1、再生障碍性贫血免疫发病机制及免疫治疗再生障碍性贫血免疫发病机制及免疫治疗邵宗鸿1 , 袁烨21 天津医科大学总医院血液肿瘤科, 天津300052; 2中国医学科学院血液学研究所血液病医院, 天津300020再生障碍性贫血(AA) 是造血系统“重症”之一,明确其发病机制, 进而因症施治, 具有重大临床价值和学术意义。传统观念认为, AA为物理、化学或生物因素引起的造血组织“种子虫子土壤”异常、造血功能衰竭“综合征” 1 - 9 。该“综合征”实际上涵盖了所有“骨髓衰竭”,即多种“病”共有的“症”, 而非独立的疾病体系。正因为如此, 多年来围绕可表现为骨髓衰竭的AA、阵发性睡眠性血红蛋白尿症( P
2、NH ) 、骨髓增生异常综合征(MDS) 、免疫相关性全血细胞减少症( IRP) 等产生许多“歧义”, 甚至有互相交叉、矛盾的认识, 如: AA和MDS均为排除诊断, “排除”对“排除”等于无法诊断; PNH与AA “互转”或“互含” ( “AA - PNH综合征”) ; IRP被误诊为“早期AA”、“增生性AA”、“免疫性MDS”等。由于认识混乱, 进而影响到所有骨髓衰竭性疾病的诊断和治疗。近年, 国内外学者对AA的认识较传统观念有了明显进步: (1) 界定了“骨髓衰竭综合征”不等于“AA”,AA只是该综合征中的一种; (2) 明确了AA的主要病理机制是T细胞功能亢进引起的造血组织损伤, A
3、A是一种自身免疫性疾病; (3) 肯定了免疫抑制治疗对AA的作用。这3点进步纯化了人们对AA的认识, 使AA由人们认识疾病过程中的初级阶段( 100余年的综合征! ) 过渡到相对高级阶段(独立疾病体系) , 这不仅有益于AA的正确诊断和治疗、有益于深究AA病因, 而且有益于减少对其它骨髓衰竭性疾病认识上的干扰。现对AA免疫发病机制及免疫治疗进展概述如下。1AA免疫发病机制众多研究表明, 细胞免疫异常是AA发病机制中的主要环节, 强化免疫抑制治疗对AA的显著疗效也成为其佐证, 这使得AA因为免疫特征而得以从众多骨髓衰竭症中被识别 2 - 5 。1.1AA患者免疫状态1.1.1天然免疫与正常人比较
4、AA患者CD4+ 细胞表达TLR(Toll蛋白样受体)基因上调 10 。TLR能识别脂蛋白抗原, 参与天然免疫反应。1.1.2特异性免疫AA发病主要与细胞免疫异常有关。1.1.2.1免疫激活(1) CD4+和CD8+T细胞都被激活:CD69为T细胞激活标志,SAA患者骨髓CD4+ 和CD8+细胞及慢性AA(CAA) 患者CD8+细胞在受植物血凝素(PHA) 刺激前CD69表达率高于正常对照, 受PHA刺激后CD69表达率更明显增高, 尤以CD8+细胞群变化明显 11 。这说明再障患者的T细胞处于预激活状态, 对外来刺激的激活潜能大。(2) T细胞在抗原刺激下克隆性增殖: TCR - V的CDR
5、3序列是T细胞克隆的区分标志。研究表明, 正常对照组的CDR3 大小分布呈高斯曲线, 而AA患者曲线出现数个寡克隆峰。以CD28为激活的T细胞分选标记, 这群细胞中CDR3优势克隆比例尤其高, 并且随访发现CDR3优势型克隆比例与AA病情有相关性。取AA患者优势CDR3型克隆结合患者HLA做序列分析, 发现HLA相似的患者优势CDR3克隆的序列也呈高度相似性, 说明各患者CDR3克隆增殖有共同机制。进一步的试验通过比较去除优势克隆的T细胞仅对异基因造血干细胞有杀伤作用, 而没有经这样处理的患者T细胞对自身细胞也有杀伤作用。综合这些实验结果, 可以推测克隆性增殖的细胞毒性T细胞是导致骨髓衰竭的重
