1、基因工程大题2基因工程操作的基本步骤是什么？ 施工材料的准备，即目的基因、载体、工具酶和受体细胞（宿主）的准备。用限制性内切酶分别将外源DNA 和载体分子切开。（切） 目的基因与载体 DNA 的体外重组，形成重组DNA 分子。（接） 把重组的 DNA 分子引入受体细胞，并建立起无性繁殖系。（转和扩 筛选出所需要的无性繁殖系，并保证外源基因在受体细胞中稳定遗传、正确表达。（检）3如何理解基因工程的两个特点？答：基因工程的两个基本特点是分子水平的操作和细胞水平的表达。分子水平的操作包括DNA 分离、切割和连接（还有其他一些DNA 的修饰等）。由于体外重组DNA 的最终目的是要改变生物的遗传性，所以
2、分子水平的操作和细胞水平的表达是基因工程的两个最基本的特点。4基因克隆是如何使含有单个基因的DNA 片段得到纯化的？答：大分子质量的DNA 会含有许多特殊限制性内切核酸酶的限制位点，因此用一种限制 酶处理一完整染色体或整个基因组会产生许多不同的DNA 片段，每一个片段带有基因组的一个不同的基因或一个不同的小片段。当全部片段与用同种限制酶处理过的载体分子混合时（如图所示），每个片段将插入一个不同的载体分子(如一个质粒)。同样地，当用这些质粒转化宿主细胞时，每个宿主细胞将只接收一个质粒DNA 分子，而筛选出的含重组质粒的每个菌落实际上会含有某一特异的供体DNA 片段的多个拷贝。一旦带有待研究的特定
3、基因的克隆被确认了，此重组DNA 分子可从宿主细胞中提取出来进行纯化。5比较遗传工程、基因工程和生物技术。答：遗传工程是遗传学和工程学相结合的一门技术科学。借用工程技术上的设计思想，在离体条件下，对生物细胞、细胞器、染色体或DNA 分子进行按图施工的遗传操作，以求定向地改造生物的遗传性。遗传工程的概念有广义和狭义之分。狭义的遗传工程就是指基因工程。基因工程（gene engineering）又称基因操作（gene manipulation）、重组DNA（recombinant DNA）。基因工程是以分子遗传学理论为基础，以分子生物学和微生物学的现代方法手段，将不同来源的基因(DNA 分子)，按
4、预先设计的蓝图，在体外构建杂种DNA 分子，然后导入活细胞，以改变生物原有的遗传特性，获得新品种，生产新产品，或是研究基因的结构和功能。生物技术又称生物工艺学，生物工程学。是根据生物学、化学和工程学的原理进行工业规模的经营和开发微生物、动植物细胞及其亚细胞组分，进而利用生物体所具有的功能元件(如基因、蛋白质)等来提供商品或社会服务的一门综合性科学技术。它包括基因工程、细胞工程、酶工程和发酵工程等。6说明Sanger DNA 测序法的原理。答：Sanger DNA 测序法建立在两个基本原理之上：核酸是依赖于模板在聚合酶的作用下由5端向3端聚合；可延伸的引物必须能提供游离的3羟基末端，双脱氧核苷酸
5、由于缺少游离的3羟基末端，因此会终止聚合反应的进行。如果分别用四种双脱氧核苷酸终止反应，则会获得四组长度不同的DNA 片段。通过比较所有DNA 片段的长度可以得知核苷酸的序列。11当两种限制性内切核酸酶的作用条件不同时，若要进行双酶切，应采取什么措施? 为什么?答：注意星号活性；先低盐，后高盐；先低温酶，后高温酶；并且可以直接在换酶前将第一种酶失活，再加第二种酶，否则，易产生星号活性，或使用通用缓冲液。12何谓限制性物理图谱？答：限制性物理图谱即限制性内切核酸酶作图(restriction mapping)。简单地说就是DNA 分子中限制性内切核酸酶切割位点的定位，即DNA 分子中各种不同限制
