TTC脱氢酶测定法表征低温真空环境对细菌呼吸活性的影响图.docx
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TTC脱氢酶测定法表征低温真空环境对细菌呼吸活性的影响图
基金项目:
国家973计划资助项目(编号:
2004CB719604
作者简介:
杨天佑(1978-,男,河南科技学院生命科技学院讲师,博士。
Emai:
lyangtianyou2004@163.com
收稿日期:
2008-08-11
第24卷第6期2008年11
月Vol.24,No.6Nov.2008
TTC脱氢酶测定法表征低温真空环境
对细菌呼吸活性的影响
Effectsoflowtemperatureandvacuumonrespiratoryrate
ofbacteriabyTTCdehydrogenaseactivitytest杨天佑
1,2
YANGTianyou
1,2
田静
1
TIANJing
1
黄新
2
HUANGXin
2
林星星
2
LINXingxing
2
李宗伟
2
LIZongwei
2
秦广雍
2
QINGGuangyong
2
(1.河南科技学院生命科技学院,河南新乡453003;2.郑州大学离子束生物工程省重点实验室,河南郑州450052
(1.LifeScienceandTechnologyCollege,HenanInstituteofScienceandTechnology,Xinxiang,Henan453003,China;2.ProvincialKeyLaboratoryofIonBeamBioengineering,ZhengzhouUniversity,Zhengzhou,Henan450052,China
摘要:
在探索TTC-脱氢酶法测定大肠杆菌脱氢酶活性的最
佳条件基础上,对真空、-20低温对大肠杆菌脱氢酶的影响进行研究。
TTC法显色最佳条件为:
TTC的浓度0.4%,pH值7~8,反应时间30min,测定波长485nm。
真空处理5min大肠杆菌脱氢酶活性显著降低,而-20低温处理1h时脱氢酶活性才明显下降。
因此,-20低温、真空处理都会导致细菌呼吸活性的下降,细菌刚放入真空的瞬间对其呼吸活性影响较大,而-20低温处理1h后才引起细菌呼吸活性显著下降。
关键词:
TTC;脱氢酶活性;低温;真空
Abstract:
InordertoinvestigatetheeffectsoflowtemperatureandvacuumonrespiratoryrateofbacteriawithTTCdehydrogenaseactivitytest,the
dehydrogenaseactivityofE.coliat-20
andvacuumonrespiratory
rateofE.coliweremeasuredaftertheconditionsofTTCtestwereexplored.Asresults,theoptimaltestconditionsare0.4%TTC,pH7~8,testingtime30min,testingwavelength485nm.ThedehydrogenaseactivitydistinctlyfallsbyputtingE.colicellsinvacuumfor5minandin-20
for1h.Theresearchconcludedthatthelowtemperatureand
vacuumcanreducetherespirationrateofbacteria,whichrudcedimmediately,about5min,
invacuumandslowlyin-20,over1h.
