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第三章酶
第三章酶
Ⅰ.酶的一般性质
1.酶的化学本质
⑴化学本质
①水解:
AA,酶能被蛋白酶水解;
②变性:
蛋白质变性的因素可使酶变性;
③两性电解质;
④胶体性质:
如不能通过半透膜等;
⑤呈色反应:
酶和蛋白质具有。
⑥其他:
活性中心、空间结构等;
依据
除核酶外!
⑵酶的化学组成
简单酶=简单蛋白质simpleprotein
脲酶、蛋白酶、脂肪酶、淀粉酶等水解酶;
全酶holoenzyme
=结合蛋白conjugatedprotein
=酶蛋白+辅酶or辅基
名称:
脱辅蛋白质(apoprotein)
或脱辅酶(apoenzymecofactor)
组成:
酶的氨基酸组成部分
辅酶
辅基
酶蛋白
coenzyme:
与酶蛋白结合不紧密,可用透析法与酶蛋白分开,多是维生素及其衍生物成。
prostheticgroup:
与酶蛋白结合紧密,不能用透析法与酶蛋白分离,多为金属离子。
⑶单体酶、寡聚酶、多酶体系和多功能酶
①单体酶monomericenzyme
一条肽链:
无四级结构
多条肽链:
共价连接
分子量
种类
组成
(13~35)×103
少,多催化水解反应;
牛胰核糖核酸酶、溶菌酶、羧肽酶A等
胰凝乳蛋白酶:
肽链组成,链间二硫键
②寡聚酶oligomericenzyme
两个或两个以上亚基
亚基结构
连接
亚基
数量
组成
非共价键的次级键,易分开!
可相同,也可不同。
绝大部分含偶数亚基
个别含奇数亚基:
如荧光素酶、嘌呤核苷磷酸化酶均含3亚基
③多酶复合体multienzymecomplex
催化一系列反应几乎同时同地进行反应的一组酶,它们以非共价键相互嵌合。
丙酮酸
脱氢酶
复合体
脂肪酸
合成酶系
概念
名称:
脂肪酸合成酶复合体
fattyacidsynthasecomplex
脂肪酸合成酶系
fattyacidsynthasesystem
组成:
7个酶和1个酰基转移蛋白组成
分子量:
2.2×106。
名称:
pyruvatedehydrogenasecomplex
组成:
E.coli:
3个酶60个亚基组成
分子量:
4.6~5.0×106;
牛肾:
7.8×106。
④多酶融合体(多功能酶)
一条多肽链上含有两种或两种以上催化活性的酶,多是基因融合的产物。
分支酸
变位酶
双功
能酶
概念
名称:
Asp激酶Ⅰ-homoserine脱氢酶Ⅰ融合体
组成:
四聚体α4
功能:
N-端区域→Asp激酶,
C-端区域→homoserine脱氢酶。
P蛋白:
分支酸变位酶P-预莽酸脱水酶;
合成苯丙氨酸
T蛋白:
分支酸变位酶T-预莽酸脱氢酶;
合成酪氨酸
2.酶促反应的特点
⑴易失活
常温、常压、近中性水中
工业固氮
失活
因素
反应条件
固氮酶
变性因素:
高温、强碱、强酸、重金属盐等
条件:
27℃、中性pH
产量:
1亿吨氮/年
500℃,几百个大气压
⑵催化效率高
在一定条件下,
每秒钟每个酶分子转换底物的分子数;
或每秒钟每微摩尔酶分子转换底物的微摩尔数
实际
定
义
酶转换数turnovernumber,TN=催化常数kcat
大多数酶对天然底物的转换数为每秒1到104。
⑶酶的专一性specificity
酶对催化的反应和反应物的选择性。
高度
专一性
专一性
酶对催化的反应和反应物有严格的选择性。