6、性内切核酸酶的酶切位点的线性排列图。标明限制酶在DNA 分子上的限制性位点的数目、限制性片段大小及其线性排列的顺序。13什么是细菌的限制修饰系统 (Restriction ModificationSystem，R-M system)?答：细菌中有作用于同一DNA 的两种酶，即分解DNA 的限制酶和改变DNA 碱基结构使其免遭限制酶分解的修饰酶。而且，这两种酶作用于同一DNA 的相同部位，把这两种酶所组成的系统称为限制与修饰系统。14细菌的限制修饰系统有什么意义?答：不同种的细菌或不同的细菌菌株具有不同的限制酶和修饰酶组成的限制与修饰系统。修饰的本质是通过甲基化酶将DNA 中某些碱基进行甲基化修
7、饰，由于宿主自身DNA 上的这些位点进行了修饰，限制酶就不能进行切割。而外来的DNA 在相应的碱基上没有被甲基化，宿主的限制酶通过对该位点的识别来分辨敌我，并将入侵的外来DNA 分子降解掉。所以DNA 限制作用和修饰作用为细胞提供了保护。15说明限制性内切核酸酶的命名原则要点。答：基本原则：属名+种名+株名十序号。首字母：取属名的第一个字母，且斜体大写。第二个字母：取种名的第一个字母，斜体小写。第三个字母：取种名的第二个字母，斜体小写。第四个字母：若有株名，株名则作为第四个字母，用正体。顺序号：若在同一菌株中分离了几种限制酶，则按先后顺序冠以I、II、III 等，用正体。所有的限制酶，前面还应
8、带有系统的名称,如限制性核酸内切酶 R. Hind III。修饰酶则在前面加上甲基转移酶M，如甲基转移酶M. Hind III。在上下文已清楚只涉及限制酶的地方，R 可被省去。16何谓限制性内切核酸酶的切割频率?答：切割频率是指限制性内切核酸酶在某DNA 分子中预测的切点数。由于DNA 是由四种类型的单核苷酸组成，假定DNA 的碱基组成是均一的，而限制性内切核酸酶的识别位点是随机分布的，那么对于任何一种限制酶的切割频率，理论上应为14n，n 表示该限制酶识别的碱基数。如识别4 个碱基的限制酶，其切割频率应为每256 个碱基有一个识别序列和切点（144 = 1256），识别5 个碱基的限制性内切
9、核酸酶，其切割频率应为每1024 个碱基有一个识别序列和切点，余类推。18双酶消化法（double digest）绘制限制性内切核酸酶酶谱的原理是什么?答：双酶消化法是绘制DNA 中两个或两个以上限制性内切核酸酶图谱所采用的方法。做法是在两个限制性内切核酸酶分别单独消化DNA 分子的基础上，再用这两个酶同时或先后消化DNA，根据它们的结果构建物理图谱。17什么是限制性内切核酸酶的星号活性？受哪些因素的影响?答：II 类限制酶虽然识别和切割的序列都具有特异性，但是这种特异性受特定条件的限制，即在一定环境条件下表现出来的特异性。条件发生改变，限制酶的特异性就会松动，识别的序列和切割都有一些改变。改
10、变后的活性通常称第二活性，而将这种因条件的改变会出现第二活性的酶的右上角加一个星号表示，因此第二活性又称为星号活性。诱发星号活性的因素有如下几种：高甘油含量(5，vv)；限制性内切核酸酶用量过高(100UgDNA)；低离子强度(25mmolL)；高pH(80 以上)；含有有机溶剂，如DMSO、乙醇等；有非Mg2+的二价阳离子存在（如Mn2+、Cu2+、Co2+、Zn2+等）。19什么是DNA 多态性 (DNA polymorphism)?答：在正常人群中，各个体DNA 分子的某些位点可以发生中性改变，这些改变虽然会使DNA 一级结构产生一定变化，但不影响基因的表达，如果这种中性突变在人群中的频
11、率不低于1，这一现象被称为多态性。DNA 多态性本质上是染色体DNA 中核苷酸数目或排列顺序的个体差异，这些差异多数为中性突变，不引起表型改变。20什么是限制性片段长度多态性 (restriction fragment lengt hpolymorphism，RFLP)？答：当DNA 序列的差异发生在限制性内切核酸酶的识别位点时，或当DNA 片段的插入、缺失或重复导致基因组DNA 经限制性内切核酸酶酶解后，其片段长度的改变可以经凝胶电泳区分时，DNA多态性就可应用限制性内切核酸酶进行分析，这种多态性称为限制性片段长度多态性(RFLP)。22何为回文序列？答：回文序列（palindromic s