Keywords:
TTC;Respirationrate;Lowtemperature;Vacuum
菌种保藏中低温、真空冷冻对细菌生理活性的影响有许多种方法,常用的标准是测定细胞的存活率,但由于微生物受一些不利因素的影响,即使在丧失分裂能力后仍能保持一定的代谢活力。
要衡量这种代谢活力就要测定对生命具有
代表意义的指标,如细胞膜的完整性、酯酶活性、蛋白质合成能力、脱氢酶活性等[1,2]。
TTC法测定呼吸链脱氢酶活性来表征细胞代谢活力是一有效的方法[3]。
TTC(2,3,5TriphenylTetrazoliumchloride是最早被人们发现的人工受氢体,上世纪70年代,有研究学者利用TTC法测定细胞的活力[4,5],其原理是TTC在细胞呼吸过程中替代O2接受H+(H+/e,TTC被还原为TF(TriphenylFormazone呈现红色,TF经有机溶剂萃取后,在一定波长下测吸光值,其吸收值大小能反映细胞膜电子传递链的递氢能力大小。
越来越多研究[6,7]表明TTC法测定脱氢酶可表征细菌呼吸活性的大小。
目前,关于低温、真空冷冻对细菌存活率的影响报道较多,而关于低温、真空对细菌呼吸活性的影响报道甚少。
研究低温及真空对细胞膜损伤及细胞呼吸活性的影响有助于人们深入认识真空和低温对细菌生理活性影响。
本试验在探索TTC法检测脱氢酶活性最佳反应条件的基础上,研究了低温和真空对大肠杆菌呼吸链脱氢酶活性的影响,从细菌呼吸活性这一新的角度探讨了低温和真空环境对细菌生理活性的影响。
1材料与方法
1.1菌种与试剂
E.coliK12野生型菌株,MG1655;
2,3,5氯化三苯基四氮唑(2,3,5TriphenylTetrazoliumchloride即TTC:
上海生物工程技术服务有限公司;
TTC贮存液:
称取1.000gTTC溶于少许蒸馏水中,并在250mL容量瓶中定容,所得0.4%的TTC溶液,放在棕色瓶中,室温下暗处贮存;
TrisHCl缓冲溶液(pH8.4:
将6.037gTris溶于20mL浓度为1mol/L的HCl溶液中并定容至1L。
PBS缓冲液、
0.36%的Na2SO
3
、10%的Na
2
S
2
O
4
(保鲜粉、丙酮、甲醛。
1.2仪器与设备
双光束紫外可见分光光度计TU-1901型:
北京普析通用仪器有限责任公司;
脉冲式多元素离子注入机Titan型:
俄罗斯科学院西伯利亚分院强电研究所;
超净工作台SKJH-2109型:
北京托摩根生物科技有限公司;
新飞冰箱BCD-178CHC型:
新飞冰箱厂;
37恒温水浴振荡器HH-601型:
江苏亿通电子有限公司;
电热恒温鼓风干燥箱DHG-9203A型:
上海精宏实验设备有限公司。
1.3TTC法测定细菌脱氢酶活性
1.3.1反应条件分别取2mL的菌悬液于10mL的离心管中,加入1.5mL的TrisHCl缓冲液(pH8.4、0.36%的
Na2SO
3
溶液0.5mL、0.4%TTC溶液2mL,迅速将制备好的
样品放入37水浴振荡器内振荡(暗处培养30min,加1mL甲醛终止反应,5000r/min离心10min,弃上清,加3mL的丙酮萃取,将混合物搅拌均匀后置于37暗处振荡10min,5000r/min离心10min,取上清于485nm测吸光值。
1.3.2菌体干重测定取40mL菌悬液5000r/min离心10min,弃上清,转移菌体于已知重量烘干后的滤纸上,置于干燥箱中105烘烤至恒重,滤纸先后重量数之差即为菌体干重。
1.3.3标准曲线绘制分别取0.01%,0.02%,0.03%,0.04%,0.05%的TTC溶液1mL加入不同的15mL离心管
中,加2mL的TrisHCl(pH8.4,最后再加10%的Na2S2O4
溶液1mL,37水浴振荡5min(暗处,使得TTC完全还原为TF,加1mL甲醛终止反应,5000r/min离心10min,弃上清,加5mL丙酮充分混匀,于485nm处测吸光值。
并以混合液于485nm处吸光值为纵坐标,反应生成的产物TF为横坐标绘制标准曲线。
