1、II + IV + VIII + IV + V2（）基因工程的单元操作顺序是增，转，检，切，接切，接，转，增，检接，转，增，检，切检，切，接，增，转切，接，增，转，检3 （ ）生物工程的上游技术是基因工程及分离工程基因工程及发酵工程基因工程及酶工程基因工程及细胞工程基因工程及蛋白质工程4 （ ）下列对逆转录酶描述正确的是：A依赖于RNA的DNA聚合酶或称为RNA指导的DNA聚合酶B依赖于cDNA的DNA聚合酶或称为cDNA指导的DNA聚合酶C依赖于DNA的DNA聚合酶或称为DNA指导的DNA聚合酶D依赖于RNA的RNA聚合酶或称为rNA指导的RNA聚合酶5（ ）下列对限制性内切酶描述正确的是限
2、制性内切酶可识别任一的DNA序列使用限制性内切酶时，有时可出现星活性限制性内切酶可识别碱基数不超过5个限制性内切酶切割碱基序列产生都是黏性末端6 （ ）T 4 -DNA连接酶是通过形成磷酸二酯键将两段DNA片段连接在一起，其底物的关键基团是2 -OH和5 -P2 -OH和33 -OH和2357 （ ）下列有关连接反应的叙述，错误的是连接反应的最佳温度为1216连接反应缓冲体系的甘油浓度应低于10%连接反应缓冲体系的ATP浓度不能高于1mM连接酶通常应过量2-5倍DTT在反应中可加也可不加8（）下列哪种克隆载体对外源DNA的容载量最大?A质粒B黏粒C酵母人工染色体（YAC）D噬菌体9（）载体的功
3、能是（I运送外源基因高效进入受体细胞II为外源基因提供复制能力III为外源基因提供整合能力）II + III + IIIII + IIII + II + III10 （ ）考斯质粒（cosmid）是一种天然质粒载体由入-DNA的cos区与一质粒重组而成的载体能裂解受体细胞的烈性载体具有溶原性质的载体能在受体细胞内复制并包装的载体11（ ）下列有关基因的描述，错误的是蛋白质是基因表达唯一的产物基因是DNA链上具有编码功能的片段基因也可以是RNA基因突变不一定导致其表达产物改变结构12（）关于cDNA的最正确的提法是：A同mRNA互补的单链DNA B同mRNA互补的双链DNAC以mRNA为模板合成
4、的双链DNA D以上都正确13（）某一重组DNA（6.2kb）的载体部分有两个SmaI酶切位点。用SmaI酶切后凝胶电泳上出现四条长度不同的带子，其长度总和与已知数据吻合，该重组分子插入片段上的SmaI酶切位点共有5个4个3个2个14（）同一种质粒DNA，以三种不同的形式存在，电泳时，它们的迁移速率是：A OC DNASC DNPLDNA B SC DNAL DNAOC DNAC L DNAOC DNASC DNA D SC DNAL DNA15（）cDNA法获得目的基因的优点是成功率高不含内含子操作简便表达产物可以分泌能纠正密码子的偏爱性三、简答题（每题5分，共25分）1、什么是包涵体？2、
5、PCR反应体系包括哪些内容？基本反应过程是什么？3、限制性核酸内切酶的活性受哪些因素影响？4、作为基因工程载体必须具备的基本条件是什么？5、基因工程诞生的理论基础是什么？四、论述题（每题10分，共40分）1简述载体构建的一般过程2大肠杆菌作为基因工程受体菌的优点和缺点是什么？3如何有效地提高外源基因的表达效率？4试述3RACE技术原理和方法基因工程试题标准答案及评分标准A一、选择题（每题1分，共15分）1、A2、A3、A4、A5、B6、D 7、E8、C9、E10、B11、A12、C13、D 14、B15、B二、名词解释（每题2分，共20分）1、转染：专指感受态的大肠杆菌细胞捕获和表达噬菌体DN
6、A分子的生命过程。2、质粒不亲和性：在没有选择压力的情况下，两种不同质粒不能够在同一宿主细胞系中稳定地共存的现象。3、cDNA文库：是指某生物某一发育时期所转录形成的cDNA片段与某种载体连接而成的克隆的集合。4、RACE：是一种通过PCR进行cDNA末端快速克隆的技术，是以mRNA为模板反转录，成cDNA第一链后用PCR技术扩增出某个特异位点到3或5端之间未知序列的方法。在分子水平上的进行的遗传操作，指将一种或多种微生物的基因或基因组提取出来，或人工合成基因，按着人们的愿望，进行严密的设计，经过体外加工重组，转移到另一种生物体的细胞内，使之能在受体细胞遗传并获得新的遗传性状的技术。6、RT-
