1、基因工程原理绪论第1节 基因概念与基因工程的诞生一、基因工程概念：一般指利用分子生物学的手段，在体外操纵、改造、重建细胞的基因组，从而使生物体的遗传性状发生按人们的意志的定向变异。特点：基因工程能够打破种属的界限，在基因水平上改变生物遗传性，并通过工程化手段为人类提供有用的产品及服务。3.理论上的三大发现：DNA遗传物质、DNA双螺旋、遗传密码破译。4.技术上的三大发明：限制性内切酶、逆转录酶、载体。T4连接酶。第二节 基因的现代概念一、移动基因1.概念：在染色体基因组不同位置上移动的基因。也称跳跃基因。2.功能：异常基因功能现象的解释。3.分类:(1)插入序列( insertion sequ
2、ence，IS)：原核生物中存在，长度2Kb以下。共同结构特点：分子末端具有一段反向重复序列；插入位点两侧为同向重复序列；转位酶的作用：a.催化转化因子(IS)从IR处切离，b.识别插入染色体的靶点。(2)转位子（transposons）：由几个基因组成的特定DNA片段，长度大于2Kb，其中含有一个抗菌素抗性基因，广泛存在于原核与真核生物。二、断裂基因（split gene）-在真核生物核苷酸序列中插入有与氨基酸编码无关的DNA间隔区，使一个基因分隔成不连续的若干区段，此种编码序列不连续的间断基因即断裂基因。-内含子的一般特点:不同断裂基因内含子数目差异极大；不同来源内含子分子大小不同；内含子
3、长度超过外显子；并非所有真核生物都有内含子。-mRNA初级转录本的剪辑：真核细胞mRNA的5剪辑点GU开始，3剪辑点AG结尾，为保守序列。根据生命活动的需要可变剪辑。三、假基因（pseudogene）-概念：在核苷酸序列上与正常功能基因基本相同，但不具功能活性的失活基因。-根据假基因序列的特性不同分为：重复假基因-此类假基因与亲本基因具有较高的同源性，在染色体区段上串联重复而名。-假基因为什么无活性？假基因存在大量缺失和点突变。-假基因如何产生？假基因源于真基因，在进化中发生了失活突变而功能丧失。由于基因的多拷贝特性，一个基因功能丧失并不影响生命存活。加工的假基因（processed pseu
4、dogene）-此类假基因没有表现与亲本基因的相似性，而是表现出与基因转录产物的相似性。正常转录产物mRNA 5-端没有promoter，3-端加polyA。假基因没有启动子，没有内含子，3-端加polyA。-加工假基因形成机理（推测）：mRNA逆转录形成cDNA，再加入基因组。四、重叠基因：核苷酸序列存在着重叠的读框，因而表现出不同功能。根据开放读框不同分为：包含式（一个读框包含另一读框）、交叠式（读框之间的重叠）。第1章 基因工程的主要技术原理第1节 DNA的提取与纯化-由于提取DNA的目的、种类、所用的生物、组织材料、实验条件等不同，DNA的提纯有很多方法。其中最常用的是碱抽提法。1、质
5、粒DNA的提取1 .碱抽提法提取质粒DNA(1)原理：闭合环状的质粒DNA，在变性后形成两条单链的相扣状态，不会分离，复性快。染色体线性DNA和或有缺口的质粒DNA变性后双链分离，难以复性而形成缠绕的结构，与蛋白质SDS复合物结合在一起，在离心的时候沉淀下去。(2)所用的试剂作用 溶菌酶：能水解菌体细胞壁的主要化学成分肽聚糖中的-1，4糖苷键。在碱性条件（pH8）下有活性。 葡萄糖：-增加溶液的粘度，维持渗透压，防止DNA受机械力（震荡）的作用而降解。EDTA：Mg2+、Ca 2+的螯合剂，可抑制DNA酶的活性，防止DNA被酶降解。NaOH-SDS-NaOH：强碱，提供pH12的碱性条件，使D