6、要原因, 这些细胞的增殖可能由自身细胞抗原以共同的机制诱导 12, 13 ; (3)T细胞激活过程中存在精细调节: CD4+ 和CD8+细胞根据主要分泌的细胞因子不同分为Th1、Tc1细胞(分泌I型因子IFN-和IL- 2) 和Th2、Tc2细胞(分泌型因子IL-10及IL-4) 。两型细胞通过各自分泌的细胞因子互相抑制, 比如IL-10有抑制IFN-和TNF-的作用。AA患者Th和Tc细胞都向I型细胞极化, CD4+细胞在这种调节中的作用突出14,15 。CD4+细胞上的TLRs触发细胞因子尤其是IFN-的释放并诱导协同刺激分子表达介导CD4+细胞向Th1细胞增多方向极化, 激活的细胞进一步
7、释放IFN- 16 。一方面因子本身对造血干祖细胞有细胞毒作用, 一方面可以使CD8+细胞激活, 并且主要是Tc1细胞增多, 释放大量TNF-, 最终导致干祖细胞凋亡。我们通过对比去除CD4+细胞前后的AA患者骨髓单个核细胞对外来刺激的CFU-E产率有明显差异证明CD4+细胞在AA发病中的重要作用, 认为与其它全血细胞减少疾病相比, AA存在CD4+激活释放大量IFN - 的独特机制 17, 18 。1.1.2.2免疫耐受打破AA发病中免疫激活的过程同时伴有免疫耐受打破的过程, 表现出自身免疫性疾病的免疫反应特征。CD8+ 细胞与同种抗原作用后由初始细胞转变为表达KIR的记忆性T细胞, 同时维
8、持自身抗原免疫耐受的PF-4 (血小板因子4) 基因表达下调、分泌减少,从而使CD8+细胞获得对自身抗原的免疫活性。树突细胞(DC) 是最重要的抗原递呈细胞。我们的研究表明, AA患者较正常人DC1细胞(CD11c+ ) 占骨髓单个核细胞的比例增高; DC1 细胞分为成熟与不成熟两群, 分别表达CD83和CD1a, AA患者的两群细胞比例均增高, 且前者增高更明显; 恢复期患者的总DC1、成熟DC1与不成熟DC1比值均与健康人无差别, 同时测得Th1 细胞比例在AA患者增高, 与DC1比例增高有相关性, 说明DC1活化与患者免疫耐受被打破、大量Th1细胞极化有关。一项在AA患者和健康人中进行的
9、研究发现, AA患者的DC1在骨髓单个核细胞的比例增高, 并且能够递呈抗原并激活Th0向Th1转化的成熟DC1增多更明显。诱导免疫耐受的未成熟DC1与成熟DC1的失衡可能在AA发病免疫耐受被打破的环节中有重要作用。我们近期发现: AA 患者Th3细胞(CD4+TGF-+) 、Tr细胞(CD4+, CD25+ ) 均较正常人减少, 血清中的TGF - 也降低, 这些说明AA患者细胞免疫耐受被打破。1.2 异常免疫的效应1.2.1 细胞因子的造血负调控作用1.2.1.1 负调控因子量 AA患者表达增高的细胞因子包括干扰素 ( IFN -)、白细胞介素-2(IL-2)、肿瘤坏死因子(TNF-)。AA
10、患者血液和骨髓液的IFN-和TNF-增加 , 淋巴细胞胞浆的IFN-和 TNF-表达率也高于正常对照 , 说明其在 AA发病中有重要作用。这些细胞因子主要由淋巴细胞分泌 , 骨髓基质细胞也产生少量IFN -。来自骨髓基质细胞的负调控细胞因子量相对少 , 但由于 AA患者干祖细胞的黏附分子 CD49d和CD49e表达上调 , 使其与基质细胞黏附作用增强 , 加之作用距离近 , 也可能产生显著的造血抑制19。从AA患者CD4+和CD8+细胞各基因表达变化来看 , 这两类细胞可能都通过近距离地接触靶细胞或通过细胞毒性分泌负调控因子近距离作用而使损伤具有组织特异性。1.2.1.2 负调控因子受体 AA
