1、最新版生技大实验实验报告实验报告：淀粉酶基因的构建及其在大肠杆菌（amp+）中的表达 学生：* 学号：* 班级：生物技术* 目录：v 相关背景v 目前研究情况v 简略研究步骤v 相关实验详细介绍v 实验结果与讨论v 参考文献1、相关背景1、1淀粉酶1、1、1 淀粉酶的发现和分类淀粉酶是较早发现的酶类之一，早在1833年Payen和Persoz已首次从麦芽的水抽提物中用酒精沉淀分离到淀粉酶。1894年高峰让吉从米曲霉(Aspergillus oryzae)中提取出作为消化剂的酶，即高峰淀粉酶。1919年法国Boidin和Effront首次用枯草杆菌生产淀粉酶。淀粉酶(amylase，AMY,AM
2、S)是作用于可溶性淀粉、直链淀粉、糖元等1，4-葡聚糖，水解1，4-糖苷键的酶类的总称。现在淀粉酶大致可分为四大类。 第一类-淀粉酶，广泛分布于动物（唾液、胰脏等）、植物（麦芽、山萮菜）及微生物。微生物的酶几乎都是分泌性的。此酶以钙离子为必需因子并作为稳定因子，既作用于直链淀粉，亦作用于支链淀粉，无差别地切断1，4-链。因此，其特征是引起底物溶液粘度的急剧下降和碘反应的消失，最终产物在分解直链淀粉时以麦芽糖为主，此外，还有麦芽三糖及少量葡萄糖。另一方面在分解支链淀粉时，除麦芽糖、葡萄糖外，还生成分支部分具有-1，6-键的-极限糊精。一般分解限度以葡萄糖为准是35-50，但在细菌的淀粉酶中，亦有
3、呈现高达70分解限度的（最终游离出葡萄糖）。按照使用条件-淀粉酶可以分为中温型，高温型，耐酸耐碱型。按产生菌不同又可分为细菌、真菌、植物和动物淀粉酶。第二类-淀粉酶(EC3.2.1.2)从底物非还原性末端顺次水解每隔一个-1,4糖苷键，切下的是麦芽糖单位。-淀粉酶与-淀粉酶的不同点在于从非还原性末端逐次以麦芽糖为单位切断1，4-葡聚糖链。主要见于高等植物中（大麦、小麦、甘薯、大豆等），但也有报告在细菌、牛乳、霉菌中存在。对于象直链淀粉那样没有分支的底物能完全分解得到麦芽糖和少量的葡萄糖。作用于支链淀粉或葡聚糖的时候，切断至1，6-键的前面反应就停止了，因此生成分子量比较大的极限糊精。 第三类葡
4、萄糖淀粉酶（EC3.2.1.3）,习惯上简称糖化酶，从底物的非还原性末端顺次水解-1，4糖苷键和分支的-1,6键生成葡萄糖。 第四类解枝酶或异淀粉酶(EC3.2.1.9)只水解糖原或支链淀粉分支点-1,6糖苷键，切下整个侧枝。还有淀粉-1，6葡萄糖酶是在分支点的葡萄糖单位仅一个时起作用。1、1、2 淀粉酶的工业应用淀粉酶是水解淀粉和糖原的酶类总称，通常通过淀粉酶催化水解织物上的淀粉浆料，由于淀粉酶的高效性及专一性，酶退浆的退浆率高，退浆快，污染少，产品比酸法、碱法更柔软，且不损伤纤维。淀粉酶的种类很多，根据织物不同，设备组合不同，工艺流程也不同，目前所用的退浆方法有浸渍法、堆置法、卷染法、连续
5、洗等，由于淀粉酶退浆机械作用小，水的用量少，可以在低温条件下达到退浆效果，具有鲜明的环保特色。除此之外，不同性质的-淀粉酶还具有许多不同的用途。耐热性-淀粉酶，由于使用时温度提高，液化完全，用酶量少，操作比较容易，自1973年问世以来，使双酶糖化发生产葡萄糖真正在工业上得到应用。耐热性-淀粉酶也适用于棉布退浆及石油压裂液处理等。米曲霉-淀粉酶耐热性差，应用面包工业，可避免应用高温-淀粉酶而使面包过度液化，口感变差的现象，黑曲霉酸性-粉酶适用于消化药物制造，糖化性细菌淀粉酶具有较多的麦芽糖，可以制造糖浆，-淀粉酶在工农业生产中有许多用途，祥见表一中。 -淀粉酶也是一种应用广泛的淀粉酶。作为一种糖