6、NA双链变性。 -SDS: 溶解细胞膜蛋白和细胞内蛋白，并结合成“蛋白SDS”复合物，使蛋白质（包括DNA酶）变性沉淀。 NaAc-HAc缓冲液-冰醋酸把醋酸钠溶液的pH调到4.8。用来中和NaOH变性液，使DNA复性。-高浓度的NaAc有利于变性的大分子（蛋白质、DNA、RNA等）沉淀。 乙醇：用于沉淀DNA。-DNA分子以水合状态“溶于”水里，乙醇能夺去DNA分子的水环境。 RNase A-降解RNA渣滓，以免提取后的DNA中含有小分子的RNA。 TE缓冲液：DNA保存液。由Tris-HCl和EDTA配制。-Tris-HCl不含金属离子（不同于磷酸缓冲液或硼酸缓冲业），有利于以后操作；ED
7、TA抑制DNA酶，防止DNA被酶降解。 酚-氯仿（选用）-蛋白变性剂，进一步抽提DNA溶液中的蛋白质，使蛋白质沉淀。 但苯酚会残留在DNA溶液中。（现多用各种商品化的层析柱纯化DNA)。(3)碱抽提法提取质粒DNA的步骤第一步：溶菌-使用“溶液”溶解细菌细胞壁-溶液：50mM葡萄糖，25mM Tris-HCl(pH8.0)，10mM EDTA，4-5mg/ml溶菌酶，RNase A。第二步：破膜，蛋白质和DNA变性-溶液II 破坏细胞膜，蛋白质和DNA变性。-溶液II ：0.2N NaOH，1.0%SDS。第三步：中和-溶液III使DNA复性、并促使蛋白质-SDS复合物和染色体DNA、RNA沉
8、淀。-溶液III：3M 醋酸钠（用冰醋酸调pH至4.8）。第四步：离心除去沉淀-上清液中含有闭合质粒DNA。第五步：纯化DNA-上清液过柱或酚-氯仿抽提。第六步：沉淀DNA-0.6倍体积的异丙醇或2倍体积的乙醇。2. 影响质粒DNA产量的因素-最重要的是：菌株的遗传背景，质粒自身的拷贝数。(1)受体菌株-一般要使用endA基因发生突变的大肠杆菌菌株。如DH5、JM109、XL1-Blue等。-endA基因编码核酸内切酶，在Mg2+的存在下可将双链DNA消化成7bp的寡核苷酸片断。(2)质粒拷贝数-这是直接决定DNA产量的重要因素之一。质粒本身的性质所决定。(3)质粒大小-分子量大的质粒，拷贝数
9、少。2、基因组或其他DNA的提取1.细菌基因组DNA的制备(1)细胞裂解：10%SDS和蛋白酶K。37 温育。不用NaOH，防止基因组DNA断裂。(2)DNA纯化：CTAB(十六烷基三甲基溴化铵)除去多糖，酚-氯仿-异戊醇除去蛋白。(3)沉淀DNA：0.6倍体积的异丙醇。2. 哺乳动物细胞基因组DNA的抽提(1)组织粉碎-动物组织剪成小块，置液氮中冻结后研磨成细粉末。-组织培养的细胞用胰酶消化松散后直接使用。(2)细胞裂解-0.5%SDS和0.1mg/ml蛋白酶K。50 温育。-SDS是离子型去垢剂（detergent），可以使细胞膜崩解。(3)纯化DNA：用苯酚和酚-氯仿抽提除去蛋白质污染。
10、(4)沉淀DNA-用2倍体积的无水乙醇。（可以加入1/10体积的3M醋酸氨辅助沉淀）(5)用RNase除去RNA污染3. 从植物组织中制备 DNA(1)组织粉碎：用液氮冷冻后研磨成细粉末。(2)细胞裂解-用2%CTAB/2-ME (十六烷基三甲基溴化铵/2巯基乙醇）。或1% SDS和蛋白酶K。65 温育。(3)纯化DNA：用苯酚和酚-氯仿抽提除去蛋白质污染。(4)沉淀DNA：-用0.6倍体积的异丙醇（-20 oC）。（可以加入1/10体积的3M醋酸氨辅助沉淀） 。(5)用RNase A除去RNA污染3、DNA的定量和纯度测定1. 紫外光谱法-原理：DNA（或 RNA）在260nm波长处有特异的
