1、第七章 植物基因工程,一、高等植物的遗传特性,染色体的多倍体性,植物的基本特征,植 物,低 等 植 物,藻类 地衣,高 等 植 物,无根、茎、叶等分化器官,合子不经胚直接发育为个体,含根、茎、叶、花、果分化器官,合子经胚再发育为个体,苔藓门 蕨类门 裸子门 被子门,遗传操作的简易性,大多数高等植物具有自我授精的遗传特征，通常能产生大量的后代；而且借助于如风、重力、昆虫传播等自然条件，授精范围广、速度快、效率高。因此，即便是频率极低的基因突变和重组事件，其遗传后果也易被观察。,整株植物的再生性,植物损伤后，会在伤口长出一块软组织，称为愈伤组织。如果将一小片鲜嫩的愈伤组织取下，放在含有合适营养和植
2、物生长激素的组织培养基中，则这些细胞便会持续生长并分裂成悬浮液。将这些细胞涂在特定的固体培养基上，就会长成新的幼芽，并且这些愈伤组织重新分化成为叶、根、茎，最终成为整株开花植物。,整株植物的再生性,植物细胞通常不能有效地吸收外源DNA，因为它们具有纤维素构成的细胞壁。可用纤维素酶处理植物细胞壁，形成原生质体，待吸收DNA分子后，经过再生，再通过愈伤组织形成培育出整株植物。这项技术有一定的局限性，即大多数单子叶农作物（如谷类作物）很难从原生质再生出完整细胞。,（四）染色体的多倍体性,很多高等植物拥有比人类更大的基因组，并以多倍体的形式存在。大约三分之二的禾本科植物呈多倍体型，其染色体数目范围从2
3、4至144不等。这种多倍体植物在组织培养过程中呈现出较高的遗传不稳定性，导致体细胞变异,1983 年美国和比利时首次将外源基因导入烟草和胡萝卜1994 年世界上第一种耐储藏的番茄在美国批准上市1995 年转基因抗虫、抗除草剂玉米和棉花在美国投入生产2000 年美国转基因大豆的种植面积首次超过普通大豆 迄今为止世界上共批准了12种作物、6大类性状的48个转基因品种进行商业化生产，其中包括水稻、玉米、马铃薯、小麦、黑麦、红薯、大豆、豌豆、棉花、向日葵、油菜、亚麻、甜菜、甘草、卷心菜、番茄、生菜、胡萝卜、黄瓜、芦笋、苜蓿、草莓、木瓜、猕猴桃、越橘、茄子、梨、苹果、葡萄等。,高等植物基因工程的发展历程
4、,三、高等植物的基因转移系统,Ti 质粒介导的整合转化程序,植物病毒介导的转染程序,植物细胞的直接转化程序,植物原生质体的再生程序,（一）Ti 质粒介导的整合转化程序,几乎所有的双子叶植物尤其是豆科类植物的根部常常会形成根瘤（冠瘿瘤），这是由于植物根部被一种革兰氏阴性土壤杆菌农杆根瘤菌（A.tumefaciens）感染所致，其致瘤特性是由该菌细胞内的野生型质粒 Ti质粒（Tumor-inducing plasmid）介导的，又称肿瘤诱导质粒。,Ti 质粒的结构与功能,（1）Ti 质粒的图谱区整个质粒160-240 kb T-DNA区、Vir区、Con区、Ori区其中T-DNA 12-24 kb
5、tms的编码产物负责：合成吲哚乙酸tmr的编码产物负责：合成植物分裂素tmt的编码产物负责：合成氨基酸衍生物冠瘿碱,转移DNA，编码冠瘿碱的合成，能随机整合到植物的染色体上。长度一般为12-24kb，是Ti质粒最重要的部分。,T-DNA（transfer-DNA）,tms、tmr基因分别控制合成植物生长素与分裂素，促使植物创伤组织无限制地生长与分裂，形成冠瘿瘤;iaaM（tms1）和iaaH（tms2）控制由色氨酸产生生长素吲哚乙酸的生物合成途径.,tmt 基因编码产物催化合成冠瘿碱(Opines)。冠瘿碱的代谢产物为氨基酸和糖类，是根癌农杆菌生长必需的物质，供根癌农杆菌作为营养使用。是农杆菌
6、的碳源和氮源。大部分其他土壤微生物都不能利用冠瘿碱。,在T-DNA 的两端还含有左右2 个边界，左边界(left border,LB)和右边界(right border,RB)是长为25bp的末端重复顺序，在切除及整合过程具有重要意义。,毒性基因（vir）,决定土壤农杆菌对植物的感染和T-DNA的转移，进入和整合。使根癌农杆菌表现出毒性。,Con 区(regions encoding conjugations，接合转移编码区)：该区段上存在与细菌间接合转移的有关基因，调控Ti 质粒在农杆菌之间的转移。,Ori区(origin of replication，复制起始区)：Ori区上的基因调控Ti