①结构专一性
只作用于一种底物,不作用于任何其他物质的酶的催化特性。
A.绝对
专一性
严格:
α-糖苷键,一端有葡萄糖
宽松:
另一端R基团可多种糖
键专一性
α-D-葡萄糖苷酶
作用于底物特定化学键的酶催化特性。
如酯酶催化酯键的水解。
B.相对专一性
作用结构相近的底物的酶催化特性
酶对底物链两端的基团要求不同,对其中一个基团要求严格,对另一个要求不严格的催化特性。
族专一性或基团专一性
②立体异构专一性stereospecificity
只催化一种几何异构体的酶催化特性。
琥珀酸脱氢酶催化琥珀酸脱氢→延胡索酸
不能生成顺丁烯二酸(马来酸)。
只催化底物的一种立体异构体的酶催化特性。
B几何异构专一性
C.对称基团专一性
特点
只催化一种对映异构体的酶催化特性。
L-AA氧化酶催化L-AA氧化,不作用D-AA
酶只催化对称分子中的两个等同基团的一个,不催化另一个。
甘油一端14C标记,甘油激酶催化只产生一种甘油-1-磷酸标记物。
A.旋光异构专一性
3.酶活性的调节和控制
⑴酶浓度的调节
①诱导或抑制酶的合成;
②调节酶的降解。
合成:
β-半乳糖苷酶
半乳糖苷通透酶
硫半乳糖苷转乙酰酶
诱导物:
乳糖
异丙基硫代-β-D-半乳糖苷
(Isopropylβ-D-1-Thiogalactopyranoside,IPTG)
乳糖操纵子
1acoperon
葡萄糖
效应
大肠杆菌中有葡萄糖时,不利用乳糖,表明葡萄糖抑制了上述3个酶的合成。
⑶反馈抑制feedbackinhibition
代谢途径第一步反应的酶被终产物抑制的现象!
多在小分子物质的合成反应中。
⑷抑制剂和激活剂
别构调控、酶原激活、共价修饰、同功酶等
⑸其他调节方式
概念
⑵激素调节
激素通过与细胞膜或细胞内受体结合引起一系列生物学效应来调节酶活性。
4.与化学催化剂的比较
⑴反应前后催化剂的数量和性质不发生改变
⑵不改变反应的平衡点,加快达到平衡的时间
⑶降低反应的活化能,反应易进行
能量较高,处于活化态的分子。
结果
活化能activationenergy
活化分子activationmolecule
活化分子比一般分子高出的能量。
单位:
一定温度下1摩尔底物全部进入活
化态所需要的自由能,kJ/mol。
活化能愈高,活化分子数少,反应速率慢。
催化剂能瞬时与反应物结合成过渡态,降低反应所需的活化能。
5.酶的分类与命名
⑴习惯命名法
1961年以前酶的名称,称习惯名。
⑵国际系统命名法
原则
命名原则
渊源
①酶作用的底物
②酶催化反应的性质
规定:
以整体反应为基础的酶命名规则。
内容:
底物、反应的性质。
特点:
名称冗长!
⑶国际系统分类法及酶编号
乙醇脱氢酶:
EC1.1.1.1
乳酸脱氢酶:
EC1.1.1.27
苹果酸脱氢酶:
EC1.1.1.37
大类:
氧化还原酶
氧化基团:
CHOH;
受氢体:
NAD+;
编号:
1,27,37;
转
水
裂
异
合
氧
⑷国际系统分类的盲区
忽略酶的物种差异和组织差异。
种类
催化反应
盲区
超氧化物歧化酶,superoxidedismutase,SOD
EC1.15.1.1
方案
编号
一个名称和编号
2O2-+2H+→H2O2+O2
CuZn-SOD:
真核生物细胞质中
Mn-SOD:
真核生物线粒体中
Fe-SOD:
广泛存在
CuZn-SOD:
牛红细胞与猪红细胞中一级结构
差异大
名称
注明酶的来源与名称!
