急性创伤性深静脉血栓消退与不消退差异表达基因研究.docx
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急性创伤性深静脉血栓消退与不消退差异表达基因研究.docx
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急性创伤性深静脉血栓消退与不消退差异表达基因研究
急性创伤性深静脉血栓消退与不消退差异表达基因研究
中文摘要
目的:
在建立大鼠急性创伤性肢体深静脉血栓动物模型基础上,应用Affymetrix基因芯片技术,从基因水平研究血栓形成后,消退与不消退两种不同病理过程间股静脉中差异表达基因,探索影响创伤性肢体深静脉血栓消退的部分关键因素。
方法:
1.分组:
250只SD大鼠(雌雄不限)随机取20只作为对照组,余230只据创伤造模后血栓形成病理变化过程分为:
创伤即刻组(B组,造模后0.5小时)、血栓形成前期组(C组,造模后2.5小时)、血栓形成高峰期组(D组,造模后25小时)、血栓消退期组(E组,造模后72小时)、血栓不消退组(F组,造模后72小时)和血栓不形成组(G组,造模后72小时)。
2.造模:
对照组大鼠不造模,创伤组大鼠造模时不行麻醉,造模方法为:
双侧腹股沟区碘伏液消毒后行内侧切口,长约1cm,暴露出股动、静脉及股神经,稍作钝性分离显露长约1.5cm的股静脉,用12.5mm全齿蚊式血管钳分三段各钳夹血管1次(力量为血管钳紧1扣,每次持续3秒)后,用1号丝线全层间断缝合皮肤切口,不放置引流,除对照组、创伤即刻组外大鼠均行双后肢髋人字石膏固定;造模后观察大鼠双足颜色和肿胀情况。
3.取材方法:
对照组大鼠不造模即取材,创伤即刻组于造模后0.5小时,其余各组大鼠在相应时相点沿原切口暴露股静脉,观察血栓形成状态,符合分组标准后,用3%的戊巴比妥钠溶液按1ml/kg体重,腹腔内注射麻醉,仰卧位固定,碘伏液消毒双后肢前内侧皮肤区域后,沿双侧股静脉走行切开皮肤约4.5cm,观察局部组织反应、股静脉血栓是否形成、严重程度及消退、不消退情况,分别记录;显微镜下分离并切取双侧各长约4.5cm的股静脉及主要属支,留长约0.5cm的血管用甲醛固定,送HE染色组织切片镜检;0.9%生理盐水冲洗干净血管中的血液或血栓,离体30秒内放入冻存管,置入液氮罐中保存,用于总RNA提取。
4.总RNA提取:
TRIzol法分别提取上述7组股静脉标本总RNA;各组总RNA样品经琼脂糖凝胶电泳检测合格后(28SRNA和18SRNA条带整齐,两者带宽比值超过2倍)分为两份,一份送以进行基因芯片检测,另一份备用以行RT-PCR检测。
5.芯片及RT-PCR检测:
按AffymetrixRAT230A表达谱芯片操作流程,经cDNA探针制备、杂交、洗脱、染色、扫描,完成芯片检测;应用RT-PCR技术检测保留的RNA样品中IL-1β、Cinc2表达情况,并与芯片数据作比较。
6.数据筛选及分析:
通过倍数变化分析方法(两组间同一基因的Signallog2ratio比较,差值必须≥1或≤-1,常规认为具有差异性),选取血栓消退与不消退组差异表达基因,应用GeneCluster3.0分析软件聚类(能更容易地选取共表达的基因组,提示可能具有相似功能),绘制直观曲线图,并行GO功能分类,查询“NCBI”、“CNKI”网站及期刊文献,搜寻相应背景知识资料,结合表达变化规律综合分析。
结果:
1.250只SD大鼠共死亡5只,其中3只因造模过程中股动脉破裂,出血死亡,造模后25小时内2只死于肺栓塞,其余大鼠均存活;D、E、F、G四组190只大鼠死亡5只,25小时有126只血栓形成,D组取材用去25只,余101只观察至72小时,64只血栓消退,37只血栓不消退;至72小时又有23只发生血栓,36只一直无血栓形成;动物死亡率2%,血栓发生率80.54%,血栓消退率63.37%,血栓不形成率19.46%;HE染色股静脉组织切片镜检证实:
大体观察血栓形成状态进行的分组准确可靠。
2.各时相点7份标本总RNA经琼脂糖凝胶电泳检测,28SRNA和18SRNA条带整齐,两者量的比值超过2倍,样品质量好、无降解。
3.AffymetrixRAT230A芯片所能检测的15866个基因中,7389个基因有差异表达,占总数的46.57%,全部时相点均无变化的有8477个,占总数的53.43%;主要涉及促分裂素原活化蛋白激酶、Ca++、黏附斑、刺激神经的配体-受体相互作用、细胞因子-受体相互作用、核糖体、肌动蛋白细胞骨架、Wnt、嘌呤代谢、白细胞经内皮迁移、胰岛素、糖酵解/糖异生等信号通路。
