1、内蒙古大学生物技术 基因工程实验论文2 分类号: Q78 编号: 00911031 本科生基因工程实验论文纳豆激酶基因表达载体的构建及在大肠杆菌中的表达指导教师：王 郑 学 生： 专 业： 生物科学 年 级： 2009级 2012年 8月26 日 目 录摘要11 绪论22 材料与方法 .2 2.1 材料.22.1.1 菌株与质粒 2 2.1.2主要试剂及其配制 2 2.1.2.1 试剂22.1.2.2 试剂与培养基的配制22.1.1.3 主要仪器5 2.2 方法.52.2.1纳豆激酶（NK)引物的设计 52.2.2 NK基因的PCR扩增及电泳检测 52.2.3 DH5a和BL21(DE3)感受
2、态的制备 72.2.4 pMD19-T-NK的构建及转化和鉴定 82.2.5 pET-Trx及pMD19-T-NK的酶切与回收 92.2.6 pET-Trx-NK的构建及转化和检测 92.2.7 pET-Trx-NK的诱导表达及SDS-PAGE检测 93 结果与分析 113.1NK基因的PCR扩增 113.2. pMD19-T-NK的构建与鉴定 113.3 pET-Trx及pMD19-T-NK的酶切和回收 123.4 pET-Trx-NK的构建与检测 123.5 pET-Trx-NK的诱导表达与SDS-PAGE检测 13结论与讨论 13参考文献 14致谢与感想 16纳豆激酶基因表达载体的构建及
3、在大肠杆菌中的表达摘要 纳豆激酶是一种良好的天然蛋白酶类溶栓物质。纳豆激酶基因长度约为837bp.本实验通过构建纳豆激酶基因表达载体，使纳豆激酶基因在大肠杆菌中顺利表达.我们从经克隆在PMD-18-T载体上的纳豆激酶基因，用PCR技术扩增后获得其837bp的DNA片段，将该基因片段同PET-trx载体连接后转入DH5a菌中，筛选出重组子。对重组子运用限制性内切酶双酶切后得到纳豆激酶基因片段，将该基因片段插入表达载体puck-NK中，再次转入DH5a菌中，筛选出重组子，再将该重组子基因转入BL21(DE3)菌中，通过IPTG进行诱导，用SDS-PAGE检测诱导产物纳豆激酶。关键词：纳豆激酶，基因
4、表达，载体，大肠杆菌Constructing Expression Vector and Expressing NK in E.coli Author： Supervisor: Wang ZhengABSTRACTNattokinase(NK) is a good natural protease thrombolytic substance. It is Gene length about for 837bp. This experiment through building Nattokinase gene expression carrier, make it smoothly expr
5、ession in Escherichia coli. We acquired Nattokinase gene from clonened in PMD-18-T carrier, with PCR technology expansion increased , we obtained the 837bp of DNA fragment , and connected it with PET-trx carrier , then, we transferred it to DH5a bacteria , filtered out recombinants. We got nattokina
6、se gene fragment resulting from cutting the recombinants by Restriction endonucleaset , inserted the gene fragment into expression vector puck-NK, Transferred it into DH5a bacteria again , filtered out recombinants, and then ,we Transferred the recombinant gene into BL21 (DE3) bacteria, through indu
