病变性质和其中能够排出的菌量和排出时间间歇；l结核分枝杆菌形态多样性；12二、二、液基夹层杯结核杆菌检验液基夹层杯结核杆菌检验工作原理工作原理 将经过消化灭活处理液处理的痰液、或其他体液
5、标本混悬将经过消化灭活处理液处理的痰液、或其他体液标本混悬液置于具有符合光学要求基片的夹层杯中，经过专业离心机液置于具有符合光学要求基片的夹层杯中，经过专业离心机离心将混悬液中细菌或细胞牢固附着基片上，并在夹层杯中离心将混悬液中细菌或细胞牢固附着基片上，并在夹层杯中直接染色后取出基片在载波片上封片，置显微镜下观察。直接染色后取出基片在载波片上封片，置显微镜下观察。13优点：优点：1、操作方便，易于掌握。、操作方便，易于掌握。2、片中结核菌分布均匀，染色效果清晰、片中结核菌分布均匀，染色效果清晰3、液基结核菌制片技术较离心浓缩集菌法有显著提、液基结核菌制片技术较离心浓缩集菌法有显著提高：高：该方
6、法将所有消化后标本的抗酸杆菌均完整地保留于液基薄片中，从而显著提高了检出率。4、安全性有所提高：、安全性有所提高：消化，制片，烤片，染色均在彭氏杯中完成，操作人员不直接接触标本。采用结核专用消化液，可有效杀灭结核分支杆菌，更好的提高了操作的安全性。14三、荧光染色法：荧光染色法：l是涂片法中阳性率较高，较快速的方法，是涂片法中阳性率较高，较快速的方法，l集菌与荧光染色相结合，则荧光显微镜下的抗集菌与荧光染色相结合，则荧光显微镜下的抗酸杆菌阳性率可达酸杆菌阳性率可达50%，l荧光法的缺点：荧光法的缺点：假阳性率较高，假阳性率较高，保存时间短，不到保存时间短，不到4个月个月15四、培养法l一般都用
7、改良罗氏固体培养基一般都用改良罗氏固体培养基l接种后第接种后第3第第7天观察，以后每周观察一天观察，以后每周观察一次菌落生长情况，第次菌落生长情况，第8周若仍无生长，报周若仍无生长，报告为阴性。告为阴性。l优点：准确，优点：准确，灵敏度略高于涂片法；可灵敏度略高于涂片法；可以鉴定死菌与活菌；可进一步进行菌种以鉴定死菌与活菌；可进一步进行菌种鉴定和药敏试验鉴定和药敏试验.l缺点：诊断周期长，最快也需要缺点：诊断周期长，最快也需要6周。周。l有一定的污染率有一定的污染率1617培养假阴性的原因l个别细菌营养要求的特异性；l细菌和细菌营养代谢异质性；l细菌培养前处理对细菌活性影响；18分枝杆菌药物敏
8、感性试验l绝对浓度法检测分枝杆菌药敏实验是采用含药罗氏培养基进行的。常用药物终浓度（g/ml）l _表 1 绝对浓度法含药培养基中的药物终浓度_ l 药 物 浓 度（g/ml）l 低浓度 高浓度 l异烟肼 1g/ml 10g/mll利福平 1g/ml 10g/mll链霉素10g/ml 100g/mll乙胺丁醇 5g/ml 50g/ml l对氨基水杨酸 1g/ml 10g/ml l氨硫脲 10g/ml 100g/ml l乙硫异烟胺 25g/ml 100g/ml l卡那霉素 10g/ml 100g/mll卷曲霉素 10g/ml 100g/mll 紫霉素 10g/ml 100g/ml l氧氟沙星 5
9、g/ml 50g/mll左氧氟沙星 5g/ml 50g/mll环丙沙星 5g/ml 50g/mll司帕沙星 5g/ml 50g/mll力克肺疾 1g/ml 10g/mll丁胺卡那 10g/ml 100g/mll 19检测方法l 1菌悬液的制备l 2.接种及培养l3.结果判定与报告 l敏感（一）：含药培养基上无菌落生长。l 报告菌落数：当含药培养基上菌落数在20个以下时，报告菌落个数。l耐药（1+）：含药培养基上菌落数约占斜面面积1/4；l耐药（2+）：含药培养基上菌落数约占斜面面积1/2；l耐药（3+）：含药培养基上菌落数约占斜面面积3/4；l耐药(4+)：含药培养基上菌落呈菌苔样生长。20本
10、法弊端本法弊端 l l操作繁琐操作繁琐l l需时久，需时久，4周周l l结果准确性差结果准确性差21五、液体培养五、液体培养显微镜观察药敏试验显微镜观察药敏试验l l是是是是20002000年建立的一种痰标本液体培养结合显微镜观察技年建立的一种痰标本液体培养结合显微镜观察技年建立的一种痰标本液体培养结合显微镜观察技年建立的一种痰标本液体培养结合显微镜观察技术。其原理是术。其原理是术。其原理是术。其原理是MTBMTB含有索状因子，因此其在液体培养基含有索状因子，因此其在液体培养基含有索状因子，因此其在液体培养基含有索状因子，因此其在液体培养基中生长时分泌索状因子，形成索状特征性结构，利用倒中生长