7、 质粒的自我复制。,第一步:植物受伤,植物受伤后能分泌酚类化合物（如乙酰丁香酮、羟基乙酰丁香酮），诱导Ti质粒上的毒性基因表达。,(2).农杆菌的感染和生存,第二步 感染植物,第三步 毒性基因（vir）表达,T-DNA上的产物催化产生过量的生长素和细胞分裂素，形成植物冠瘿瘤。,脓杆菌吸附于植物的表面伤口部位（常在茎的基部）。,virA、virG、virD、virB,第四步 T-DNA转移,T-DNA被vir基因产物切下来，并运送到植物细胞核里，整合到植物基因组中。,第五步 诱导冠瘿瘤,（6）第六步 土壤农杆菌代谢冠瘿碱。,裸子植物、双子叶被子植物、禾谷类单子叶植物（玉米,能够自发地整合到植物的
8、染色体上。能转化多种植物。强启动子,(3).Ti质粒转化的对象,(4).Ti质粒作为载体的可能性,T-DNA的opine合成酶基因上有一个强启动子，能启动外源基因的表达。,（5）Ti 质粒致瘤的分子机制：损伤的植物根部会分泌出乙酰丁香酸和羟基乙酰丁香酸，它们能诱导Ti质粒上的vir基因以及根瘤菌染色体上的一个操纵子表达。vir基因产物将Ti质粒上的T-DNA单链切下，而根瘤菌染色体上的操纵子表达产物则与单链T-DNA结合形成复合物，转化植物根部细胞。,（6）T-DNA的染色体整合机制,野生型Ti 分子大（200kb）操作起来十分麻烦；各种限制型酶切位点多，切割产生很大片段。且单一的酶切位点很少
9、；tms和tmr 基因产物干扰植物内源激素的平衡，产生冠瘿瘤，阻碍转基因植物细胞的分化和再生；冠瘿碱的合成过程消耗大量的精氨酸和谷氨 酸，直接影响转基因植物细胞的生长代谢；无大肠杆菌的复制起点和作为转化载体的选择标记基因。,(7).天然Ti质粒作载体的缺点,（8）、Ti 质粒的改造,除去生长素（tms）和分裂素（tmr）生物合成基因；,除去T-DNA上的有机碱生物合成基因（tmt）；,安装大肠杆菌复制子，使其能在大肠杆菌中复制，以利于克隆操作；,安装植物细胞的筛选标记，如 neor 基因，使用植物基因的启动子和polyA化信号序列；,插入人工多克隆位点，以利于外源基因的克隆。,除去 Ti 质粒
10、的其它非必需序列，最大限度地缩短长度；,改造后的Ti质粒载体模式,left,right,M C S,AMPr,ori,Vir,select,9.Ti载体的类型,（1）共整合载体（cointegrate vectors）,最早获得广泛应用的Ti质粒是比利时科学家P.Zambrisky等1983年改造的pGV3850,需要同源重组才能插入外源基因。,pGV3850的特点：,是一种受体质粒，外源基因不能直接插入，而是需要借助于pBR322质粒作为中间载体。,宿主土壤农杆菌的选择标记是位于中间载体pBR322上的卡那霉素抗性（Kanr）基因。,位于T-DNA右半部分的胭脂碱合成酶基因（nos）。,1）
11、脓杆菌选择标记,2）最终受体植物的选择标记,选择标记,卡那霉素抗性（Kanr）基因（卡那霉素对植物有剧毒！）,外源基因插入pGV3850的过程,外源基因,Kanr pBR322,土壤农杆菌 含pGV3850,植物组织,卡那霉素筛选,胭脂碱筛选,抗卡那霉素 的土壤农杆菌,外源基因 表达鉴定,转化,插入,感染,BR322与pGV3850重组,整合到 染色体上,BR322不能在土壤农杆菌中复制，只能同pGV3850重组。只有这样，土壤农杆菌才能得到抗卡那霉素性状。,转化后可诱导愈伤组织分化成转基因植物,3、,共整合转化程序,（2）双元载体（binary vectors）,既有大肠杆菌复制起点也有农杆