12、equence）是一段自我互补的序列，即同其互补链一样的序列（两者的阅读方向都是从53，)。根据回文序列的结构可分为：完全的回文序列、不完全的回文序列和间断的回文序列。完全回文序列（如GAATTC），通常是限制性内切核酸酶的识别序列；不完全的回文序（TACCTCCAT,CGTGATA），常是其他蛋白质的结合位点(如阻抑蛋白)，在基因表达调控中有重要作用；间断的回文序列（如GGTTXXXAACC，有一段是颠倒的重复），它可使单链的核苷酸有可能在tRNA 中所见到的一样，形成发夹环的结构。23DNA 连接酶的连接机理是什么？答：DNA 连接酶是利用ATP 或NAD+烟酰胺腺嘌呤二核苷酸(氧化型)提
13、供的能量催化DNA 双链间的缺口形成磷酸二酯键。在连接反应中，首先ATP (NAD+)与DNA 连接酶反应，同连接酶生成一种共价结合的酶-AMP 复合物。其中AMP(腺苷一磷酸)通过一种磷酸酰胺键同DNA 连接酶的赖氨酸残基的-氨基相连。同时释放出焦磷酸或烟酰胺单核苷酸（NMN）。AMP 激活DNA 一条链的5-末端磷酸基团, 并转移到磷酸基团上，形成DNA-腺苷一磷酸复合物。最后，3-OH 对激活的磷原子作亲核攻击，形成磷酸二酯键，同时释放出AMP。连接反应是由在形成酶-腺苷酸复合体时，焦磷酸水解和释放提供的能量驱动下进行的。在以ATP作为能源的连接酶中，一个磷酸二酯键的形成消耗掉两个高能磷
14、酸键。29列举质粒载体必须具有的基本条件。答：(1)能独立复制；(2)具有选择标记；(3)有独特的酶切位点；(4)能转化但不扩散。24DNA 连接酶的作用特点有哪些？ 连接反应需要在一条DNA 链的3末端具有一个游离的-OH, 而另一条DNA 链的5 末端具有一个磷酸基团(-P)的情况下，才能发挥其连接DNA 分子的功能作用，而在末端带有5-羟基和3-羟基；5-磷酸和3-二脱氧核苷基团的两个DNA 片段之间不起连接作用。 连接反应中需要 ATP 或NAD+ 和Mg2+ 为辅助因子和激活因子； DNA 连接酶不能够连接两条单链的DNA 分子，被连接的DNA 链必须是双螺旋的一部分。 DNA 连接
15、酶只封闭双螺旋DNA 骨架上的缺口 (Nick)，即在双链DNA 的某一条链上两个相邻核苷酸之间失去一个磷酸二酯键所出现的单链断裂，而不能封闭双链DNA 的某一条链上失去一个或数个核苷酸所形成的裂口25影响DNA 连接酶连接反应的因素主要有哪些？答：1) 反应温度：最佳反应温度37，但黏性末端之间退火形成的氢键结合不稳定，连接黏性末端的最佳温度，一般认为420比较合适。2) DNA 片段末端：不仅要考虑反应体系中DNA 末端的总浓度，还要考虑载体与插入片段的末端浓度的比例。原则上应保证一个DNA 分子的末端有较高的几率与另一 DNA 分子连接，减少同一个分子两个末端之间的自身连接。载体与插入片
16、段 3：1 1：3。3) 连接酶浓度：平末端DNA 分子的连接反应，最适酶量大约是12 单位；而黏末端DNA 片段间的连接，在同样的条件下，仅为 0.1 单位时，便能得到最佳连接效率。28切口平移法制备DNA 探针的原理是什么？答：在Mg 离子存在时，用低浓度的DNA 酶I（DNase I）处理双链DNA，使之随机产生单链断裂。然后用DNA 聚合酶I 的 5 3外切酶活性可以从断裂处的 5 端除去一个核苷酸，而其聚合酶活性则将一个单核苷酸添加到断裂处的 3 端。随着反应的进行，即5 端核苷酸不断去除，而 3 端核苷酸同时掺入，导致断裂形成的切口沿着DNA 链按合成的方向移动，这种现象称为切口平