11、患者骨髓液及血清中游离肿瘤坏死因子受体1 (TNFR1)、肿瘤坏死因子受体2(TNFR2) 水平较高 , 并且血清受体水平与表示T细胞早期激活水平的 CD69表达率有相关性。CD34+细胞TNFR受体也上调 , 并且免疫抑制治疗有效的患者治疗后受体水平下降。提示 AA患者负调控因子增加和靶细胞上的受体增加共同作用致病。基因水平的研究还证实 IFN-受体基因在 AA患者CD34+细胞表达上调。1.2.1.3 负调控因子作用机制 (1) 一氧化氮(NO):一氧化氮合酶 (iNOS) 是合成 NO必需的酶。 IFN-使iNOS的基因上调 , 并通过 I RF - 1活化 NOS, 从而增加NO合成。
12、NO通过造成 DNA损伤和促进凋亡及与凋亡无关的途径等多重机制造成骨髓衰竭。试验证实 , AA患者骨髓单个核细胞iNOS基因表达,而正常人或者骨髓移植治愈后的患者该基因不表达。患者骨髓液 NO浓度也高于正常对照,并且如果阻断 NO作用, IFN-和TNF-对CD34+细胞的凋亡及抑制造血作用都消失,说明这两种负调控因子都可能通过 NO通路产生骨髓抑制作用或者 NO可以增强其作用。其他氧自由基也可能是负调控因子对造血干祖细胞抑制作用的中介; (2)p38通路:AA患者IFN-和TNF-均增加。体外扩增的细胞在加入IFN -和TNF -前后的蛋白质差异表达分析发现加入这两种负调控因子后细胞表达激活
13、的 p38a, 并且在这两种负调控因子作用后细胞表达活性 MAPKK2, 而加入 p38a阻滞剂后就不表达MAPKK2, 原本出现的细胞增殖受抑现象也被逆转, CD34+细胞凋亡较不加入p38抑制剂时减少。说明负调控因子通过激活 p38激酶和其下游的 MAPKK-2, 再通过与凋亡相关分子的信号传递触发凋亡。p38的激活是对 IFN -敏感的基因转录受抑制和 IFN -抑制造血的重要环节。对被紫外线造成断裂的细胞模型的观察发现激活的 p38还可以阻断细胞周期而抑制造血。1.2.2 凋亡1.2.2.1Fas途径 干祖细胞本来不表达凋亡受体,在某些负调控因子作用下,凋亡相关受体基因表达增加,诱导干
14、祖细胞上出现 Fas受体, Fas与其受体的结合是导致凋亡的最重要环节。CD4+细胞触发的凋亡主要通过这一途径。CD8+细胞也可以经此途径。1.2.2.2 穿孔素途径 一般仅见于CD8+细胞触发的凋亡。CD8+细胞在数量上不占优势 , 故这种凋亡途径比 Fas途径更少见。研究发现,AA患者的细胞毒性颗粒T细胞数量和穿孔素较对照组水平增加,说明细胞毒性 T细胞释放穿孔素在发病机制中有重要作用。细胞毒性 T细胞分泌穿孔素将靶细胞打孔,细胞毒性颗粒(主要是颗粒酶B和A)通过孔进入靶细胞内,导致细胞凋亡,但是并不除外这些细胞毒性颗粒在 Fas介导的凋亡过程中也起作用。2AA的免疫治疗AA的免疫治疗包括
15、免疫抑制和免疫支持。2.1 免疫抑制治疗 免疫抑制治疗是 AA的“治本”治疗,也是“扛鼎”治疗。其总的机制是:抑制 T淋巴细胞,降低 T淋巴细胞产生的造血负调控因子,解除此类因子对造血细胞的抑制或(和)破坏,进而重建造血。该类治疗主要包括抗淋巴细胞球蛋白或抗胸腺细胞球蛋白(ALG或ATG)、环孢素A(CsA)、肾上腺皮质激素类、大剂量静脉人血丙种球蛋白 ( HDIVIG)、环磷酰胺(CTX) 及干细胞移植 (特别是“微移植”) 前的“预处理”等。2.1.1 抗淋巴细胞球蛋白 (ALG) 或抗胸腺细胞球蛋白(ATG) 自20世纪70年代 Mathe首次将该类制剂用于重型AA(SAA) 以来,其已