12、菌复制起点，是个穿梭载体。,Ti质粒被剔除了T-DNA、冠瘿碱代谢基因、vir基因。大幅度减小质粒的体积。（10kb）,双元载体的结构,Ti的精髓：Vir基因（转移）和左右界（整合）,双元载体的转化,转化农杆菌之前，所有的克隆步骤都在大肠杆菌里操作。,受体农杆菌内要求带有整套vir基因（但缺失T-DNA及左右边界）的“帮助质粒”提供vir产物。,1）基因插入,2）帮助质粒（helper plasmid）,Vir产物使双元载体上的T-DNA左右边界及其外源基因转入到植物细胞，并整合到植物染色体上。,左,右,外源基因,双元载体,Vir,帮助质粒,农杆菌,Vir,农杆菌,左,右,外源基因,感染植物,
13、转化,左,右,外源基因,进入植物细胞核，整合，表达,E.coli,双元系统的特点是两个质粒即穿梭质粒和Ti质粒，在接合后可以自主性地共存于同一农杆菌细胞中。穿梭质粒编码植物选择标记，表达信号，并具有位于两个T-DNA边界序列之间的用于外源基因的多克隆位点。双元系统中的农杆菌质粒是一个经过改造的Ti质粒，具有Vir基因和农杆菌复制起始子(OriA)，但没有T-DNA边界序列。接合后，两个质粒在选择压下可以自主共存于同一农杆菌细胞中。当农杆菌感染受伤的植物时，Ti质粒上的Vir基因与穿梭质粒上的左右边界序列发生相互作用，从而将T-DNA转移进入植物基因组。,双元系统的特点,插入外源基因的重组穿梭质
14、粒直接转化含有Ti质粒的根瘤农杆菌，经筛选后直接感染植物细胞。与共整合系统所不同的是，含外源基因的质粒可在农杆菌内自主复制并保留下来。农杆菌侵染植物细胞后，植物的创伤信号启动Ti质粒上的Vir基因，随后将穿梭质粒的T-DNA切割下来，转移到植物细胞中。,二、植物病毒介导的转染程序,病毒载体能将外源基因导入植物的所有组织和细胞中，而且不受单子叶或双子叶的限制。在大约300种特征清楚的植物病毒中，单链RNA病毒约占91%，双链RNA病毒、双链DNA病毒、单链DNA病毒各占3%。利用植物病毒载体转化植物细胞大致有以下两种战略：,二、植物病毒介导的转染程序,以双链DNA病毒花椰菜花斑病毒（CaMV）基
15、因组作为载体，去除有关的致病性基因，换上外源基因，体外包装成有感染力的病毒颗粒，转染植物细胞原生质体，并由此再生成整株植物。,转染植物细胞原生质体,植物病毒介导的转染程序,以双链DNA病毒花椰菜花斑病毒（CaMV）基因组作为载体，去除有关的致病性基因，换上外源基因，体外包装成有感染力的病毒颗粒，转染植物细胞原生质体，并由此再生成整株植物。,转染植物细胞原生质体,植物病毒介导的转染程序,植物双生病毒（Geminiviruses）为一单链DNA病毒，成熟的双生病毒呈双颗粒状，每一个颗粒中含有一条不同的DNA单链。其中A链能单独在植物细胞中复制，并含有一部分病毒包衣蛋白基因；B链编码另一部分包衣蛋白
16、基因及感染性基因。A、B两条链必须同处于一个植物细胞中，方能形成有感染力的病毒。双生病毒具有广泛的宿主细胞范围，因此是一种很有潜力的植物病毒载体。,转染植物组织,转染植物组织,双生病毒家族成员蕃茄金花叶病毒（TGMV）克隆表达载体的构建程序,三、植物细胞的直接转化程序,枪击法,将待转化的DNA沉淀在细小金属珠的表面，用特制枪将金属珠直接打入植物细胞，枪的威力为430 m/s，植物细胞通常是胚胎细胞、玉米籽、叶子等，但进去的DNA片段整合效率极低。,电击法,将高浓度的质粒DNA加入到植物细胞的原生质体悬浮液中，混合物在 200-600 V/cm 的电场中处理若干秒钟，然后将原生质体在组织培养基中生长 1-2 周，再生出整株植物。,融合法,将外源DNA与特殊的疏水性高分子化合物混合，在水中这些疏水性化合物分子形成球状的脂质体，后者与植物细胞原生质体融合，筛选融合子，再生植物细胞壁。,所有涉及到植物原生质体的基因转化方法均存在一个难题，即：原生质体很难再生出整株植物。,花粉管导入法,将外源DNA沿着花粉管经过珠心进入尚未形成正常细胞壁的卵、合子或早期胚胎细胞中，从而实现基因的转移。目前已应用