7、ced by IPTG , nattokinase Induction products measureed by SDS-PAGE technologies.KEY WORDS: Nattokinase, gene expression, vector，E.coli1 绪论由血栓引起的血栓性疾病是一种常见的心脑血管疾病。溶栓剂是预防与治疗心脑血管疾病的主要抗血栓药物，在人类健康上具有重要意义，也具有广阔的市场潜力。目前国内外各种新型溶栓剂主要包括第三代溶栓剂组织型纤溶酶原激活剂变异体、导向溶栓剂、嵌合体溶栓剂以及有前景的各种天然溶栓剂。1980 年须见【1】教授在美国芝加哥大学进行血栓溶解酶
8、pro- UK与UK的构造分析研究时，无意间发现纳豆食品中含有高浓度的血栓溶解成分，纳豆食品在发酵过程中会产生一种丝氨酸蛋白酶，将其命名为纳豆激酶(Nattokinase, NK)， Nakamura【2】等首次报道了包括调控顺序在内的1473bp的 NK全长基因序列，NK基因以GTG为起始密码子，随后是1143bp组成的阅读框架，N端的第129个氨基酸残基是信号肽，第30106的77个氨基酸残基是前肽，随后的275个氨基酸残基为纳豆激酶成熟肽。这使从基因工程角度入手提高纳豆激酶活性及产量成为可能。更进一步的研究表明，纳豆激酶能有效的溶解血栓，与临床药物如尿激酶（UK）、链激酶（SK）等相比，
9、具有在体内的半衰期长，易被人体吸收，无副作用，生产成本低，能激活血管内皮细胞的组织型纤溶酶原激活剂（t-PA）以进一步增强溶栓作用等优点，所以纳豆激酶可以被开发为同时具有预防和治疗功效的新型的溶栓药物【3】。此外纳豆激酶还具有降血压，降血脂，降胆固醇，抗氧化等多方面作用。纳豆激酶在所有的纤溶酶类产品中研究最早，目前也是开发最多的溶栓剂产品，国内外对纳豆激酶已有二十多年的研究，其理化性质 溶栓机制 分离纯化等已被人们所了解，纳豆激酶类药品及保健食品的研究正在进行当中【4】。目前，国内外对纳豆激酶的研究主要集中在优化枯草杆菌发酵条件以提高产量，蛋白结构分析，生理生化特性，药理药效等方面【5】。另外
10、，日本学者还通过药物刺激、紫外线诱变、放射性照射、细胞融合和染色体插入变异等方法获得纳豆激酶高产菌株。而近年来以基因工程方法构建纳豆激酶的高效表达载体，优化表达系统来提高纳豆激酶的表达水平一直是研究的热点，并且取得了很大的进展【6-7】。国内主要进行了纳豆杆菌液体发酵条件、纳豆激酶的春花等方面的研究，目前利用原核（如大肠杆菌和枯草芽孢杆菌）或真核细胞（如毕赤酵母）进行基因表达纯化后获得的纳豆激酶，其活性普遍较低【8】。因此，纳豆激酶的研发潜力和空间都是巨大的，纳豆激酶极有希望成为新一代理想的预防和治疗血栓的生化药物。 本实验的目的在于构建纳豆激酶基因重组表达载体，并对其表达进行初步研究，首先旨
11、在利用实验室基本仪器进行基因工程以及分子生物学实验的熟练操作，也旨在利用基因工程技术提高纳豆激酶的产量，为生产实践和药物开发提供理论依据。2 材料与方法【9】2.1材料2.1.1 菌株与质粒本研究所采用的是已经克隆在PMD-18-T载体上的纳豆激酶基因(日本TaKaRa提供，本基因工程实验室保存提供），菌株为E.coil DH5a、BL21(DE3），表达载体PET-trx、PUCK-ET来自美国基因动力实验室公司，为本基因工程保存提供.2.1.2主要试剂及其配制2.1.2.1 试剂 RNase A；DNA 分子量标准：DNA HindIII，Tiangen 公司的 Marker II 或 M
12、arker III 等。EcoR I 和 BamH I 内切酶、 Taq DNA 聚合酶、T4 DNA 连接酶、DNA 凝胶回收试剂盒、质粒提取试剂盒、dNTP 混合液、X-gal、 IPTG、低分子量蛋白分子量 Marker：97.4、66.2、43、31、20.1，14.4 kDa等。其他常用试剂均为进口或国产分析纯。2.1.2.2 试剂与培养基的配制1、LB培养基（按 1L的量计算） 胰化蛋白胨10g,酵母提取物5g,NaCl10g,加200ml dd water搅拌完全溶解，用约200uL 5N NaOH调PH至7.0，加dd water至1L，121C 20min分装灭菌。在培养菌种