1.3.4酶活单位定义每分钟每克细菌干重生成1mmolTF为1个酶活单位。
1.4样品的低温和真空处理
1.4.1样品的制备取过夜培养的供试菌株菌悬液0.5mL接入20mLLB液体培养基中,37、250r/min摇床培养3h,OD
600
值为0.5左右,细菌处于指数期,菌数约为每毫升2108~3108个,5000r/min离心10min后,收集的菌体重新悬浮于PBS缓冲液即得菌悬液。
1.4.2样品的低温处理分别取2mL的菌悬液于不同离心管中,置于-20的冰箱中处理0.25,0.5,1,2,4h。
TTC法测定细胞脱氢酶的活性。
1.4.3样品的真空处理分别取1,2mL的菌悬液于不同的离心管中,置于Titan型离子注入机510-2Pa真空度的靶室中处理1,5,10,15,20min。
TTC法测定细胞脱氢酶的活性。
2结果与讨论
2.1TTC反应中一些重要条件的确定
2.1.1TTC反应中TF吸收波长的确定取有机溶剂提取得上清液(TF在TU-1901双光束紫外可见分光光度计上进行全波长扫描,见图1
。
图1TF的波长扫描
Figure1AbsorbancespectrumofTF
由图1可知,在485nm处有一明显的吸收峰,因此研究确定在485nm处测定反应产物TF吸光值。
2.1.2TTC法检测脱氢酶活性的标准曲线不同浓度的TTC与过量的还原剂Na
2
S
2
O
4
反应生成TF,以TF为横坐标,485nm处的吸光值为纵坐标作图,见图2
。
图2TF的标准曲线
Figure2StandardcurveforTF
由图2可得:
c(TF=(OD
485
-0.0587/0.0008mol/L,测定细胞呼吸链脱氢酶的酶活=c(TF/(tm。
式中:
t!
!
!
为TTC显色反应的时间,min;
m!
!
!
为所得的菌体细胞的干重,g。
2.1.3TTC显色中反应时间对显色结果的影响TTC显色中反应时间对TTC显色反应的影响,见图3。
科研开发2008年第6期
图3反应时间对脱氢酶活性的影响Figure3EffectofTTCreactiontimeon
thedehydrogenaseactivity
由图3可知,酶促反应的时间曲线在15~30min内呈较好的线性关系,随后30~90min趋于平缓,这意味着在反应中随着底物的逐渐耗尽,反应速率减慢。
对于E.coliK12而言,在反应时间为30min时,所测得吸光值为最大,超过30min后的吸光值几乎没多少改变。
特别是反应时间太长会引起TF的降解,故试验选择30min为测定E.coliK12脱氢酶活性的反应时间。
2.1.4细胞酶活力测定中TTC浓度大小对反应结果的影响
配制0.05%,0.1%,0.2%,0.4%,0.6%,0.8%,1%浓度的TTC,进行TTC显色试验。
不同TTC浓度对呼吸链脱氢酶活性的影响,如图4
所示。
图4TTC浓度大小对脱氢酶活性的影响Figure4EffectofTTCconcentrationon
thedehydrogenaseactivity
由图4可知,超过0.4%浓度的TTC所测的TF的吸收值逐渐降低,这是由于TTC本身对细胞有一定的毒性,并且浓度越大毒性越强,TTC的浓度过大会影响脱氢酶的活性,0.05%浓度的TTC所测结果偏低可能是由于TTC的含量太小,不足以测得总E.coliK12细胞的脱氢酶活性。
因此,试验中选定反应体系中的TTC浓度为0.4%较为理想。
2.1.5TTC显色中反应体系的pH值对脱氢酶活性的影响反应体系的pH值对脱氢酶的活性的影响,见图5。
图5反应液pH值对脱氢酶活性的影响
Figure5EffectofpHontheactivityofdehydrogenase由图5可知,反应液的pH<5时,几乎测不到吸收值,当反应液的pH在7~8中性偏碱时,所测得脱氢酶活性最大;当pH值到达12的强碱性时,所测得OD值有很小。
其形成原因:
一方面是因为细胞的脱氢酶其最适反应pH接近于细胞内的中性偏碱的生理环境,所以pH在7~8时酶活最大。