11、紫外吸收峰，用微量比色杯（10l）在紫外分光光度计直接测定。2. 琼脂糖凝胶电泳估计-原理：溴化乙锭（EB）能插入DNA分子中，紫外光照射下能发红色荧光。与已知浓度的DNA电泳带荧光强度对比，就可以估计出DNA含量。4、DNA分子量的估计-一般使用琼脂糖凝胶电泳，与已知分子量的DNA标准混合液对比得知。第2节 DNA的凝胶电泳1、电泳的基本原理1.带电荷的分子在电场中会以一定的速率向与其电荷性质相反的电极移动，速度称为电泳迁移率。 2.电泳迁移率同电场的强度和分子本身所带的净电荷数目成正比。3.电泳迁移率同分子与介质的摩擦系数成反比。4.摩擦系数主要与分子的大小、形状以及介质的粘度有关。5.如
12、果电场强度一定（电压和电极距离）、电泳介质相同（电泳液和凝胶）：-分子在电场中迁移的速度主要取决于分子本身的大小和形状。-形状相似的分子的迁移速度主要与分子量相关: 分子量越大，移动越慢。-相同分子量的DNA：闭合环状卷曲超螺旋迁移最快，线性分子次之，伸展开环状最慢。如何确定电压？看正负级之间的距离，按照5V/cm标准上电压。二 、琼脂糖凝胶电泳1.琼脂糖：是一种线性多糖聚合物，从红色海藻产物琼脂中提取而来。2.琼脂糖凝胶-琼脂糖在水里（或电泳液）中加热到沸点后溶解，冷却后又凝固成均匀的的胶体“胨”。琼脂糖的浓度决定凝胶的空隙（密度），浓度越高，空隙越小。3.琼脂糖凝胶的分辨力-空隙大小决定其
13、分辨分子大小的能力。空隙小，分辨率高，小分子较易通过，而大分子难通过；空隙大，分辨率低，大小分子几乎以同等速率通过。琼脂糖的浓度（%） 分离DNA的片断大小（bp）0.3 5000010000.7 2000010001.4 6000300三 、聚丙烯酰胺凝胶电泳-优点是比琼脂糖凝胶的分辨率高的多。琼脂糖凝胶电泳（100050000bp），聚丙烯酰胺凝胶电泳（11000bp）。聚丙烯酰胺凝胶浓度（%） 分离DNA片断大小（bp）4.0 100010010.0 5002520.0 5014、凝胶染色1.染料：溴化乙锭（Ethidium bromide，EB）。2.原理：EB是扁平分子，能插入DNA
14、碱基之间，但不与琼脂糖结合。EB在300nm紫外光照射下能发红色荧光，即可显示DNA泳带在凝胶中所处的位置。荧光强度与DNA含量及大小成正比。第三节 核酸的分子杂交-DNA-DNA或DNA-RNA链杂交。用放射性同位素（32P或125I）标记的DNA或RNA探针。从而可以通过放射显影等方式来检测样品，来找到我们所需要的DNA或者RNA。主要过程：将双链DNA解链为单链DNA，与滤纸结合，加入探针温育，此时与探针杂交的DNA或RNA与探针结合，然后洗去为杂交的探针，通过放射显影来寻找。1、Southern blot-用DNA（或RNA）探针检测DNA样品。-操作过程：1.DNA通过限制性内切酶切
15、开。2.凝胶电泳跑出不同的条带，然后对电泳凝胶预处理。3.预处理：浸泡在0.25mol/L 的HCl溶液进行短暂的脱嘌呤处理之后，移至于碱性溶液中浸泡，使DNA变形并断裂形成较短的单链DNA片段，再用中性PH的缓冲液中和凝胶中的缓冲液。4.然后放在一个缸里，将所需材料按顺序堆放，从下往上分别是：碱性溶液（使双链DNA变成单链DNA），滤纸电泳胶NC膜（硝酸纤维素膜）滤纸草纸（大量用来吸水产生虹吸力，来转膜）重物（2公斤重物的作用是稳定下面的结构，使其不易倒塌）。-转移前先用短暂的紫外光照射使DNA片段被打断。5.转膜一小时之后，换下部分的草纸，靠近NC膜的不能移动以免移动NC膜。6.转膜一晚上