13、时，向里面加入20%葡萄糖，终浓度为 0.2%。提取质粒时，向里加入氨苄青霉素，终浓度100ug/mL.2、0.1mol/L CaCl2溶液 称取60mmol/L的CaCl2 3.330g,充分溶解；称取10mmol/LPIPES3.35g，充分溶解；量取15%的甘油75ml。三者混匀后，加蒸馏水至500ml，121C 20min分装灭菌后4C保存。3、50TAE缓冲液（pH约8.5） Tris碱242g,57.1ml冰乙酸，37.2gNa2EDTA-2H2O,dd water定容至1L，用时稀释 成1.4、1000溴化乙锭储存液（0.5mg/mL)： 50mg溴化乙锭溶于100mldd wa
14、ter,4C避光储存。使用时在蒸馏水里滴入适量，使水看起来微微发红即可。5、氨苄青霉素储存液 无菌水配制100mg/mL,分装后-20C保存。6、 0.5mol/L EDTA pH8.0 称取18.61g Na2EDTA-2H2O，加入约80mL的去离子水，充分搅拌。用NaOH颗粒调节pH值至8.0（约2g NaOH）,使其完全溶解。加去离子水将溶液定容至100mL。高温高压灭菌。7、1mol/L Tris HCl pH7.5 称取12.1g Tris碱,加80mL蒸馏水，缓慢地加浓盐酸至 pH6.8（约加6.5mL）。让溶液冷却至室温，调至pH7.5，加蒸馏水至100mL。高温高压灭菌后4C
15、保存.8、1mol/L Tris HCl pH8.0 称取12.1g Tris 碱, 加80mL蒸馏水缓慢的加浓盐酸至 pH8.0（约加4.2mL）。让溶液冷却至室温，调至pH8.0，加蒸馏水至100mL。高温高压灭菌后 4C保存.9、去盐分溶液的配制（1）溶液I 葡萄糖/Tris/EDTA(GTE)溶液:50mmol/L葡萄糖，25mmol/L Tris HCl pH8.0，10mmol/L EDTA,调pH8.0.（2）溶液II（NaOH/SDS 溶液)：0.2mol/L NaOH，1% SDS，现用现配.（3）溶液III KAc 溶液（pH4.8）：60mL 5mol/L KAc，加冰乙
16、酸调至 pH4.8 ， 补dd water至100mL.10、TE-缓冲液的配制 10mmol/L Tris HClpH8.0.1mmol/L EDTA pH8.0，高温高压灭菌.11、加样、上样缓冲液的配制（1）10加样缓冲液：20% Ficoll 400，0.1mol/L Na2EDTA pH8.0，1.0% SDS，0.25%溴酚蓝；（2）6加样缓冲液：0.25%溴酚蓝，40%蔗糖水溶液。（3）2上样缓冲液：0.5mol/L Tris HCl，pH6.8 2mL，甘油 2mL，20%SDS 2mL， 0.1%溴酚蓝0.5mL.（4）5电泳缓冲液：Tris 7.5g ，甘氨酸 36g，SD
17、S 2.5g，加 dd water至 500mL，使用时稀释5倍12、95%和70%乙醇（各配制100ml)（1）95%的乙醇配制：量取95ml无水乙醇，加水至100ml,混匀即可。（2）70%的乙醇配制：量取75ml无水乙醇，加水至100ml,混匀即可。13、10%SDS 蒸馏水配制，室温保存。14、30% Acr（丙烯酰胺）/Bis（N,N-亚甲基双丙烯酰胺）：30g Acr+0.8g Bis，用 dd water 定容至100mL，4C棕色瓶避光保存。 17、20（M/V）%IPTG无菌水配制，过滤灭菌。18、100mg/mL（M/V）IPTG 无菌水配制，过滤除菌19、2%（M/V）X
18、-gal：用 N,N-二甲基甲酰胺配制，过滤灭菌。20、考马斯亮蓝 R250 染色液 考马斯亮蓝 R250 0.25g + 45mL 甲醇+10mL 冰醋酸，用dd water定容至 100mL21、脱色液的配制95%乙醇/冰醋酸/水= 4.5/0.5/5（体积比）2.1.1.3 主要仪器Biometra公司的PCR仪、北京六一仪器厂的GYY-1型电泳仪及DYCP-31D型水平凝胶电泳槽、英国Grant的凝胶成像仪 、德国Eppendorf的AG5415R型台式离心机，太仓科教器材厂的旋涡混合器，美国Thermo Fisher Scientific公司的微量移液取样器，金坛市富华公司的SHE-