16、成为 AA(特别是SAA) 的主要免疫抑制手段 (甚至包括干细胞移植前的预处理 )。该类制剂治疗 AA的机制虽然说法很多,但主要是抑制或破坏 T淋巴细胞。该类制剂有马、兔、猪等不同来源 , 不同来源的制剂临床用量不同 , 如法国产的马 ALG一般用量为 1015 mg/(dkg),德国产的兔ATG为 35 mg/( dkg),疗程5d。用药前应做过敏试验(阴性者方可用)。用药过程中应尽量为患者创造无菌环境、密切注意生命体征、及时处理过敏反应(切勿大意!);用药后一周左右可出现血清病反应(发热,充血、出血,或混合性皮疹、关节酸痛等),可用肾上腺皮质激素处理之。ALG/ATG多不单用,可与CsA、
17、雄激素、造血刺激因子合用 (IST +HGF联合方案 )。起效时间一般在用药后 69个月,个别可早或晚(晚者可达36个月才起效!)。起效规律一般是“脱血、长髓、长血”。联合方案的有效率可高达 80%左右,并有取代造血干细胞移植趋势。2.1.2 环孢菌素A(CsA) 这是20世纪80年代末、90年代初开始用于AA的一种免疫抑制剂。其主要机制是抑制T辅助细胞中的Th1亚群(也抑制Th2亚群,故还可用于治疗 B淋巴细胞功能亢进性自身免疫性溶血、免疫性血小板减少、Evans综合征及免疫相关性全血细胞减少症等),减少白细胞介素-2(IL-2)的产生,阻断 T抑制细胞的激活。该药有针剂、口服液、胶囊 3种
18、剂型 ,AA治疗多用后2种,针剂多用于移植或白血病耐药逆转。该药治疗AA的常规用量为35mg/(kgd),血象恢复到一定程度还要酌情减量,剂量过大时患者无法耐受其不良反应。该药疗程要长,一般需小剂量(可小至25mg,每日13次 )巩固24年。CsA治疗AA的有效血药质量浓度尚无人报道(工作量太大! ),但从临床反应与剂量关系看, 定远小于器官或骨髓移植所需要的血药质量浓度(200400ng/L)。CsA与ATG/ALG在AA治疗上有互补作用,故联用效佳。不夸张地说,CsA的出现不仅提高了ATG或ALG治疗SAA的疗效,且减少了复发。单用CsA加雄激素治疗 AA也有较高疗效 (60%左右) ,
19、但多起效慢 , 支持治疗花费多。CsA的主要副反应是消化道反应、齿龈增生、色素沉着、肝肾功能损害 , 极少数患者出现头痛和血压变化。出现毒副反应时应减量、加辅助药(如保肝药)甚至不得不及时停药。2.1.3 肾上腺皮质激素类 该类药用于治疗 AA较早,以甲基泼尼松龙和泼尼松为代表。其主要机制是抑制淋巴细胞(特别是B淋巴细胞)。单用或仅与雄激素合用主要见于 20世纪七八十年代 , 疗效在 30%左右; 80年代以后主要与 ALG或 ATG合用。以泼尼松为例 , 一般1mg/(dkg) , ATG或 ALG后第 15天开始逐步减药 , 第 31天减完。对该类药快速显效的“AA”, 应注意不发作性 P
20、NH(骨髓低增生 )、自身抗体介导的免疫相关性全血细胞减少症及急性造血功能停滞的可能。2.1.4 大剂量静脉免疫球蛋白 (HDIVIG) 该药与 CsA和雄激素合用治疗AA的确有一定疗效 ( 40% 70% )。其机制也有多种说法 , 包括封闭巨噬细胞膜上的 Fc受体(保护结合了自身抗体的成熟和不成熟血细胞 )、抑制自身抗体产生、调整 T细胞亚群平衡等。用法为静脉滴注400 mg/(kgd) ,疗程 5 d; 也有1000 mg/ ( kgd) ,疗程2d。对该药快速显效的 “AA”也应想到自身抗体介导的免疫相关性全血细胞减少症的可能。该药的主要副反应是过敏反应、传播感染。2.1.5CTX 该