17、移。如果在反应体系中加入放射性同位素标记的核苷酸，则这些标记的核苷酸将取代原来的核苷酸残基，产生带标记的DNA 分子，用作DNA 分子杂交探针。27碱性磷酸酯酶主要有两种，细菌碱性磷酸酯酶（BIP）和小牛肠碱性磷酸酯酶（CIP），二者有什么不同？在基因工程中有什么用途？答：主要差别是CIP 在68时失活，而BAP 在68稳定，且耐酚抽提。应用：dsDNA 的5端脱磷酸，防止DNA 的自身连接。但是用CIP 处理后，最好将CIP 除去，再进行连接反应。DNA 和RNA 脱磷酸，然后用于多核苷酸激酶进行末端标记。30举例说明什么是穿梭载体？答：穿梭载体是含有细菌质粒和克隆的真核生物DNA 片段的杂
18、种质粒，有两个复制起点和能在两种不同细胞中进行选择的选择标记，所以，很容易从一宿主转到另一个宿主 (来回穿梭)。38质粒制备的基本原理？答：带有质粒的细菌细胞在SDS 作用下裂解，并在碱性条件下使DNA 变性。调节pH 值至中性时，质粒DNA 首先复性，而细菌基因组DNA 不能复性而与SDS-蛋白质形成复合体，可以被离心沉淀除去。上清液中的质粒DNA 分子可被酒精沉淀或其他方法沉淀纯化出来。26什么是Klenow 酶？有哪些活性？在基因工程中有什么作用？答：Klenow 酶是1974 年Klenow 用枯草杆菌蛋白酶水解DNA 聚合酶I，得到的两个片段。其中大片段的分子质量为75kDa，它具有
19、53聚合酶和3 5外切核酸酶的活性，小片段具有53外切核酸酶活性。由于大片段失去了DNA 聚合酶I 中会降解5引物的53外切核酸酶活性，所以在基因工程中更有用。Klenow 酶主要有下列用途：(1) 修复反应，制备平末端。可用Klenow 酶修复限制性内切核酸酶或其他方法产生的5或3突出端，制备平末端，这样可以使原来具有不相容的黏性末端的DNA 片段通过平末端重组。如在反应系统中加入放射性同位素标记的脱氧核苷酸，用这种末端填补的方法可以制备3端标记的探针。用Klenow 酶修复5突出端的反应主要是利用了Klenow 酶的DNA 聚合酶活性，是填补反应；而修复3突出端则是用Klenow 酶的3
20、5外切核酸酶的活性，是切割反应。用Klenow 酶的切割反应来修复3突出端是不理想的，改用T4 DNA聚合酶或其他的酶是更好的选择。(2) 标记DNA 3突出端 (protruding end)。该反应分两步进行：先用3 5的外切核酸酶活性除去3突出端，产生3隐含末端，然后在高浓度的标记底物 (32P-dNTP) 存在下，使降解3 5) 作用与聚合 (53) 作用达到平衡。这种反应也叫交换或取代反应 (exchangereplacement reaction)。不过这一反应用T4 DNA 聚合酶的效果更好，因它的3 5的外切核酸酶活性较强。(3)其他的一些用途。包括用双脱氧末端终止法进行DNA
21、 序列分析、用于cDNA 第二链的合成、在定点突变中用于合成第二链、用引物延伸法 (primer extension) 制备单链DNA 探针等。31YAC 载体具有什么样的？为什么在克隆大片段时，YAC 具有优越性？答：（1）功能性DNA 序列:来自于酵母的125bp DNA 片段的着丝点序列 (CEN4)。来自酵母的自主复制序列 (ARS1)，起始在酵母中的DNA 复制。来自酵母的端粒序列，它是 (5-TGTGGGTGTGGTG-3) 的多拷贝重复，它对染色体的复制和维持是必需的。在酵母中进行选择的标记基因，URA3（尿嘧啶生物合成基因）和TRP1（色氨酸合成基因）。寄主是这些基因的营养缺陷