4.消退组与对照组比较,Log2Ratio≥4.0的上调表达基因24个,无功能描述基因14个,有部分GO功能描述基因10个(Top2a、Stk6、Slpi、Olr1、Kdap、Itgam、Il6、Cd8a、Brca1、A2m),主要涉及DNA、蛋白质代谢和炎症反应等生物学过程;Log2Ratio≤-4.0的下调表达基因9个,无功能描述基因4个,有部分GO功能描述基因5个(Lepr、Gpd3、Atp1b4、Af6、Adh7),主要涉及细胞间信号传递及能量代谢等生物学过程。
5.不消退组与对照组比较,Log2Ratio≥4.0的上调表达基因26个,无功能描述基因16个,有部分GO功能描述基因10个(Slpi、Olr1、Nos2、Mmp9、Kdap、Itgam、Il6、Cxcl2、Cinc2、Cd8a),主要涉及炎症反应与细胞间作用等生物学过程;Log2Ratio≤-4.0的下调表达基因8个,无功能描述基因6个,有部分GO功能描述基因2个(Gpd3、Cyp1a1)。
6.消退组与不消退组比较,差异表达2倍以上(Signallog2ratio≥1或≤-1)基因共118个,无功能描述基因70个,有功能描述的基因48个,其中凋亡/肿瘤相关16个,结合相关29个,代谢相关20个,细胞周期相关3个,信号传导相关11个,结构分子活性相关3个,转录调控活性相关3个,运载体活性相关4个。
7.股静脉中Mmp-9、Mmp-12、Mmp-13、IL-1、Cxcl2、Cinc2、Ccl3、Ptges、Arg1等基因在血栓消退组与不消退组中表达变化规律较为突出,Mmp-9差异表达甚至达21倍,血栓高峰期组及不消退组中均呈现较高表达,而血栓消退组与血栓不形成组中表达相对较低;与它们共表达的三个未知功能基因,Affymetrix基因芯片探针号为:
1391505_x_at、1379497_at、1377365_at。
8.芯片杂交信号强度满意,各时相点IL-1β、Cinc2的RT-PCR检测结果与芯片结果变化趋势基本一致。
结论:
1.股静脉可通过表达Mmp-9、Mmp-12、Mmp-13组织修复、血管形成
相关基因,IL-1、Cxcl2、Cinc2、Ccl3等炎症相关基因,促进损伤血管修复,发挥抗凝活性,表达Arginase、Ptges等血管扩张、抑制血小板集聚相关基因,共同改变局部血管状态影响血栓消退,其作用在急性创伤性肢体深静脉血栓形成后,是促进还是阻碍血栓消退,还有待于在基因和蛋白水平进行功能性研究进一步证实。
2.1391505_x_at、1379497_at、1377365_at三个未知功能基因与上述基因呈明显的共表达趋势,推测其功能与组织修复、血管形成、炎症等相关,在血栓消退中发挥重要作用,可进行深入研究。
3.钳夹股静脉、髋人字石膏固定双后肢的方法,能成功建立大鼠急性创
伤性肢体深静脉血栓模型。
4.大鼠急性创伤性肢体深静脉血栓形成,是分裂素原活化蛋白激酶、Ca++、
细胞因子-受体相互作用等多种信号传导通路参与的过程。
5.大鼠急性创伤性肢体深静脉血栓模型中,血栓消退组与不消退组差异表达基因主要与凋亡或肿瘤(Itga6,Robo1,Alox12,Il1b,Ccl3,Cxcl2,Ptges,Il1a,Mmp-9)、结合(Alox12,Igfbp3,Oprl,Mx2,Mmp12,Il1b,Ccl3,Cinc2,Cxcl2,Il1a,Arg1,Stxbp5,Il13ra2,Mmp-9)、代谢(Alox12,Mx2,Mmp12,Ptges,Arg1,Mmp-9)、细胞循环(Il1b,Il1a)、信号传导(Robo1,Oprl,Il1b,Ccl3,Cinc2,Cxcl2,Il1a,Il13ra2)、结构分子活性(Col11a1)、运载体活性(Kcnj5)等功能相关。
6.RT-PCR技术检测IL1、Cinc2表达,结果与芯片结果有较好的一致性,一定程度上验证了Affymetrix基因芯片数据的可靠性。
关键词:
急性创伤性深静脉血栓形成消退基因
Tostudythedifferentialexpressiongenesbetweenthrombiresolutionandinsolutionintheprocessofacutetraumaticdeepveinthrombosisbygenechip
Abstract
Objectives:
Basedonestablishingaratmodelofacutetraumaticlimbdeepveinthrombosis.ThroughtheAffymetrix230Agenechip,tostudythedifferentialexpressedgenesbetweenthethrombiresolutiongroupandthrombiinsolutiongroupafterthrombosis.Toexplorethepartialinfluencefactorsofresolutionintraumaticdeepveinthrombosisonthelevelofgene.
Methods:
1.Grouping.20SDratsfromthetotal250(non-restrictionfemaleandmale)weredividedrandomlyintothecontrolgroup;theremained230weredividedinto6groups:
traumainstantgroup(B,at0.5haftermodeling),thrombosisprophasegroup(C,at2.5haftermodeling),thrombosiscrest-timegroup(D,at25haftermodeling),thrombiresolutiongroup(E,at72haftermodeling),thrombiinsolutiongroup(F,at72haftermodeling),non-thrombosisgroup(G,at72haftermodeling)accordingtodifferentphasesaftermodelbeingproducedandtheresultsofpreliminaryexperiment.
2.Modeling.Ratswerenotanesthetizedinmodelproducingprocess.AfteringuinalregionssterilizedbyIodophors,1cmlongmedialinguinalgrooveincisionwasadoptedtoexposeproximalfemoralvein,arteryandnerve.Afterbluntdissection,1.5cmexposedfemoralveinwasclampedatthreepointsseparatelywith12.5mmmosquito-hemostaticforceps,onceeachpoint;theclampingstrengthwasfasteningonebarbofhemostaticforceps,lasting3secondseachtime,thentheincisionwassutured,nodrainagewasset.RathibateralposteriorlimbswerefixedwithhipspicacastsexceptforgroupAandB.Atdifferentphasesaftermodelbeingproduced,colorandswellingextentofbothfeetwereobservedbygrossobservation.
3.Methodsforobtainingfemoralveins.Ratswereanesthetizedwith3%pentobarbitalsodium(1ml/kg,intraperitonealinjection),supinepositionfixation,sterilizinganteromedialskinofhibateralposteriorlimbsthroughiodophors,exposinghibateralfemoralveins.IngroupA,4.5cmfemoralveinandrelatedmaintributarieswereresected.IngroupB,at0.5h;groupC,at2.5h;groupD,at25h;groupE,F,G,at72haftermodelbeingproduced,thesameregionvasculartissuewasalsoresectedseparately.Partofthe0.5cmvesselseparatedforHEstaininghistologicalanalysis,therestwererinsedby0.9%physiologicalsalinetocleanupbloodandthrombi.Thevesselspecimenswereputintonitrogencanisterinlessthan30secondsafterexvivo,whichwouldbeusedfortotalRNAextraction.