Ⅱ.酶促反应的作用机理
1.过渡态和活化能
⑴过渡态transitionstate
A+B→→→A……B→→→C+D
初态过渡态终态
过渡态
反应
特征
反应的全过程含一个或多个过渡态(中间产物)
极不稳定的中间产物,寿命极短。
其结构不同于反应物和产物。
⑵活化能activationenergy
反应物(初态)转化成中间产物(过渡态)所需要的能量。
活化能
2.中间产物学说
S+E→→→ES→→→ES≠→→→EP→→→P+E
中间产物与过渡态
反应
中间产物
ES:
合成酶-底物复合物
ES≠:
酶-过渡态中间物复合物
EP:
酶-产物复合物
稳定:
稳定可分离!
寿命:
短而难于分离
酶:
总结果中不参与反应
证据
观察:
电子显微镜可直接观察核酸聚合酶
与核酸结合而成的复合物!
产物:
已分离并结晶D-氨基酸氧化酶与
D-氨基酸结合的复合物。
3.诱导契合inducedfit假说
1958年,Koshland
提出
内容
酶分子的活性部位有一定的可变性,当底物分子与酶分子相遇时,可诱导酶蛋白的构象发生相应的变化,使活性部位上各个结合基团与催化基团达到对底物结构正确的空间排布与定向,使酶与底物互补结合,产生酶-底物复合物,使底物发生反应。
4.影响酶催化效率的有关因素
⑴底物和酶的邻近效应与定向效应
分子识别和分子间反应→→分子内反应
定向反应orientation
邻近效应approximationorproximity
目的
酶与底物结合形成中间复合物后,底物和底物(如双分子反应)、酶的催化基团与底物之间结合于同一分子,有效浓度升高,反应速率增大的效应。
反应物的反应基团之间和酶的催化基团与底物的反应基团之间的正确取位产生的效应。
⑵底物形变distortion和诱导契合inducedfit
1958年,Koshland
提出
内容
酶分子的活性部位有一定的可变性,当底物分子与酶分子相遇时,可诱导酶蛋白的构象发生相应的变化,使活性部位上各个结合基团与催化基团达到对底物结构正确的空间排布与定向,使酶与底物互补结合,产生酶-底物复合物,使底物发生反应。
⑶酸碱催化acid-basecatalysis
酸碱
催化
狭义
酸碱催化
广义
酸碱催化
向反应体系瞬时提供H+或从反应物接受H+以稳定过渡态,加速反应达到平衡的催化机制。
总酸碱催化:
通过H+和OH-以及能提供H+及OH-的供体进行的催化。
专一酸碱催化:
在水溶液中通过高反应性的H+和OH-进行的催化。
⑷共价催化covalentcatalysis
亲核催化nucleophiliccatalysis
或亲电子催化electrophiliccatalysis
名称
效应
结果
放出电子或汲取电子!
形成不稳定的共价中间复合物,
降低反应活化能,加速反应
⑸金属离子催化
①需要金属的酶分类
B.金属-激活酶metal-activatedenzyme
A.金属酶metalloenzymes
与金属离子结合紧密
多为过渡金属离子如Fe2+、Fe3+、Cu2+、Zn2+、Mn2+、Co3+
特点
特征
②金属离子参加催化过程的主要途径
金属离子结合松散
多为碱和碱土金属离子,如Na+、K+、Mg2+或Ca2+
a.结合底物为反应定向;
b.可逆改变金属离子的氧化态调节氧化还原反应;
c.通过静电稳定或屏蔽负电荷。
Ⅲ.酶活力测定及调节
1.酶活力enzymeactivity
⑴概念
酶催化某一化学反应的能力。
一定条件下催化的某一化学反应的速率(reactionvelocity或reactionrate)
速率越大,酶的活力越高。
酶
活
力
⑵酶的活力单位(U,activityunit)
在一定条件下,一定时间内将一定量底物转化为产物所需的酶量。
表示:
