1、根据其诱导植物细胞产生冠瘿碱的种类，分为根据其诱导植物细胞产生冠瘿碱的种类，分为章鱼碱型章鱼碱型、胭脂碱型胭脂碱型、农杆碱型农杆碱型、农杆菌素碱型农杆菌素碱型（琥珀碱型琥珀碱型）。功能区功能区毒性区毒性区（Vir区区）T-DNA区区 接合转移区接合转移区 复制起始区复制起始区 章鱼碱型章鱼碱型2、T-DNA的结构与功能的结构与功能 边界序列：边界序列：25bp，TGACACGATATATTGGCGGGTAAAC 右边界序列是完全保守的，对右边界序列是完全保守的，对T-DNA转移是必须的。转移是必须的。T-DNA的编码基因的编码基因3、Vir区的结构与功能区的结构与功能 3040 kb，有，有v
2、irAvirM等操纵子。等操纵子。virA操纵子操纵子：组成型，长约为：组成型，长约为2.8kb，virA基因。基因。VirA蛋白蛋白（92kD）是内膜受体蛋白，感应并结合酚类化合物是内膜受体蛋白，感应并结合酚类化合物（乙酰丁香酮，乙酰丁香酮，AS），是一种，是一种自激酶并使自激酶并使VirG蛋白蛋白磷酸化而被激活。磷酸化而被激活。virG操纵子操纵子：组成型，：组成型，1.0kb，virG基因。VirG蛋白蛋白（30kD）为转录激活因子，诱导其他为转录激活因子，诱导其他vir基因的表达。基因的表达。virB操纵子操纵子：诱导型，：诱导型，virB1virB11基因。VirB蛋白构成蛋白构成跨
3、膜复合体跨膜复合体（T-链复合体运输器链复合体运输器）供供T-DNA越膜转移。越膜转移。virC操纵子操纵子：诱导型，virC1、virC2基因。VirC1蛋白与蛋白与超超驱动序列驱动序列（离右边界外侧离右边界外侧17bp处的一个处的一个24bp的保守序列的保守序列）结合，结合，促进促进T-DNA加工。加工。virD操纵子操纵子：诱导型，virD1virD4基因。VirD1（16kD）、VirD2（47kD）蛋白参与蛋白参与T-DNA加工形成加工形成T-链链：首先：首先VirD1与与25bp边界序列亲和结合，使其松弛，然后使边界序列亲和结合，使其松弛，然后使VirD2在特异位点在特异位点剪切。
4、剪切。VirD2与与T-链的链的5端共价结合，并核定位信号，将端共价结合，并核定位信号，将T-链链复合体导向细胞核。复合体导向细胞核。virE操纵子操纵子：诱导型，virE1、virE2基因。VirE2蛋白蛋白（60.5kD）是是ssDNA结合蛋白，与结合蛋白，与T-链结合，参与链结合，参与T-链复合体形链复合体形成，还具有核定位信号，引导成，还具有核定位信号，引导T-链复合体进入植物细胞核。链复合体进入植物细胞核。virF操纵子操纵子：诱导型，virF基因。VirF蛋白蛋白（23kD）参与参与T-链复合体的运输。链复合体的运输。virH操纵子操纵子：诱导型，virH1、virH2基因。Vir
5、H蛋白功能蛋白功能是是降解植物伤口细胞产生的杀菌物质。降解植物伤口细胞产生的杀菌物质。三、三、T-DNA转移至植物细胞的机理转移至植物细胞的机理（农杆菌介导转化的机理农杆菌介导转化的机理）植物创伤反应与农杆菌对植物细胞的识别和附着；植物创伤反应与农杆菌对植物细胞的识别和附着；信号分子的释放积累与信号分子的释放积累与VirA蛋白的感应；蛋白的感应；VirG蛋白激活与蛋白激活与vir基因的诱导表达；基因的诱导表达；T-链复合体的形成；链复合体的形成；T-链链是指是指vir基因被诱导表达后加工基因被诱导表达后加工T-DNA而产生的而产生的单链单链T-DNA。T-链复合体链复合体是指结合了是指结合了V