22、性，只有带有这些基因的转化体才能在选择培养基上生活具有细菌的复制起始点和选择标记基因。YAC 载体通常含有ColE1 的ori 和氨苄青霉素抗性标记基因，可以在大肠杆菌中复制和繁殖，所以它也是一种穿梭载体。（2）优越性：YAC 能够容纳长达上千kb 的外源DNA，这是质粒和黏粒办不到的。大片段的插入更有可能包含完整的基因，在染色体步移中每次允许更大的步移距离，同时能够减少完整基因组文库所需的克隆数目。40为什么野生型的噬菌体DNA 不宜作为基因工程载体?答：(1) 噬菌体DNA 没有容载能力，因为噬菌体的头部对DNA 包装的量是有限制的，不能大于基因组的105，所以要将噬菌体改造成载体，必须削
23、减本身的分子大小；(2) 野生型的DNA 对于一些常用的酶都有多个识别和切割位点，不便于克隆；(3) 没有可供选择的标记；(4) 野生型的噬菌体具有感染性，因此不够安全。33什么是YAC？YAC 克隆载体常出现哪些问题？答：YAC 即酵母人工染色体（Yeast Artificial Chromosome）的缩写，是人工构建的染色体样大容量克隆载体，基本组成有着丝点、能在细菌和酵母中进行复制的复制起始点和选择标记及端粒。最大DNA 克隆片段可达到2000kb。问题有：(1) YAC 有嵌合现象，一个YAC 中克隆的DNA 片段可能来自两个或多个不同的染色体。在基因组文库中，嵌合体占克隆总数的10
24、60。(2) YAC 内部有重组现象，插入的DNA 较大，序列发生重排，导致和原来染色体的序列不一致，重组很难检出。(3) YAC 还有缺失现象，影响YAC 文库的代表性。(4) YAC 结构和酵母天然染色体结构相似，使用常规方法不易将YAC 和酵母天然染色体分开。(5) 构建好的YAC 转化原生质化的酵母菌，转化效率低。(6) 建好库后保存方便，但要筛选某个基因时工作量大32由于基因工程是人为改变遗传信息的操作，因此必须注意被操作基因的安全。进行严格地监控对质粒载体的安全是十分重要的。请问质粒载体的安全条件包括哪几个方面?答：(1) 非传递性和不被带动转移。对于多数基因克隆操作来说，都不希望
25、载体能够进行自主传递，也不希望被带动转移。(2) 具有条件致死突变，如温度敏感质粒pJC307 (ColE1 的衍生质粒) 在哺乳动物正常体温下就丧失复制能力，可防止克隆基因扩散，只存在于限定的宿主细胞中。(3) 一般情况下不希望与宿主染色体发生重组，因为重组后有可能给宿主带来突变。(4) 有较小的宿主范围。34什么是 BAC？BAC 载体的组成与优缺点有哪些？ 细菌人工染色体（BAC）是从大肠杆菌F 因子改造构建而来的，能够携带大约300kb 的DNA 插入片段。 载体具有 F 因子的复制起始点（oriS），可使载体维持每个细胞一个拷贝的水平。 载体包括有 4 个维持DNA 复制和拷贝数目的
26、基因，repE, parA, parB and parC。 具有一个抗生素选择标记基因，和 lacZ基因。在lacZ基因中组装有一多克隆位点，便于外源片段的插入和蓝白反应筛选克隆子。 插入的 DNA 片段非常稳定，可以在大肠杆菌细胞中维持数百代，而且不易发生重组和从寄主细胞中丢失。 主要缺点是每个细胞中的拷贝数少（12 个），使得分离和筛选较为困难。35利用pBR322 质粒插入失活分离带有外源DNA 片段的重组克隆的原理是什么？ 外源 DNA 片段插入在pBR322 质粒tetr 基因的编码序列内（BamHI）位点，使该基因失活； 体外重组反应混合物转化大肠杆菌 ampstets 菌株，并涂
27、布在amp 琼脂平板上，凡获得了pBR322质粒和重组质粒(AmprTets)的寄主细胞都可长成菌落； 将 amp 琼脂上的菌落原位影印在tet 琼脂平板上生长，对比这两个平板的菌落生长情况，凡在amp平板上能够生长而在tet 平板上不能生长的菌落，便是属于带有重组体质粒的转化子克隆；挑出这样的阳性克隆，扩增分离带有外源DNA 插入片段的重组体质粒。46分离DNA 时，为什么要在缓冲液中加入一定浓度的EDTA 和蔗糖？答： EDTA 是螯合剂，可同Mg2+螯合，使核酸酶失去了作用的辅助因子，而被抑制活性。 蔗糖增加缓冲液的黏度，保护DNA 不易断裂。36pUC 质粒利用-互补作用筛选重组子原理