21、药治 AA始于 20世纪 60年代 , 90年代美国学者又有报道。理论上讲 , 该药肯定能杀淋巴细胞(包括 T、B淋巴细胞 ); 但在一定时间内有加重骨髓抑制的风险 (因其也杀残留的造血细胞 )。若支持治疗很强 ,患者家属有冒风险的思想准备 , 可慎用之。英国及美国国立卫生院专家对 CTX治疗 AA持否定态度。评价上述免疫抑制剂对 AA的疗效 , 一要看患者的免疫抑制情况 ( T细胞亚群数量、比例及其分泌的造血负调控因子水平是否恢复正常 ); 二要看造血功能恢复程度(输成分血频度、出血和感染频度、血象、骨髓涂片及活检、造血干祖细胞集落培养 ) ; 三要看药物的毒副反应(肝、肾功能等 )。只有当
22、患者安全地 (无毒副反应 ) 恢复 T细胞功能并进而完全恢复造血功能时才能称之为“ 治愈 ”。2.2 免疫支持治疗 AA的免疫支持治疗是指在 “治本治疗 ”未奏效前为控制 “ 粒缺 ”相关性感染、输血相关性肝炎所采取的增强体液免疫、调整细胞免疫、提高非特异性免疫功能的措施。其包括小剂量静脉输注人血丙种球蛋白 (LDIVIG)、胸腺肽、“白膜”输注等。2.2.1LDIVIG这是控制 AA合并感染最常用的免疫支持治疗。其机制是利用正常人血免疫球蛋白中的抗细菌、真菌和病毒成分帮助 AA患者通过抗原抗体反应、激活补体反应、条理素反应等消灭或抑制病原微生物、控制感染。常用剂量为 215510 g/d。可
23、有热原反应。2.2.2胸腺肽 有些 AA继发于病毒性肝炎 (肝炎相关性 AA) , 有些 AA合并输血相关性肝炎。此类 AA患者应加用抗肝炎病毒的治疗。抗肝炎病毒治疗目前主要有 3种:干扰素、胸腺肽和拉米夫定。干扰素有抑制骨髓之嫌 , 在 AA不能用; 拉米夫定仅适用于乙型肝炎病毒; 惟胸腺肽适用于 AA合并各型病毒性肝炎。胸腺肽的主要机制是调整 T细胞免疫 , 进而清除或抑制病毒。胸腺肽常用剂量为 2040 mg/d, 静脉输注 , 用前最好做过敏试验。2.2.3“白膜”输注 极重型 AA (VSAA) 合并严重感染时 , 凭抗生素及其它支持治疗有时不奏效 , 可考虑输注“白膜”, 即借用献
24、血员的白细胞 (主要是中性粒细胞)提高 VS AA患者的非特异性免疫功能 , 杀灭患者体内的病原微生物 , 进而控制感染。一般成人剂量为每日 1次 , 每次 1020 U, 最好连输 23d。输注“白膜”的副反应是易致患者体内产生同种抗体 , 进而使将来再输血时“无效输注” (输入的血细胞被同种抗体破坏) 或做器官及骨髓移植时失败。故一般不采用此治疗 , 除非万不得已时 (救命必需 )。AA的免疫支持治疗旨在 “去症 ” 。考核其疗效主要是看感染控制情况。总之 , 无论“治本”,还是“去症”, 免疫治疗对AA都是至关重要的。只有及时、适量、合理地应用这类疗法 , 才有望将 AA -造血 “ 沙
25、漠 ”变为造血 “ 绿洲 ” 。参考文献 1 Rosenfeld S, Follmann D, Nunez O, et al . Antithymocyte globulin and cyclos porine for severe aplastic anemia: association between hematologic response and long - term outcome J . JAMA, 2003,289: 1130 - 1135. 2 Saunthararajah Y, Nakamura R, Nam JM, et al . HLA - DR15 (DR2) is
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