每克或每毫升酶制剂含的酶单位(U/g或U/m1)
最适条件
酶单位
国际单位IU
最适条件下,1min催化1μmol底物转化为产物所需的酶量为一个酶活力单位,即IU=1μmol/min。
温度(25℃或37℃)、pH
缓冲液离子强度、底物浓度
最适条件下,每秒钟能催化lmol底物转化为产物所需的酶量,1Kat=1mol/s
Kat单位
1Kat=60×106IU
1IU=1μKat/60=16.7nKat
⑶酶的比活力specificactivity
比活力
每mg蛋白质所含的酶活力单位。
同一种酶的比活力愈大,酶的纯度愈高。
比活力=活力U/mg蛋白=总活力U/总蛋白mg
⑷酶活力的实际使用
酶单位:
30℃,1分钟,使底物DNA溶液的比粘度下降25%的酶量。
淀粉酶
凝胶
电泳法
①1g可溶性starch,1h内液化所需的酶量。
②lml2%可溶性starch,1h内液化所需的酶量。
酶单位:
37℃1小时使1ugλDNA完全水解的酶量。
酶单位:
5分钟使1ugDNA活性残留37%所需的酶量。
限制性核酸内切酶
粘度法
转化率法
⑸酶活力的测定方法
①分光光度法spectrophotometry
底物或产物在紫外或可见光部分的光吸收变化,选择波长测定酶活力。
原理
酶偶联分析法enzymecouplingassay
原理
②荧光法fluorometry
范围:
无最大光吸收变化的酶反应
方法:
第一个酶反应的产物,与能引起
光吸收变化的酶反应偶联,转变为
有光吸收变化的产物来测量酶活。
底物或产物的荧光差别来测定酶活。
特点
灵敏度比分光光度法高。
③同位素测定法isotopemethod
用放射性同位素标记底物,酶作用后测产物的脉冲数,换算出酶活力。
④电化学法electrochemicalmethod
特点
原理
灵敏度极高!
A.测定pH的变化计算酶的反应速率。
B.恒定pH,由加入酸或碱的速率计算酶活!
原理
特点
应用广泛!
多测定酯酶活力。
2.酶原激活
⑴酶活性中心activecenter
名称:
活性部位activesite或活性中心
概念:
酶分子中能直接与底物结合,并催化
底物化学反应的部位。
结合部位
概念
结合基团
活性部位或活性中心==结合部位+催化部位
由不少于三个以上的结合基团组成结合部位,决定底物专一性。
bindinggroup:
直接与底物结合的基团。
一般由2~3个催化基团组成催化部位,决定酶的催化效率。
催化基团
催化部位
活性部位特征
catalyticgroup:
直接催化底物反应的基团。
一级结构:
或近或远,甚至不在同一肽链上
空间位置:
靠近!
直接参与对底物分子结合和催化的基团及参与维持酶分子构象的基团。
酶分子中基团很多,但仅必需基团才与酶活性有关。
必需基团=结合基团+催化基团+维持构象基团
必需基团essentialgroup
⑵酶原激活
刚合成的无活性的酶前体。
酶原
酶原激活
⑶酶活性部位的特点
酶原经适当的肽键切割,成为有活性的酶的过程。
结果:
无活性的酶原→→有活性的酶
①空间比例小
体积:
约占1~2%
氨基酸:
催化部位:
仅2~3个
结合部位:
少则1个,多则数个。
③底物结合过程
②活性部位是三维实体结构
诱导契合(induced-fit)
假说
内容
形状:
酶的活性部位和底物的形状不互补
变化:
酶和底物结合过程中,
底物或酶,或两者同时发生构象变化
结果:
形状互补
催化基团位置:
在底物反应键和即将生成键处
⑤底物与酶结合
④活性部位位置
酶表面的一个裂缝(crevice)内。
圆形?
⑥酶活性部位具有柔性或可运动性。
次级键:
非共价键,noncovalent,
如氢键、疏水键、盐键、范德华力
结合键
结合力
弱!