28、是什么？答：pUC 系列质粒载体是在pBR322 质粒载体基础上改造来的，它用lacZ 基因取代了pBR322质粒载体上的tetr 基因。lacZ 基因编码-半乳糖苷酶的N 末端1-63 个氨基酸(-肽链)的DNA 片段, 在lacZ 基因内组入了一个多克隆位点（MCS），但不影响lacZ基因的功能。 pUC 载体的宿主（E. coli）携带一个编码-半乳糖苷酶C 端序列的基因片段, 它们本身用这个基因片段产生的-半乳糖苷酶片段是无活性的, 但它们可以通过-互补作用在体内相互弥补, 即两部分产物可以结合形成有活性的-半乳糖苷酶。当pUC 质粒引入大肠杆菌中，在含有指示剂X-gal 和 IPTG
29、 的诱导培养基上培养时，菌落成蓝色。如果在MCS 插入外源DNA 片段（基因），破坏了lacZ 基因的功能（插入失活），不再产生-肽链，不能和宿主细胞产生的多肽片段形成有活性的-半乳糖苷酶，形成的菌落是无(白)色的。因此，根据这种-半乳糖苷酶的显色反应，便可以检测出含有外源DNA 插入序列的重组体克隆。37自然界中具备理想条件的质粒载体为数不多，即使是ColE1 和pSCl01 这两个自然质粒也不尽如人意，通常需要进行改造。请问质粒改造包括哪些基本内容?答：基本内容包括：(1) 删除一些非必要的区段及对宿主有不良影响的区段；削减载体的分子质量，使载体具有更大的容纳外源片段的能力。(2) 加上易
30、于选择或检测的标记。(3) 限制性内切核酸酶的酶切位点的改造，便于外源基因插入到载体中的特定位置。(4) 加上一些调控元件，有利于克隆基因的表达。(5) 安全性改造，限定载体的宿主范围。42噬菌体载体具有哪些优点与不足?答：优点：(1) 基因组中有13 的非必需区可以被置换。改造成载体后，克隆的片段较大(可 达20kb)，而质粒载体的克隆片段只有几个kb；(2) 用噬菌体DNA 作为载体，即使不进行体外包装，转染的频率也比质粒转化的效率高，包装后的效率就更高了；(3) 可通过溶原化反应整合到寄主染色体上，当不需要外源基因大量表达时，可让 它以溶原性存在，若要表达，可通过诱导即可进入裂解途径，释
31、放出大量的噬菌体，得到的重组DNA 的拷贝数就会很多。缺点：(1) 包装比较麻烦，包装率不稳定，购买包装蛋白的费用高；(2) 没有质粒的用途广泛。43以置换型噬菌体作为载体进行克隆时，为什么说能够形成噬菌斑的就一定是重组体?答：改造的置换型噬菌体载体，重组入外源片段之后，总体积不能超过入基因组的105，不能小于又基因组的75。以置换型噬菌体DNA 作为载体，首先要分离左、右两臂同外源DNA 重组。如果没有外源片段，仅是两臂连接，长度短于久基因组的75，不能被包噬菌体颗粒，就不能感染寄主，也就不能形成噬菌斑。如果插入了外源片段后，总长度超过基因组105后，也不能包入噬菌体颗粒，自然也不能形成噬菌
32、斑。44M13 系列载体具有哪些优缺点?答：M13 克隆系统具有很多优点：(1) 克隆的片段大：M13 噬菌体的DNA 在包装时不受体积的限制，所以容载能力大。有报道，有些噬菌体颗粒可以包装比野生型丝状噬菌体DNA 长67 倍的 DNA(插入片段可达40kb)。(2)可直接产生单链DNA，这对于DNA 测序、DNA 诱变、制备特异的单链DNA 探针都是十分有用的。(3) 单链DNA 和双链DNA 都可以转染宿主，并可根据人工加上的选择标记进行筛选。M13 克隆系列的不足：(1) 较大的外源片段插入后，在扩增过程中往往不够稳定。一般说，克隆的片段越大，发生丢失的概率越大。(2) 单链载体分子感染的细胞中，往往是单链和双链混杂，分离双链比较麻烦。45黏粒载体具有哪些特点与不足