16、以后可以进行探针杂交。7.预杂交，southern杂交，洗膜，放射性自显影检测。-如果要回收所需的DNA，应该将样品一式两份，制备两个一样的胶，在胶旁边放一个荧光尺来定位，根据相对距离找到所需的DNA。二、Northern blot-用DNA（或RNA）探针检测RNA样品。3、 原位杂交-对应的菌斑或噬菌斑位置不变，可以直接找出阳性菌落。需要目的基因的探针。-方法：一块培养好的菌，然后用一块硝酸纤维膜轻轻盖在平板上（要确定硝酸纤维膜上的菌斑与平板的菌斑在同一位置，最简单的方法是用针戳两个不对称的洞进行定位），然后将印有菌斑的膜，经行溶菌、碱变性、酸中和、洗蛋白、80烘烤处理，溶解后的细菌中的D
17、NA通过与探针的杂交，然后通过放射自显影，可以在膜上发现一个亮点，通过与培养皿上的菌落对照，即可找到相应的阳性菌落。第4节 基因扩增技术PCR一、基因扩增（gene amplification)-指生物体内或体外人工方式使基因拷贝数大规模增加。有下列五种方式：1. 环境诱发扩增-在环境因子的诱发下，某些基因产生明显的扩增。如氨甲喋呤诱发二氢叶酸还原酶基因扩增。2. 基因的程序性扩增-在发育的某个阶段，某些基因的大量扩增。如非洲爪蟾卵子形成过程中rRNA基因的扩增。3. 基因组进化扩增-生物进化过程中基因组中某些基因的拷贝数增加，结果相关的基因聚集成簇。4. 基因工程扩增-载体携带目的基因在寄主
18、细胞中大量复制。5. PCR扩增-应用聚合酶链式反应（Polymerase Chain Reaction，PCR）技术，在体外特异性地扩增某个基因。2、PCR技术1.PCR技术的原理-模板DNA变性引物DNA复性引物DNA延伸(1)DNA模板变性（95）-双链DNA在受热后，配对碱基的氢键断裂，DNA两条链分开成为单链。(2)DNA模板与引物复性（40-65）-引物（primer）：人工合成的单链DNA小片断，碱基顺序分别与所要扩增的模板DNA双链的5端相同。(3)DNA链的延伸（72）-DNA聚合酶按碱基配对原则在模板上延伸DNA链。(4)一个循环结束，新一轮循环开始。变性复性延伸。-理论上
19、25-30次循环就可以合成225-230条DNA。2.PCR的过程(1)第一步 变性（denature）-94-95下5分钟，模板DNA双链完全变性成单链。(2)第二步 复性（anneal）-50-60下1分钟，引物优先与模板复性。引物的浓度高，引物的链短。(3)第三步 延伸（extend）-72下1-2分钟，Taq DNA聚合酶在引物的3端上加上核苷酸。(4)第四步 变性（denature）-94下1分钟，新合成的DNA双链又变性成单链模板。(5)第五步 重复（repeat）-温度循环：95下5分钟94下1分钟50下1分钟72下2分钟。3.PCR的特点(1)特异性强 PCR使用专门合成的DN
20、A引物。 延伸过程是在高温下进行。这就避免了一般DNA聚合酶污染和非引物延伸形成的DNA。提高了反映的特异性。(2)敏感性高：需要的模板量极低。-理论上只要一条模板链，32次循环就可合成约109条。(3)快速：整个PCR过程约4小时即可完成。(4)简便：对模板的纯度要求低。-不需要纯化，甚至可以直接用细菌。已固定或包埋的组织切片也可以直接用于作模板。(5)可以扩增mRNA-RT-PCR：先用逆转录酶将mRNA合成cDNA，再以cDNA为模板进行扩增。4.影响 PCR的因素(1)Taq DNA聚合酶-自从H.A. Erilish分离出耐高温的Taq DNA聚合酶，代替大肠杆菌DNA聚合酶Klen