在另一方面,由于TF在碱性条件下的不稳定性,会发生分解,所以强碱的环境会造成TF的快速降解从而影响试验结果。
因此,试验中反应体系的pH值应控制在pH7~8中性偏碱范围内。
综上所述,TTC显色法测定E.coliK12脱氢酶活性的最佳反应条件为:
TTC的浓度为0.4%,反应液pH值为7~8,反应时间为30min,测定波长在485nm。
2.2真空对E.coliK12细胞活性的影响
E.coliK12细胞处于510-2Pa的高真空环境,1,5,10,15,20min时呼吸链脱氢酶活性,见图6
。
图6真空处理对E.coliK12脱氢酶活性的影响Figure6Effectofvacuumontheactivityofdehydrogenase由图6可知,随着真空处理时间的增加E.coliK12呼吸链脱氢酶酶活呈现下降的趋势,真空处理25min时,脱氢酶酶活已经降至3.2mmol/g∀min极低水平。
可见,真空处理过程中细胞的呼吸代谢能力随真空处理时间增加逐渐降低,真空处理较长时间时(>25min,细胞基本无呼吸代谢活性。
在样品放入真空环境5min后,E.coliK12脱氢酶活性下降了约二分之一,由此可见样品放入真空靶室的瞬间对细
第24卷第6期
杨天佑等:
TTC脱氢酶测定法表征低温真空环境对细菌呼吸活性的影响
胞脱氢酶的活性影响很大。
这可能是由于细胞突然暴露在高真空时,细胞内的水分在短时间内的快速蒸发带走大量的热量(水的蒸发热容为2.352106J/g细胞温度急剧下降,胞内自由水迅速形成冰晶[8,9]。
这个过程中细胞由于蒸发失水、降温结冰、体积膨胀,冰晶都将对细胞膜及细胞膜呼吸链组分造成不同程度的机械损伤,损伤后的细胞膜丧失了一定呼吸能力,从导致了细胞呼吸活性的瞬间降低。
随着真空处理时间的延长,真空刺激对细胞膜的损伤越来越严重,所以细胞活性也会越来越低。
2.3
-20低温对E.coliK12细胞活性的影响
E.coliK12细胞处于-20低温环境0.25,0.5,1,2,4h细胞呼吸链脱氢酶活性,如图7
所示。
图7-20低温处理对E.coliK12
细胞脱氢酶活性的影响Figure7Effectoflowtemperatureon
theactivityofdehydrogenase
由图7可知,处于-20低温条件的E.coliK12脱氢酶酶活随时间增加逐渐降低,低温处理4h时,脱氢酶酶活降到极低水平,细胞基本无呼吸代谢活性。
这是由于细菌在-20冻存时,由于细胞膜内外游离水降温结冰形成的冰晶会引起细胞膜的损伤,导致细胞膜呼吸链的破坏,影响其细胞的呼吸能力。
不过,样品放入-20低温环境后前0.5hE.coliK12脱氢酶活性变化很小,这一变化趋势与真空处理对E.coliK12脱氢酶酶活影响不同。
这是因为低温处理前0.5h,细胞基本还没有结冰,0.5h以后细胞开始冻结并越来越严重。
不像高真空处理时,细胞放入真空靶室很短时间,细胞就形成冰晶。
低温处理超过1h时细胞形成越来越多的冰晶的形成,引起了细胞膜损伤越来越严重,导致了细胞呼吸链呼吸能力的降低。
3结论
TTC显色法测定E.coliK12脱氢酶活性的最佳反应条件为:
TTC的浓度为0.4%,反应液pH值为7~8,反应时间为30min,测定波长在485nm。
试验表明低温、真空环境都会导致细菌呼吸活性的降低,这是因为真空和低温处理引起了细胞膜不同损伤,导致了细胞的呼吸链受阻所致。
细菌刚放入真空的瞬间对其呼吸活性影响较大,而-20低温处理一段时间后,细菌呼吸活性才开始明显下降。
参考文献
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5JLIborra,JGuardiolaJ,SMontaner,eta.l2,3,5Triphenyltetrazol
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