19、723G的恒温振荡器，双面微量离心管架，试管架，标签纸，制冰机。英 国 Grant 公司的PHC -19干式 恒 温 器、LG公 司 的 微 波 炉、太仓 科 教 器 材 厂的 涡 旋 振 荡 器、电子天平、高压蒸汽灭菌锅、冰箱、恒温水浴锅、紫外分光光度计、超净工作台等。2 .2 实 验 方 法2 .2 .1 纳 豆 激 酶（ N K )引 物 的 设 计上游引物（5端带 BamHI 酶切位点） 5-GGATCCGCGCAATCTGTTCCTTATGGC-3下游引物（5端带 EcoRI 酶切位点） 5-GAATTCTTGTGCAGCTGCTTGTACGTTG-3待扩增的 NK 片段长度：837
20、bp（825bp NK+5BamH I 位点 GGATCC，3EcoRI 位点 GAATTC）。2.2.2 NK基因的PCR扩增及电泳检测1. 取 1L自己提取的质粒 pMD18-T-NK，加入 9L dd water 稀释作为 PCR 模板。2. 在 0.2mL PCR 微量离心管中按下列参考剂量配制 50L 反应体系。；45LPCR supermix ；1L模板 ；1L引物1 ； 1L引物2，1Ldd water; 共计50L。 3. 根据 PCR 仪的操作手册设置 PCR 仪的循环程序：（1） 94C 5min （2） 94C 1min （3） 60C 1min （根据引物的 Tm 值设
21、定）（4） 72C 1min50s （根据所扩增的 DNA 的长度设定）（5） go to（2） 29 times（6） 72C 10min4、PCR 结束后，取 510L 产物进行琼脂糖凝胶电泳，观察胶上是否有预计分子量的主要产物带。 电泳步骤：（1）称取 0.25g 琼脂糖粉，放入三角瓶，加入 25mL 1TAE 电泳缓冲液（注意原液是 50 ，需要自己 稀释！），用保鲜膜盖住，放入微波炉中烧开（0.5min）。25mL 正好能倒 满一块小胶。（2）注意观察烧瓶中的琼脂糖粉末，待完全熔化后停止微波炉。（3）戴上线手套，从微波炉中取出三角瓶，置桌面上冷却至不烫手。（4）把梳子（最细的齿）插到
22、凝胶灌制模具的正确位置后缓缓倒入胶溶液。胶溶液倒至与模 具的矮边 缘相差 12mm 即可，但尽量不要太厚，更不要把胶溶液溢到外面。在桌面 上静置 1020 分钟 待胶完全凝固。（5）在水平电泳槽中加满1TAE 电泳缓冲液。根据电泳槽的长度把电泳仪的电压 调至 10V/cm（170V），注意正负电极的位置连接正确。（6）待胶完全凝固后（1520 分钟），小心拔出梳子。用手指捏住模具两侧的高边缘取出 模具和凝胶 放入电泳槽中间的平台上，凝胶要没入电 泳液中。凝胶上有样品孔的一侧要朝向电泳槽的负极（黑 色电极）。（7）取 1小片光面纸，点 6L蒸馏水、1L 10加样缓冲液，再加入 3L 质粒 DNA
23、 溶液制成 10LDNA混合样品。（8）在凝胶上选择相邻的加样孔。用 10L的吸液头分别将纸上的混合样品加入凝胶的加 样孔中。在电泳 PCR 产物或酶切产物时，在相邻的加样孔中加入 2LDNA 分子量 标准物。（9)打开电源开关，170V 电泳。样品将形成一条蓝色的横带向前移动（如果发现蓝色向后移动，立 即关闭电源，调换电极）。电泳将进行约 30min。(10)当蓝色的溴酚蓝迁移到距凝胶边缘1cm时，关闭电源。取出模具和凝胶。(11)把带有样品的凝胶小心放入盛有 EB 的搪瓷盒中。以下需戴手套到专门的染色区操作。放置约 10 分钟后，取出来在自来水中浸泡 10min。用自来水冲洗后放入凝胶成像
24、系统中拍照。(12)染有 EB 的凝胶和手套（只要手套没破，可以节约使用：将手套脱下来以后张开口放在染色区， 下一次把手伸进去即可）要放到专用的垃圾袋中作专门处理，以免污染环境。不可用接触过 EB 的手套接触电脑或凝胶成像仪的门。2.2.3 DH5a和BL21(DE3)感受态的制备1. 取一支无菌的摇菌试管,在超净工作台中加入 2mL LB 培养基（不含抗菌素！） 2.从超低温冰柜中取出 DH5a菌种和 BL21(DE3)菌种，放置在冰上。在超净工作台中用烧红的接种环插入冻结的菌中，然后接入含 2mL LB 培养基的试管中，37摇床培养过夜。3. 在超净工作台中取 0.5mL 上述菌液转接到含
25、有 50mL LB 培养基的三角烧瓶中，37下 250r/min摇床培养 23h。4. 取少量菌液测定 OD590 为 0.45（0.4 OD 0.6），细胞数108/mL，此为关键参数！）。以下除离心外，都在超净工作台中进行。5. 将菌液分装到1.5mL预冷的无菌微量离心管中，于冰上放置 10min，然后于4，5000r/min 离心 10min。6. 弃上清，并将离心管倒置以倒尽上清液。加入 1mL 冰冷的 0.1 mol/L CaCl2 溶 液，立即在涡旋混合器上混匀，插入冰中放置 30min。7. 4，5000r/min 离心 10min。弃上清液后，用 1mL 冰冷的 0.1 mol