7、PCR:先用逆转录酶作用于mRNA，以寡聚dT为引物合成cDNA第一链，然后用已知一对引物，扩增嵌合分子，这种方法称为逆转录PCR7、Insert inaction:即插入失活，基因工程载体上的某些选择标记基因常常含某种或某几种限制性内切酶的单一酶切位点，在该位点用相应的限制性内切酶处理，并将外源DNA片段插入该位点，则插入的外源DNA片段将破坏原有基因的读码框，往往导致原有的选择标记基因无法翻译表达，或即使翻译表达，形成的也是丧失了原有生物活性的蛋白质，这一现象称为插入失活。8、S-D序列：在大肠杆菌mRNA的核糖体结合位点上，含有一个转译起始密码子及同16S，核糖体RNA 3末端碱基互补的
8、序列，该序列最初由Shine、Dalgarno发现，故后来命名为ShineDalgarno序列，简称S-D序列。9、穿梭质粒载体：指一类由人工构建的具有两种不同复制起点的选择标记，因而可在两种不同宿主细胞中存活和复制的质粒载体。10、MCS：指载体上人工合成的含有紧密排列的多种限制核酸内切酶的酶切位点的DNA片段。三、简答题（共25分，每题5分）重组蛋白在胞内表达时，常常以不溶性蛋白聚集成的晶状物形式存在，这种晶状体即包涵体。包涵体的形成是外源蛋白的高效表达时的普遍现象，这是由于肽链折叠过程中部分折叠的中间态发生了错误聚合，而不是形成成熟的天然态或完全解链的蛋白。PCR反应体系所要求的条件:
9、a、被分离的目的基因两条链各一端序列相互补的DNA引物（约20个碱基左右）。b、具有热稳定性的酶如：TagDNA聚合酶。c、dNTP。d、作为模板的目的DNA序列，E无菌水，F，缓冲液PCR反应体系的基本反应过程：预变性、变性、退火、延伸、复延伸。酶的纯度。DNA样品的纯度。DNA的甲基化程度。酶切反应的温度与时间。DNA分子的构型。限制性核酸内切酶的反应缓冲液。能在宿主细胞内进行独立和稳定的自我复制具有合适的限制内切酶位点具有合适的选择标记基因是现代分子生物学领域理论上的三大发现和技术上的三大发明。理论上的三大发现：证实了DNA是遗传物质揭示了DNA分子的双螺旋结构模型和半保留复制机理遗传密
10、码的破译和遗传信息传递方式的确定技术上的三大发明：限制核酸内切酶的发现与DNA切割DNA连接酶的发现与DNA片段的连接基因工程载体的研究与应用四、问答题（每题10分，共40分）A目的基因分析（1）ORF分析（2）酶切位点分析B载体选择与分析（1）多克隆位点分析（2）抗性标记分析（3）启动子与其他筛选标记分析C连接体系与连接时间确定优点：大肠杆菌培养方便、操作简单、成本低廉，基础生物学、分子遗传学等方面的背景知识清楚，对其基因表达调控的分子机理也比较了解，而且历经二十年的基因工程实践，大肠杆菌已发展成为一种安全的基因工程实验体系，有多种适用的寄主菌株和载体系列，大肠杆菌易于进行工业化批量生产。缺
11、点：在通常情况下，细菌的RNA聚合酶不能识别真核的启动子；许多真核基因的蛋白质产物需要经过翻译后的加工修饰，如正确的折叠和组装，而细菌中通常并没有这样的修饰机制，从而可能导致真核基因在大肠杆菌中的翻译产物无法产生有活性的蛋白；外源真核基因所表达的蛋白质分子往往能够被细菌的蛋白酶识别，并被当做“异已分子”降解掉。提高启动子强度缩短启动子同克隆基因间距离高效的翻译起始序列高效的转录终止区提高质粒拷贝数及稳定性用以下方法提高翻译水平：调整SD序列与AUG间的距离用点突变的方法改变某些碱基增加mRNA的稳定性的减轻细胞的代谢负荷：诱导表达表达载体的诱导复制提高表达蛋白的稳定性，防止其降解：克隆一段原核
12、序列，表达融合蛋白采用某种突变菌株表达分泌蛋白质PCR用于扩增代表mRNA转录物某一单位点与其3或5末端之间区域的部分cDNA称为快速扩增cDNA末端技术。如果已敿目的mRNA的一片段链内短序列，据此或设计基因特异引物，用原先存在的poly（A）尾（3末端）或附加的同聚尾（5末端）互补的序列做末端引物，就可以获得从未知末端直到已知区域的部分cDNA序列。为获得3末端cDNA克隆，mRNA反转录时需用杂合引物（QT）。QT由17个核苷酸长的olig（dT）及特定的35个核苷酸序列（QI-QO）构成，前者被命名为锚定引物。为获得5末端部分cDNA克隆需用基因特异引物，产物第一链产物，可用末端脱氧核苷酸转移酶及dATP加poly（A）尾。通过QT引物和反转录使用的上游基因特异引物生成第二链cDNA。