⑷研究酶活性部位的方法
①分子侧链基团的化学修饰法
化合物+酶活性部位AA侧链基团
↓蛋白酶水解
A.非特异性共价修饰
寻找酶的必需基团
带化合物的标记肽段
确定活性部位的一级结构
X射线晶体结构分析提供资料。
方
法
原理
结果
方法
目的
活性改变→必需基团
活性不变→非必需基团
共价结合、氧化、还原等修饰侧链
B.特异性共价修饰
化合物专一修饰活性部位的某一氨基酸,使酶失活。
分析标记的水解肽段,可判断酶活性部位的氨基酸。
C.亲和标记法affinitylabeling
利用酶对底物的特殊亲和力标记酶。
概念
亲和标记
活性部位指示剂
与底物结构相似的酶修饰剂。
特点
A.专一引入酶活性部位,
接近底物结合位点。
B.有活泼化学基团可与活性部位的
某一基团结合形成稳定的共价键。
③X射线晶体结构分析法
②动力学参数测定法
原理:
活性部位AA的解离状态和活性直接相关
方法:
动力学方法求得有关参数后,
判断活性部位的化学性质。
分析酶的三维结构,分析活性部位AA的相对位置与实际状态和与活性部位有关的其他基团。
④定点诱变法site-directedmutagenesis
改变DNA→改变酶一级结构
分析酶活性部位的必需氨基酸。
原理
3.变构酶allostericenzyme
⑴概念
对代谢途径的反应起调节作用的酶
变构酶、共价调节酶、同工酶
变构酶
调节酶
含2个或2个以上亚基的调节酶!
同促变构酶、异促变构酶、同促异促变构酶
名称:
catalyticcenter
功能:
结合和催化底物分子!
调节亚基
调节中心
名称:
catalyticsubunit
结构:
含催化中心的亚基!
名称:
regulatorycenter
作用:
结合调节物,调节催化中心!
催化亚基
催化中心
名称:
regulatorysubunit
结构:
含调节中心的亚基!
⑵异促变构酶
催化中心(活性部位)和调节中心(调节部位、变构部位)一般在不同亚基上。
⑶同促变构酶
活性部位即调节部位!
活性部位与调节部位在同一亚基上。
例
特点
结构
特点
天冬氨酸转氨甲酰酶(ATCase)
二个催化亚基,三个调节亚基。
活性部位2个或2个以上
每个亚基含有一个活性部位
⑷变构效应与调节物
另称:
协同效应cooperativeeffect
概念:
调节物与变构酶结合后,酶构象变
化和活性改变的现象。
变构效应allostericeffect
变构抑制inhibition
变构激活activation
另称:
正协同效应positivecooperativeeffect
含义:
提高酶活性的变构效应。
另称:
负协同效应negativecooperativeeffect
概念:
降低酶活性的变构效应。
另称:
效应子、调节物
含义:
能使变构酶产生别构效应的物质。
效应物effector
实际情况
变构
激活剂
另称:
正效应物
概念:
提高变构酶活性的效应物。
相反:
变构抑制剂、负效应物。
效应物:
多为小分子有机化合物
变构激活剂:
多为变构酶的底物
变构抑制剂:
多为代谢途径的终产物
⑸变构酶S型动力学曲线
终产物过多时,降低代谢途径的总反应速度,减少原始底物的消耗,避免终产物的过多产生!
别构激活
变构抑制
异促别构酶以底物作激活剂,结合到酶分子的调节部位,避免过多底物的积累!
反应速度(v)对底物浓度([S]的动力学曲线是S型曲线。
在[S]很低时,[S]的改变对酶活性的影响:
负协同大于非变构酶,正协同最小。
4.共价调节酶covalentmodificationenzyme
酶的基团与化合物共价结合或解离后,使酶的活性发生改变的酶!
概念
共价修饰调节
共价调节酶的修饰作用!
5.同工酶isoenzymeorisozyme
催化相同或相似化学反应,但酶分子结构、性质存在明显差异的一组酶!
原因
概念
组织或细胞器特异性!
细胞分化(胚胎发育)!
疾病诊断!
应用
分布
编码基因的差异!