6、化剂，-淀粉酶在食品工业中主要用于制造麦芽糖浆、啤酒、面包、酱油等。在制醋工业中，常用-淀粉酶代替部分麸曲节省成本，在白酒和其他工业中也可以用其作糖化剂。在医药工业上，-淀粉酶的一个重要用途是制造麦芽糖，医学上常用该酶和-淀粉酶一道作为消化剂使用。1、1、3 淀粉酶的临床意义 增高：见于胰腺肿瘤引起的胰腺导管阻塞、胰腺脓肿、胰腺损伤、肠梗阻、胃溃疡穿孔、流行性腮腺炎、腹膜炎、胆道疾病、急性阑尾炎、胆囊炎、消化性溃疡穿孔、肾功能衰竭或肾功能不全、输卵管炎、创伤性休克、大手术后、肺炎、肺癌、急性酒精中毒、吗啡注射后，以及口服避孕药、磺胺、噻嗪类利尿剂、鸦片类药物（可待因、吗啡）。麻醉止痛剂等。 减
7、低：见于肝硬化、肝炎、肝癌、急性或慢性胆囊炎等。 胰淀粉酶由胰腺以活性状态排入消化道，是最重要的水解碳水化合物的酶，和唾液腺分泌的淀粉酶一样都属于-淀粉酶，作用于-1，4糖苷键，对分支上的-1，6糖苷键无作用，故又称淀粉内切酶，其作用的最适pH为6.9，可通过肾小球滤过，是唯一能在正常时于尿中出现的血浆酶。人体的其他组织如卵巢、输卵管、肺、睾丸、精液、乳腺等的提取物中都发现有淀粉酶活性;血液、尿液、乳液中也含淀粉酶。血液淀粉酶中主要来自胰腺、唾液腺，尿液中淀粉酶则来自于血液。测定血清淀粉酶同工酶时，发现有两个主要的同工酶区带及数个次要区带。两个主要区带中的一个和胰腺的提纯物或分泌物电泳的位置相
8、同，因此命名为P-同工酶;另一个和唾液腺提纯物或唾液电泳在同一位置，因此命名为S-同工酶。测定淀粉酶同工酶有助于对胰腺疾病的鉴别诊断。参考值：限定性底物法：血清淀粉酶 220U/L(37)尿淀粉酶 1200U/L(37)P同工酶 血清115U/L尿800U/L新生儿血清淀粉酶约为成年人的18%，主要为S-型，到5岁时达成人水平;在一岁内测不出血清P-型淀粉酶，以后缓慢上升，在1015岁时达成人水平。血清淀粉酶和尿淀粉酶测定是胰腺疾病最常用的实验室诊断方法，当罹患胰腺疾病，或有胰腺外分泌功能障碍时都可引起其活性升高或降低，有助于胰腺疾病的诊断。尿淀粉酶水平波动较大，所以用血清淀粉酶检测为好，或两
9、者同时测定。淀粉酶活性变化亦可见于某些非胰腺疾患，因此在必要时测定淀粉酶同工酶具有其鉴别诊断意义。1.血清淀粉酶升高：最多见于急性胰腺炎，是急性胰腺炎的重要诊断指标之一，在发病后212h活性开始升高，1272h达峰值，34天后恢复正常。淀粉酶活性升高的程度虽然并不一定和胰腺损伤程度相关，但其升高的程度越大，患急性胰腺炎的可能性也越大，因此虽然目前还都用淀粉酶作为急性胰腺炎诊断的首选指标，但其特异性和灵敏度都还不够高。当怀疑急性胰腺炎时，应对患者血清和尿淀粉酶活性连续作动态观察，还可结合临床情况及其他试验，如胰脂肪酶、胰蛋白酶等测定共同分析，作出诊断。淀粉酶测定对监测急性胰腺炎的并发症如胰腺假性
10、囊肿，胰腺脓肿亦有价值，此种时候血淀粉酶活性多持续升高。重症急性胰腺炎时可以引起胸腔积液或/和腹腔积液，积液中的淀粉酶活性甚至可高于血清淀粉酶活性100倍以上。急性胰腺炎的诊断有一定的困难，因为其他急腹症也可以引起淀粉酶活性升高。所以当怀疑急胰腺炎时，除应连续监测淀粉酶外，还应结合临床情况及其他试验，如胰脂肪酶、胰蛋白酶等测定结果共同分析，作出诊断。慢性胰腺炎淀粉酶活性可轻度升高或降低，但没有很大的诊断意义。胰腺癌早期淀粉酶活性可见升高。淀粉酶活性中度或轻度升高还可见于一些非胰腺疾病，如腮腺炎、急性腹部疾病(消化性溃疡穿孔、上腹部手术后、机械性肠梗阻、肠系膜血管病变、胆道梗阻及急性胆囊炎等)、
11、服用镇痛剂、酒精中毒、肾功能不良及巨淀粉酶血症等情况，应加以注意。血液中淀粉酶能被肾小球滤过，所以任何原因引起的血清淀粉酶升高时，都会使尿中淀粉酶排出量增加，尤以急性胰腺炎时为多见，急性胰腺炎时肾清除淀粉酶的能力加强，其升高可早于血淀粉酶，而下降晚于血淀粉酶。2.淀粉酶同工酶：血清淀粉酶除来源于胰腺外，还来源于唾液腺及许多其他组织，所以在淀粉酶活性升高时，同工酶的测定有助于疾病的鉴别诊断。P-同工酶升高或降低时，说明可能有胰腺疾患;S-同工酶的变化可能是源于唾液腺或其他组织。当血清淀粉酶活性升高而又诊断不清时，应进一步测定同工酶以助鉴别诊断。有许多方法可以测定同工酶，琼酯糖和醋纤膜电泳法都是比