21、ow片断（37 )，PCR技术才进入实用阶段。 热稳定性-Taq DNA聚合酶的最大特点是热稳定性，耐高温，非常适合PCR过程的反复高温变性要求。 最适温度高最适温度（75-80）、延伸速度（约35-150nt/s.酶分子）、最长延伸长度（6.7kb）。 Taq酶的功能缺点-具有5至3聚合酶活性和5至3外切酶活性，但没有3至5外切酶活性。 因此不能修复错误的碱基配对。合成超过600bp长度的DNA就有可能出现错配，用于克隆基因时必须测序。 Taq DNA聚合酶的激活剂-金属离子敏感（尤其是Mg2+）。 当dNTP（能结合Mg2+）的浓度为0.7-0.8mmol/L时，MgCl2的最佳浓度应是2
22、.0mmol/L。50mmol/L KCl也能激活Taq DNA聚合酶的活性。(2)其它耐热的DNA聚合酶Tth DNA聚合酶-无3至5DNA外切酶活性，但高温下能逆转录cDNA，又能扩增DNA。VENT DNA聚合酶有3至5外切酶活性，能够校正碱基的错配。能耐受100高温。 Pfu DNA Polymerase-有3至5的外切酶活性，5至3外切酶活性。是目前已发现的所有耐高温DNA 聚合酶中出错率最低的。但PCR产物为平端。 Taq Plus DNA Polymerase-是Taq和Pfu DNA聚合酶的混合物。Taq的PCR产物3端往往带有一个A。(3)引物（primer)位置：与待扩增的
23、模板DNA区段的两3端序列互补（5端相同）的短DNA。引物的长度：419=2.75x1011。即2.75x1011 bp的基因组中有一次完全与19个核苷酸的序列相同的机会（或机会是约210-11）。一般引物设计为长1530bp。引物的碱基序列-3端必须与模板正确配对，5端可以不配对。5端根据需要可设计成某个内切酶的切点顺序、RNA聚合酶识别序列、突变位点或生物素标记等，方便与以后操作。引物的碱基组成-尽可能提高G+C含量，以提高引物与模板的结合力。-避免连续相同碱基排列或内部回文序列。-避免形成引物二聚体（dimer）。两个引物之间不能有两个以上的连续碱基序列互补。引物的Tm值：Tm=（G+C
24、)x4 + (A+T)x2-一般估计：当引物中的（G+C）含量低于50%时，复性温度低于55。-实际复性温度选择低于Tm值5。-适当提高复性温度可以提高引物与模板结合的特异性，减少非特异产物的出现。引物的浓度-一般使用终浓度各0.5mol/L。简并引物-如果引物的序列是从基因产物蛋白质的氨基酸序列反推出来的，就必须考虑密码的简并性。需要合成多种序列的引物，彼此间只有一个或几个碱基差异。这样的混合引物称简并引物。套嵌引物（nested primers)-设计多组引物，结合位点依次位于前一组引物之间。增加扩增产物的特异性。-引物设计现在多用专业软件，如Primer5.0等。(4)模板（templa
25、te) 纯度：PCR对模板DNA的纯度要求不高。但不能有蛋白质变性剂、DNA酶、Mg2+的螯合剂等影响DNA聚合酶的活性。 模板的量：不能太多，100l反应体系中100ng足够。(5)dNTPs：dATP、dTTP、dCTP和dGTP的总称。 -一般反应体系中dNTP混合液终浓度用0.2mmol/L。 -浓度过高会抑制Taq DNA聚合酶的活性并增加错配率。(6)Mg 2+ 的浓度-Taq DNA聚合酶要求有游离的Mg2+ ，所以Mg2+浓度不能太低。但太高会增加非特异产物（杂带）。一般用1.5-4.5mmol/L的MgCl2终浓度。6. PCR技术的扩展(1)荧光实时定量PCR（Realti