26、/L CaCl2 溶液垂悬，插入冰中放置 30min。8. 4，5000r/min 离心10min。弃上清液后，用 200L冰冷的0.1mol/LCaCl2溶液垂悬，超净工作台中按每管 50L分装到 1.5mL的无菌微量离心管中。9.分装好的感受态菌可以直接用作转化实验（方法见实验八），或立即放入-80超低 温冰柜中保 藏（可存放数月）。以后用的时候每次用完一管，不可反复冻融。2.2.4 pMD19-T-NK的构建及转化和鉴定1.取一个高压灭活的 0.5mL 微量离心管，加入载体连接体系：2L PCR产物；2L pMD19-T载体；1L 10Buffer缓冲液；4L dd Water ，1LT
27、4DNA连接酶。共计10L.2.将上述混合液轻轻震荡后再短暂离心，然后置于14水中保温3h。3.从-80超低温冰柜中取出一管（50L）感受态菌，立即用手指加温融化后插入冰上，冰浴510min。4.加入5L连接好的质粒混合液（DNA含量不超过 100ng） 轻轻震荡后放置冰上 20min。5.轻轻摇匀后，42水浴 12min进行热休克，然后迅速放回冰中，静置 35min。6.在超净工作台中向上述管中加入 300L LB 培养基（不含抗菌素）轻轻混匀，然后固定到摇床的 弹簧架上 37震荡 45min。7.在超净工作台中取上述转化混合液 50300L（根据转化效率和载体连接效率而定），滴到含合 适抗
28、菌素的固体 LB 平板培养皿中。从酒精中取出玻璃涂布棒，在火上点燃，熄灭后稍等片刻， 待其冷却后轻轻涂布均匀。8.如果载体和宿主菌适合蓝白斑筛选的话，滴完菌液后再在平板上滴加 40L 2% X-gal，7L 20% IPTG，用酒精灯烧过的玻璃涂布棒涂布均匀。9.在涂好的培养皿上做上标记，先放置在 37恒温培养箱中约 1030min 直到表面的液体都渗透 到培养基里后，再倒置过来放入 37恒温培养过夜.10.在转化的平板培养基上随机选取 3 个边缘清晰的白色菌落，并用记号笔在其所在的培养皿底部 玻璃背面画圈做标记编号。11.在超净工作台中取 3 支无菌摇菌管，各加入 3mL LB（含 100g
29、/mL 氨苄青霉素），用记号笔写好编号。12.在超净工作台中将 70%乙醇浸泡过的小镊子头用酒精灯烤过，镊取一支无菌牙签。用牙签的尖 部接触转化的平板培养基上的一个白色菌落，然后将牙签放入盛有 3mL LB（含 100g/mL 氨苄 青霉素）的摇菌管中。13.37摇菌过夜后，用碱裂解法分别提取质粒。摇菌管中的剩余菌液暂保留在 4冰箱中。14.将提取到的 3 管质粒样品与已知分子量的质粒同时电泳，根据分子量判断和选取有插入片段的质粒。2.2.5 pET-Trx及pMD19-T-NK的酶切与回收 1. 先准备一个冰盒并放入一定量的冰块。混合下列溶液于一个高压灭菌的0.5mL 微量离心管中：8L 质
30、粒DNA ；4L 10酶切缓冲液(BamHI) ；1L EcoRI ; 1L BamHI .共计40L。2.轻轻震动微量离心管，使管中的溶液混匀。再在离 心机中 2000r/min 离心 10 秒。取出后插到水漂的孔中，在 37水浴中酶切 3.5 h。3.取少量（约 10L）酶切产物，与合适的已知分子量的 DNA（先前的 PCR 产物或 Marker 等） 对比电泳，确认酶切成功后，进行片段的回收。4.电泳结束后用薄塑料片（如电话卡）切下含有少量 DNA 酶切产物的泳道，EB 染色。在紫外灯 下找到目的 DNA 带，用刀片在目的 DNA 带的下上下边缘各切一个小口作为标记。含有大量 DNA 酶切产物的凝胶既不用 EB染色，也不用紫外灯照射。5.将做好切口标记的凝胶条用保鲜膜包住，与未染色的凝胶原位对齐，根据小胶条上的切口标记 估计未染色的大胶上 DNA 酶切产物的位置，用刀片切下大胶中 DNA 产物所在的凝胶。6.按照上海生工 UNIQ-10 柱式 DNA 胶回收试剂盒操作步骤回收pMD19-T-NK片段。2.2.6 pET-trx-NK的构建及转化和检测1.取一个灭菌的 0.5mL 微量离心管，加入连接体系：4L NK回收片段；1LPET-Trx载体、