6、irD2、VirE2蛋白的蛋白的T-链。链。T-链复合体的跨膜转运；链复合体的跨膜转运；通过通过T-链复合体运输器链复合体运输器和和T菌毛菌毛进入植物细胞进入植物细胞。T-DNA整合到植物染色体上。整合到植物染色体上。四、四、Ti质粒的改造与转化载体系统的构建质粒的改造与转化载体系统的构建 野生型野生型Ti质粒质粒不能直接作为不能直接作为植物转化载体植物转化载体：Ti质粒分子过大，没有单一的限制性内切酶位点，基质粒分子过大，没有单一的限制性内切酶位点，基因操作困难，不能直接将外源基因插入其因操作困难，不能直接将外源基因插入其T-DNA中；中；T-DNA区的区的onc基因产物将干扰受体植物内源激
7、素的平基因产物将干扰受体植物内源激素的平衡，导致冠瘿瘤的产生，阻碍细胞的分化和植株的再生；衡，导致冠瘿瘤的产生，阻碍细胞的分化和植株的再生；现已现已通过中间载体途径构建许多通过中间载体途径构建许多植物转化载体系统植物转化载体系统，主，主要有要有共整合载体系统共整合载体系统、双元载体系统双元载体系统、隔端载体系统隔端载体系统。1、共整合载体系统、共整合载体系统（cointegrate vector system）由由卸甲卸甲Ti质粒载体质粒载体、中间表达载体中间表达载体组成。组成。例如：pGV3850、pLGVneo1103 AmprpLGVneo1103Cointegrate plasmid2
8、、双元载体系统、双元载体系统（binary vector system）由由微型质粒微型质粒、辅助辅助 Ti质粒质粒组成。Bin19、pAL4404 双元载体系统比共整合载体系统更优越双元载体系统比共整合载体系统更优越：插入外源插入外源基因的操作较简单；基因的操作较简单；转化效率较高。lacZ3、隔端载体系统、隔端载体系统 与共整合载体系统一样，由卸甲与共整合载体系统一样，由卸甲Ti质粒载体和中间表达质粒载体和中间表达载体通过同源重组共整合成转化载体，但与基因转移相关载体通过同源重组共整合成转化载体，但与基因转移相关的的T-DNA左右边界序列分别位于两个载体上。左右边界序列分别位于两个载体上。
9、共整合载体系统共整合载体系统和隔端载体系统统称和隔端载体系统统称为为一元载体系统一元载体系统或或顺顺式载体系统式载体系统。双元载体系统也双元载体系统也称为称为反式载体系统反式载体系统。五、五、Ri质粒载体系统质粒载体系统 发根农杆菌发根农杆菌（Agrobacterium rhiizogenes）Ri质粒分为农杆碱型、甘露碱型、黄瓜碱型质粒分为农杆碱型、甘露碱型、黄瓜碱型 Ri质粒的质粒的Vir区与区与Ti质粒的高度同源，质粒的高度同源，T-DNA区的边界区的边界序列与序列与Ti质粒的高度同源，只含有编码与生长素合成有关质粒的高度同源，只含有编码与生长素合成有关的酶的酶（iaaM和和iaaH）和
10、与冠瘿碱合成有关的酶，不具细胞分和与冠瘿碱合成有关的酶，不具细胞分裂素合成相关的基因。裂素合成相关的基因。共整合载体系统共整合载体系统双元载体系统双元载体系统Ri质粒载体系统质粒载体系统第二节第二节 目的基因的导入植物目的基因的导入植物一、植物转化受体系统及其考虑因素一、植物转化受体系统及其考虑因素 建立一个高效再生体系是植物遗传转化的关键。建立一个高效再生体系是植物遗传转化的关键。1、植物转化受体系统、植物转化受体系统 植物转化受体系统植物转化受体系统是指用于植物遗传转化的再生体系或是指用于植物遗传转化的再生体系或繁殖体系。繁殖体系。植物转化的受体系统植物转化的受体系统愈伤组织受体系统愈伤组