26、mePCR或TaqMan PCR）-借助于荧光信号来检测PCR产物。可以做到PCR每循环一次就收集一个数据，建立实时扩增曲线，准确地确定CT值，从而根据Ct值确定起始DNA的拷贝数，做到真正意义上的DNA定量。-Ct值：样品到达域值水平所经历的循环数。(2)反向PCR-扩增两个引物外侧的未知序列（传统PCR只扩增两个引物质之间的已知序列）。-技术关键：把线性DNA模板转变成环形分子。使引物的外侧序列“转变”成内侧序列。(3)不对称PCR-技术关键：两个引物的浓度相差100倍。低浓度的引物（限制引物）首先被用完，随后只有高浓度的引物，继续合成单链DNA。最后产物中99%是单链DNA。(4)反转录
27、PCR（RT-PCR)-扩增RNA模板。如mRNA或RNA病毒。-技术关键：利用反转录酶，把RNA反转录成cDNA，再以cDNA为模板进行PCR扩增。7. PCR技术的应用(1)扩增某一段DNA-从基因组中扩增；从载体上扩增；组织样本原位扩增；微量残留DNA扩增；分析模板序列。(2)基因的体外诱变-在基因的某处引入核苷酸突变（缺失、重复、插入、替换等）。技术关键：利用引物的5端序列不要求与模板严格配对，设计引物时引入突变序列。(3)基因组的比较研究(RAPD，Random amplified polymorphism DNA)-比较不同物种之间的基因组特征和相似性。-利用6bp长度的随机序列引
28、物扩增细胞中的总DNA，将会得到许多非特异性产物，反映了该引物序列在基因组中的分布状况。-类似于限制性内切酶片断长度多态性（RFLP）分析，因而也称为随机扩增多态性DNA（RAPD）分析。第5节 DNA序列分析1、双脱氧链终止法1. 原理（1）DNA复制是以一条链为模板，按碱基配对的原则进行的。 （2）脱氧核糖的连接是以3，5磷酸二脂键。 （3）复制反应可以在体外进行。 （4）2和3双脱氧的ddNTP会使复制反应终止。2. 技术要点（1）制备单链DNA模板（就是待测序的DNA链）。（2）制备一小段单链引物（带有放射性或荧光标记的DNA或RNA）。（3）特殊的DNA多聚酶不能有5至3和3至5的外
29、切酶活性； 与模板的亲和力高，不会提前脱离模板。（4）制备2和3双脱氧的ddNTP-dNTP / ddNTP = 100 / 1时, DNA电泳带谱的分离效果最好，可读出200多个核苷酸序列。3. Sanger双脱氧终止法测序过程（1）先将设计好的引物与单链待测DNA链连接。（2）然后加入dNTP使其沿着链扩增。（3）加入ddNTP后，ddNTP会随即的代替dNTP插入序列中。ddNTP一旦插入序列，序列即停止衍生。于是得到长度不同的序列。（4）凝胶电泳，根据四组荧光确定末端的ddNTP是哪一种碱基，根据在凝胶电泳上的位置来确定片段的长度即延伸到哪里。（5）从小片段到大片段读出引物的序列，引物
30、的序列从5往3读，然后DNA序列就是倒过来即可，注意方向。-使用4种荧光标记混合测序不好，因为同时使用4种荧光标记，首先辐射量超大，其次很贵，4次分开做虽然麻烦一点但是效果也不差。-读胶的方法：从上往下读，看到T写A，看到G写C，看到A写T，看到C写G，连贯的写出来就是待测DNA的序列。2、Maxam-Gilbert化学修饰法1.原理-末端放射性标记的DNA片单链，经过化学试剂处理，向特定的碱基中引入化学基团，DNA在被修饰的核苷酸位置断裂，产生长度只差一个核苷酸的DNA链混合物，经行凝胶电泳，放射性自显影，阅读碱基顺序。2.碱基特异的化学修饰法G：pH8.0,用硫酸二甲脂对N7进行甲基化，使C8-C9键对碱基裂解有特殊敏感性。A+G：pH2.0,哌啶甲酸可使嘌呤环的N原子化，从而导致脱嘌呤，并因此削弱腺嘌呤和鸟嘌呤的糖苷键。C+T：肼可打开嘧啶环，后者重新环