12、较常用的方法。淀粉酶的测定结果受方法的影响较大，不同方法参考值亦有所不同，临床所用方法也较多，因此必须了解所用测定方法和其参考值，才能作出正确的诊断。1.2 基因克隆1.2.1 PCR 技术 PCR技术类似于DNA的天然复制过程，其特异性依赖于与靶序列两端互补的寡核苷酸引物。PCR由变性-退火-延伸三个基本反应步骤构成：模板DNA的变性：模板DNA经加热至93左右一定时间后，使模板DNA双链或经PCR扩增形成的双链DNA解离，使之成为单链，以便它与引物结合，为下轮反应作准备；模板DNA与引物的退火(复性)：模板DNA经加热变性成单链后，温度降至55左右，引物与模板DNA单链的互补序列配对结合；
13、引物的延伸：DNA模板-引物结合物在TaqDNA聚合酶的作用下，以dNTP为反应原料，靶序列为模板，按碱基配对与半保留复制原理，合成一条新的与模板DNA 链互补的半保留复制链重复循环变性-退火-延伸三过程，就可获得更多的“半保留复制链”，而且这种新链又可成为下次循环的模板。每完成一个循环需24分钟，23小时就能将待扩目的基因扩增放大几百万倍。到达平台期(Plateau)所需循环次数取决于样品中模板的拷贝。 PCR的三个反应步骤反复进行，使DNA扩增量呈指数上升。反应最终的DNA 扩增量可用Y(1X)n计算。Y代表DNA片段扩增后的拷贝数，X表示平(Y)均每次的扩增效率，n代表循环次数。平均扩增
14、效率的理论值为100%，但在实际反应中平均效率达不到理论值。反应初期，靶序列DNA片段的增加呈指数形式，随着PCR产物的逐渐积累，被扩增的DNA片段不再呈指数增加，而进入线性增长期或静止期，即出现“停滞效应”，这种效应称平台期数、PCR扩增效率及DNA聚合酶PCR的种类和活性及非特异性产物的竟争等因素。大多数情况下，平台期的到来是不可避免的。 PCR扩增产物可分为长产物片段和短产物片段两部分。短产物片段的长度严格地限定在两个引物链5端之间，是需要扩增的特定片段。短产物片段和长产物片段是由于引物所结合的模板不一样而形成的，以一个原始模板为例，在第一个反应周期中，以两条互补的DNA为模板，引物是从
15、3端开始延伸，其5端是固定的，3端则没有固定的止点，长短不一，这就是“长产物片段”。进入第二周期后，引物除与原始模板结合外，还要同新合成的链(即“长产物片段”)结合。引物在与新链结合时，由于新链模板的5端序列是固定的，这就等于这次延伸的片段3端被固定了止点，保证了新片段的起点和止点都限定于引物扩增序列以内、形成长短一致的“短产物片段”。不难看出“短产物片段”是按指数倍数增加，而“长产物片段”则以算术倍数增加，几乎可以忽略不计，这使得PCR的反应产物不需要再纯化，就能保证足够纯DNA片段供分析与检测用。 1.2.2 基因克隆方法1.2.2.1 据已知序列克隆基因 这是基因克隆方法中最简便的一种，即从文献中查取别人报道过的基因序列，并将它直接作为自己克隆的依据。首先根据整个基因序列设计特异的引物，通过PCR从基因组中克隆该基因，也可以通过RT-PCR克隆cDNA。 根据蛋白质的氨基酸序列也可以将编码该蛋白质的基因扩增出来。在基因文库中注册的蛋白质序列都可以找到相应的DNA或cDNA序列。如果蛋白质序列是自己测定的，那么需要设计至少1对简并引物，从DNA文库中克隆该基因。以这种方法克隆的基因必须做序列测定才能鉴别所扩增产物的特异性。此外，还可以序列己知的探针来克隆基因，这也是一种较直接的方法。首先将探针作放射性或非放射性标记，再将其与用不同内切酶