11、时分泌索状因子，形成索状特征性结构，利用倒中生长时分泌索状因子，形成索状特征性结构，利用倒中生长时分泌索状因子，形成索状特征性结构，利用倒置显微镜观察索状结构可用于置显微镜观察索状结构可用于置显微镜观察索状结构可用于置显微镜观察索状结构可用于MTBMTB的快速诊断。由于液的快速诊断。由于液的快速诊断。由于液的快速诊断。由于液体培养基营养丰富，因此体培养基营养丰富，因此体培养基营养丰富，因此体培养基营养丰富，因此MTBMTB生长迅速，使生长迅速，使生长迅速，使生长迅速，使MTBMTB的培的培的培的培养时间显著缩短，培养阳性率显著增加。该法还能在培养时间显著缩短，培养阳性率显著增加。该法还能在培养
12、时间显著缩短，培养阳性率显著增加。该法还能在培养时间显著缩短，培养阳性率显著增加。该法还能在培养的同时直接进行临床标本的直接药敏试验，因此能显养的同时直接进行临床标本的直接药敏试验，因此能显养的同时直接进行临床标本的直接药敏试验，因此能显养的同时直接进行临床标本的直接药敏试验，因此能显著缩短从临床标本到耐药性测定的所需时间，这是其它著缩短从临床标本到耐药性测定的所需时间，这是其它著缩短从临床标本到耐药性测定的所需时间，这是其它著缩短从临床标本到耐药性测定的所需时间，这是其它传统方法所不具有的，也是传统方法所不具有的，也是传统方法所不具有的，也是传统方法所不具有的，也是MODSMODS的最大优点
13、。的最大优点。的最大优点。的最大优点。22液体培养液体培养+显微镜观察显微镜观察23结结 论论l l本试剂检测简便，快速，本试剂检测简便，快速，本试剂检测简便，快速，本试剂检测简便，快速，3 3 3 3天就可获得多耐药结核杆菌天就可获得多耐药结核杆菌天就可获得多耐药结核杆菌天就可获得多耐药结核杆菌的检测结果，同时具有较高的敏感性和特异性，与常规的检测结果，同时具有较高的敏感性和特异性，与常规的检测结果，同时具有较高的敏感性和特异性，与常规的检测结果，同时具有较高的敏感性和特异性，与常规方法符合率较高，可用于多耐药结核病的快速检测。方法符合率较高，可用于多耐药结核病的快速检测。方法符合率较高，可
14、用于多耐药结核病的快速检测。方法符合率较高，可用于多耐药结核病的快速检测。l l痰标本直接药敏试验比常规方法提早痰标本直接药敏试验比常规方法提早痰标本直接药敏试验比常规方法提早痰标本直接药敏试验比常规方法提早6 6 6 68 8 8 8周，更具有快周，更具有快周，更具有快周，更具有快速诊断价值。速诊断价值。速诊断价值。速诊断价值。l l本试剂费用低廉，不需特殊仪器设备，适合基层推广应本试剂费用低廉，不需特殊仪器设备，适合基层推广应本试剂费用低廉，不需特殊仪器设备，适合基层推广应本试剂费用低廉，不需特殊仪器设备，适合基层推广应用。用。用。用。l l本法安全、对预防耐药结核病的流行与传播、防止实验
15、本法安全、对预防耐药结核病的流行与传播、防止实验本法安全、对预防耐药结核病的流行与传播、防止实验本法安全、对预防耐药结核病的流行与传播、防止实验室工作人员的感染具有重要意义。室工作人员的感染具有重要意义。室工作人员的感染具有重要意义。室工作人员的感染具有重要意义。24六、快速培养检测法1.BD BACTEC MGIT 960培养系统培养系统2.BacT ALERT 3D培养系统培养系统251.1.BD BD BACTEC MGITBACTEC MGIT 960 960 培养系统培养系统培养系统培养系统 基本原理基本原理l 培养瓶底部含有包被于树脂上的荧光显示剂，由于该显示剂为氧抑制性，当分支杆
16、菌生长使氧消耗后，荧光显示剂被激活，而发出荧光。检测仪测试荧光强度，并判定结果。l优点：快速 7-14天培养阳性 简便 比常规法操作简便，培养阳性率高于L-J法 l缺点：无法观察菌落形态，无法观察菌落形态，无法观察菌落形态，无法观察菌落形态，污染率略高于L-J法，产品依赖进口，价格较贵262 2BacTBacT ALERT 3D ALERT 3D培养系统培养系统培养系统培养系统l原理：该系统采用产色检测技术检测培养系统中分支杆菌生长情况。因其所用的培养瓶底部有颜色感应器，当培养瓶中有细菌生长，C02产生、pH下降时，颜色感应器由绿色变成黄色。仪器自动连续检测，检测的数据输入计算机，根据计算结果自动显示培养瓶中有无分支杆菌生长。l优点：快速 7-14天培养阳性 简便 比常规法操作简便，培养阳性率高于L-J法 l缺点：无法观察菌落形态，无法观察菌落形态，无法观察菌落形态，无法观察菌落形态，污染率略高于L-J法，产品依赖进口，价格较贵。27七、色谱法 l分为气相色谱(GC)、气液相色谱、高效液相色谱(HPLC)等lGC等能检测分枝杆菌代谢过程中的挥发性物质如脂肪酸所产生的CO2含量，出现不同
