1、-葡萄糖苷酸酶是一个水解酶,以-葡萄糖苷酸酯类物质为底物,其反应产物可用多种方法检测出来。由于绝大多数植物没有检测到葡萄糖苷酸酶的背景活性,因此这个基因被广泛应用于植物基因调控的研究中。科研工作中发现,盐芥液泡焦磷酸酶基因启动子(TsVP1)在除了种子以外的所有组织中都有活性,它的活性在根和叶中能被盐诱导,尤其在根尖中。为了研究启动子的关键序列,构建了盐芥液泡焦磷酸酶基因启动子(TsVP1)不同长度启动区控制的-葡萄糖苷酸酶(GUS )载体pCAMBIA1391z (PTsVP:GUS),转染拟南芥,获得转基因拟南芥PT1,PA1和P7。发现PT1,PA1和P7具有不同的GUS 活性及盐诱导活
2、性。表明启动区长度对启动子功能有影响,由此推测启动子的关键序列及诱导特点。2. 实验材料2.1实验材料 2.1.1材料拟南芥种子PT1、PT2、PT7、PT82.1.1试剂配制MS 培养基所需的母液,琼脂,蔗糖,1 mol/L的NaOH 溶液,70乙醇,无菌水, 10次氯酸钠,琼脂粉,NaCl ,1mol/L GUS染色液。2.1.1器具量筒,移液枪,烧杯,天平,玻璃棒,滴管,pH 计,500 mL锥形瓶,高压蒸汽灭菌锅,培养皿,EP 管,人工培养箱,吸管,吸水纸。2.2实验方法 2.2.1配制MS 培养基MS 培养基:Murashige 和Skoog 于1962年为烟草细胞培养设计的,其特点
3、是无机盐和离子浓度较高,是较稳定的离子平衡溶液,它的硝酸盐含量高,其养分的数量和比例合适,能满足植物细胞的营养和生理需要, 因而适用范围比较广,多数植物组织培养快速繁殖用它作为培养基的基本培养基。MS 培养基组成: 配制母液的优点是:1、避免每次配制培养基都要对几十种成分进行称量。2、减少了称量微量元素造成的误差。配制MS 培养基:(1)用量筒和移液枪从各种母液中分别取出所需的用量:母液(大量元素 20)为10 mL,母液(微量元素 200)、(铁盐 200)、(有机成分 200)各1mL ,加入烧杯中,再加入蔗糖6g ,加蒸馏水至175mL 左右。(2)用滴管吸取物质的量浓度为1 mol/L
4、的NaOH 溶液,逐滴滴入溶化的培养基中,边滴边搅拌,并随时用pH 计测培养液的pH ,一直到pH 为5.8为止(培养基的pH 必须严格控制在5.8 。(3)在大量筒中定容至200mL ,倒入锥形瓶,加入1.6g 琼脂粉。(4)同样的方法配制200mL 含盐的培养基,在第(1)步中加入2.34g NaCl。 (5)称0.005g 左右的琼脂粉与10mL 蒸馏水混合,配成0.05%琼脂液。 (6)高压灭菌第一,码放锥形瓶。将装有培养基的锥形瓶直立于金属小筐中,再放入高压蒸气灭菌锅内。第二,放置其他需要灭菌的物品。将其他需要灭菌的物品也放入高压蒸气灭菌锅内,如用牛皮纸包裹的培养皿、枪头、无菌水、琼
5、脂液等。第三,灭菌。待需要灭菌的物品码放完毕,盖上锅盖。在98 kPa、121.3 下,灭菌20 min。第四,灭菌后取出锥形瓶,让其中的培养基自然冷却凝固,或立即倒平板。2.2.2培养拟南芥幼苗(1)培养皿分装培养基将锥形瓶中的培养基加热融化,在超净工作台上将其趁热倒入四个培养皿,令其自然冷却凝固。(2)种子灭菌种子在EP 管内经体积分数70乙醇漂洗l min ,无菌水洗l 次,等量无菌水和10次氯酸钠混合浸洗10 min ,无菌水洗5遍,最后加入质量分数005的琼脂液悬浮,分别均匀撒于平板上。(3)适宜环境培养培养条件:在人工气候室培养,调节温度20,湿度75%,光照300mol/s m
6、2,光周期16h 光照/8h黑暗 (4)盐处理将MS 培养基上培养一周多的植株取10株左右转移到含有200mmol L -1NaCl 的培养基上相同条件下培养16小时,剩下一半原条件继续培养。3. 结果PT1染色深于PT2,说明PT1中启动子多于PT2的序列能增强GUS 基因的表达。而PT2的小叶未被染色,说明PT2缺失的部分基因可能与GUS 基因在小叶中的表达有关。PT7染色与PT2相似,说明PT7相对PT2缺失的启动子序列对于GUS 基因表达作用效果影响相对较小。但是PT7中小叶染色,因此说明在所缺失中的启动子序列中存在调控GUS 基因在小叶中表达的序列,同时根据PT2与PT1的对比,说明
7、PT2相对PT1中缺失的序列与PT7相对PT2缺失的序列共同影响GUS 基因在小叶中的表达。PT8相对PT7染色较浅,说明PT8相对PT7缺失的序列对GUS 表达有增强作用。而PT8中根基本无染色,说明缺失部分序列对GUS 基因表达影响较大。PT2 经盐处理后, 染色明显加深, 而且小叶中也出现轻微染色, 说明盐处理能促进 GUS 基因的表达。 P T7 经 过盐处理后,染色也出 显的加深,说明 GUS 基 启动子仍然活性较强。 现明 因的 PT8 经盐处理后,染色稍加深,但对比不明显,说明 PT8 上存留的启动子 序列对 GUS 基因表达的作用已经不是很强烈了。4.讨论 4.讨论 经结果讨论推断,启动子关键序列有可能存在与 PT7 与 PT8 序列之间,但是由于 7、8 号拟南芥染色差别不明显,因此,不能十分确定,也有可能关键序列在 PT8 剩余的序列内, 如需确定,还应经过进一步实验确定。