11、织受体系统 原生质体受体系统原生质体受体系统 胚状体受体系统胚状体受体系统 直接分化受体系统直接分化受体系统 生殖细胞受体系统生殖细胞受体系统 2、建立植物转化受体系统的主要考虑因素、建立植物转化受体系统的主要考虑因素 具有稳定的外植体来源具有稳定的外植体来源；具有高效稳定的再生能力具有高效稳定的再生能力；具有较好的遗传稳定性具有较好的遗传稳定性；对选择性抗生素敏感对选择性抗生素敏感。二、植物基因转移的方法二、植物基因转移的方法1、农杆菌介、农杆菌介导法导法 一般程序一般程序：制备工程农杆菌侵染液：制备工程农杆菌侵染液 农杆菌侵染外植体杆菌侵染外植体 共培养共培养 筛选与分化培养筛选与分化培养
12、 获得抗性植株获得抗性植株 分子检测分子检测 转基因植株转基因植株 1、工程农杆菌的制备、工程农杆菌的制备 把构建好的中间载体导入到农杆菌的方法：把构建好的中间载体导入到农杆菌的方法：三亲交配法三亲交配法 含有中间载体质粒的大肠杆菌、含有迁含有中间载体质粒的大肠杆菌、含有迁移质粒的大肠杆菌、含有移质粒的大肠杆菌、含有Ti质粒的农杆菌质粒的农杆菌 直接转化法直接转化法 如电击法、液氮冷冻法。效率低，但简如电击法、液氮冷冻法。效率低，但简单、快速。单、快速。2、农杆菌转化植物的操作方法、农杆菌转化植物的操作方法 整株感染法整株感染法 创伤整株感染法、非创伤整株感染法创伤整株感染法、非创伤整株感染法
13、 优点：优点：免去了组织培养过程，操作简单。外植体转化法外植体转化法 如：叶盘转化法、子叶柄转化法、原生质体转化法如：叶盘转化法、子叶柄转化法、原生质体转化法 叶盘转化法叶盘转化法2、基因枪法、基因枪法（微弹轰击法微弹轰击法、粒子轰击法粒子轰击法）原理原理 利用火药爆炸、高压利用火药爆炸、高压放电或高压气体作驱动力放电或高压气体作驱动力，将载有外源将载有外源DNA的金粉的金粉（钨钨粉粉）等金属微粒加速射入受等金属微粒加速射入受体细胞，从而将外源体细胞，从而将外源DNA分子导入细胞并实现转化。分子导入细胞并实现转化。基因枪的类型基因枪的类型 火药爆炸基因枪火药爆炸基因枪（1987年年 Sanfr
14、od等等）：污染、可控性低：污染、可控性低 高压气体基因枪高压气体基因枪（杜邦公司的杜邦公司的PDS-1000HE型型）：无污染、：无污染、可控性较高可控性较高 高压放电基因枪高压放电基因枪：无污染，可控性最高：无污染，可控性最高 操作步骤操作步骤 a、受体细胞或组织的预处理；、受体细胞或组织的预处理；高渗高渗（甘露醇、山梨醇甘露醇、山梨醇）培养培养 b、DNA微弹的制备；微弹的制备；钨粉微粒的直径一般为钨粉微粒的直径一般为0.71um，金粉微粒的直径一，金粉微粒的直径一般为般为11.6um。金粉对细胞的伤害、毒性小，但较贵。c、受体材料的轰击；、受体材料的轰击；根据基因枪操作说明选择适当大小外植体、装配根据基因枪操作说明选择适当大小外植体、装配DNA微弹等。微弹等。无菌操作无菌操作 d、过渡培养与筛选培养、过渡培养与筛选培养 过渡培养：无选择、高渗培养，过渡培养：无选择、高渗培养，12周周 3、花粉管通道法、花粉管通道法 花粉管通道法是利用植物受精过程中形成的花粉管通道花粉管通道法是利用植物受精过程中形成的花粉管通道将外源将外源DNA导入植物的