Ⅳ.影响酶促反应速度的因素
1.动力学基础
研究酶促反应的速率以及影响反应速率的各种因素的科学。
因素
酶促反应动力学kineticsofenzyme-catalyzedreactions
底物浓度;酶浓度;抑制剂;温度;酸碱度等。
⑴反应速率及其测定
单位时间内底物或产物浓度的变化。
含义
速率定义
注意
数学形式
v=-dc/dt;或v=+dc/dt;
v=-d[S]/dt=d[P]/dt
负号:
底物浓度的减少
正号:
产物浓度的增多
若有水参与反应,则:
V==-dS/dt=dP/dt
⑵反应分子数和反应级数
①反应分子数
反应中相互作用的分子的数目。
单分子反应
反应分子数
动力学方程
含义
1个分子参加的反应。
概念
v=-dc/dt=kc
c:
底物浓度(mol/L)
k:
反应常数(反应速率常数)
两个反应物分子参加的反应。
双分子反应
含义
反应式
概念
乙酸的酯化反应:
A+B→→→P+Q
动力学方程
v=-dc/dt=kc1c2
c1和c2分别代表两种反应物的浓度。
A.必须先了解反应机制;
B.了解反应过程中如何进行各个单元
反应;
C.如果反应机制复杂,可实验测定
反应速率与浓度,推测反应机制。
如何判断反应的分子数?
②反应级数
总反应速率与浓度可用单分子反应的速率方程式表示的反应。
二级反应
一级反应
零级反应
总反应速率与浓度的关系可用双分子反应的速率方程式表示的反应。
总反应速率与反应物浓度无关的反应。
⑶各级反应的特征
①一级反应
将-dc/dt=kc对t积分,得:
lnc=-kt+m
m积分常数,若反应开始时(t=0)的浓度为c0(初浓度),代入上式求得m=lnc0,可得:
lnc=-kt+lnc0,整理后得:
动力学
特征
若c=c0/2,则k=ln2/t1/2,整理得t1/2≈0.693/k,表示速率常数与半衰期成反比,半衰期与反应物的初浓度无关。
②二级反应
将-dc/dt=kc1c2→dx/dt=k(a-x)(b-x)
a、b为反应物A、B的初浓度,x为已反应的浓度!
积分后得:
若A与B的初浓度相同,上式为dx/dt=k(a-x)2。
整理得:
若x=a/2时,求得半衰期为:
t1/2=1/ka,半衰期与初浓度成反比,即初浓度愈大,底物减少一半所需的时间愈短。
特征
③零级反应
反应速率与反应物的浓度无关!
④反应分子数与反应级数的区别
反应
分子数
反应级数
含义:
参与反应的分子数
应用:
研究反应机制(理论)
含义:
反应速度与反应物浓度的关系
应用:
实际测定数值(实践)
对-dc/dt=k或-dx/dt=k积分后得x=kt
生成物浓度与时间成正比。
动力学
特征
若x=a/2时,得半衰期t1/2=a/2k
与初浓度成正比。
2.底物浓度对酶反应速度的影响
⑴底物浓度与酶反应速度的关系
产物不断被下一步反应消耗,产物与酶形成ES的反应基本不会发生。
在酶浓度、温度、pH等不变的情况,酶和底物结合形成中间复合物,反应如下:
特点
没有反应常数k4!
结果
E+SESE+P
⑵米氏常数推导
稳态法
快速
平衡法
应用:
早期!
内容:
酶与底物形成ES的速度极快,
ES形成产物的速度极慢。
结果:
[ES]的动态平衡与ESP+E无关
应用:
现在
内容:
ES的形成速度与分解速度相等,
ES的浓度保持不变。
E+SESE+P
ES的形成速度:
d[ES]/dt=k1*[E现在]*[S]
=k1*([E]-[ES])*[S]
ES的分解速度:
-d[ES]/dt=k2*[ES]+k3*[ES]
在反应达到平衡时,ES的形成和分解的速率相等,得下面的公式
(1)
设
当[S]较大时
当[S]>>km时
关键点
A反应
- 配套讲稿:
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- 第三章 第三