4.ExtractionoftotalRNA.Afteraffirmingthestatusofthrombosisbyhistologicalanalysis,totalmRNAsoffemoralveinspecimensfromthe7phaseswereextractedseparatelythroughTRIzolmethod
.AlltotalRNAsampleswerecheckedbyagarosegelelectrophoresisanddevidedintotwoportionsforbeingdetectedthroughgenechipandRT-PCR.
5.RNAdetectionthroughgenechipandRT-PCR.ThroughcRNAprobespreparation,hybridization,washing,stainingandscanningwereperformedorderlytofinisharraydetectingaccordingtotheoperationflowsheet.TovalidatetheaccuratissimeofgenechipthroughRT-PCR.
6.Datascreeningandanalysis.Afterperformingtherestrictiveconditions:
thedataofexperimentalgroupinEvsAandFvsAshouldnotbemarked“absent”(thatistosay,thesignalintensityisweak);
Signallog2ratiosofthesamegenecomparedbetweentheresolutiongroupandinsolutiongroupmustbe≥1or≤-1(representingvariabilityroutinely),tosearchoutthedifferentialexpressiongenesbetweentheresolutiongroupandinsolutiongroup.ThescreenedgeneswereclusteredthroughsoftwareofGeneCluster3.0anddrawnvisualpicture.Thesegenesfunctionswereinquestedfromweb“NCBI”,“CNKI”,etc.andaggregateanalysiswasdone.
Results:
1.3and2ratsdiedbecauseoffemoralarteryruptureandpulmonaryembolismrespectively.IngroupA,B,C,noratpresentedthrombosis.Inthe190ratsofgroupD,E,FandG,total5ratsdied.From2.5hto72haftermodelbeingbuilt,149ratspresentedthrombosis,36werenothrombosis,64presentedthrombiresolutionand37presentedthrombiinsolution.Themortalityofratsis2%,incidenceratesofthrombosis,non-thrombosisandresolutionare80.54%,19.46%and63.37%respectively.
2.ThetotalRNAsamplesof7groupswereprovedtobehighqualitieswithoutdegradation.
3.Thehybridizationsignalintensityofarrayswassatisfactory.ThechangetendencyofIL-1βandCinc2detectedbygenechipandRT-PCRwereingoodcoincidence.
4.Inthe15866ratgeneswhichcanbedetectedbyAffymetrixRAT230Amicroarray,7389presenteddifferentialexpression,wereinvolvedinMAPK,Calcium,Focaladhesion,etc.signalingpathways;8477didnotpresentdifferentialexpressioninallphases.
5.Aftercomparisonbetweengroupresolutionandgroupcontrol,24genesupregulated(Log2Ratio≥4.0).Amongthem,14geneshavenofunctionaldescription,10genes(Top2a、Stk6、Slpi、Olr1、Kdap、Itgam、Il6、Cd8a、Brca1、A2m)withpartialGOfunctionaldescriptionrefertoDNAmetabolism,proteinmetabolism,inflammatoryreaction,etc..9genesdownregulated(Log2Ratio≤-4.0).Amongthem,4geneshavenofunctionaldescription,5genes(Lepr、Gpd3、Atp1b4、Af6、Adh7)withpartialGOfunctionaldescriptionrefertocell-cellsignaling,energymetabolism,etc..
6.Aftercomparisonbetweengroupinsolutionandgroupcontrol,26genesupregulated(Log2Ratio≥4.0).Amongthem,16geneshavenofunctionaldescription,10genes(Slpi、Olr1、Nos2、Mmp9、Kdap、Itgam、Il6、Cxcl2、Cinc2、Cd8a)withpartialGOfunctionaldescriptionrefertoDNAinflammatoryreaction,cell-cellactionetc.;8genesdownregulated(Log2Ratio≤-4.0).Amongthem,6geneshavenofunctionaldescription,2genes(Gpd3,Cyp1a1)havepartialGOfunctionaldescription.
7.The118differentialexpressiongenesbetweentheresolutionandinsolutionhadbeensearchedout.Amongthem,48genes,whichwithsymbolswereassignedGOfunctionsbyGenebankandwererelatedtothefunctionsofapoptosis,tumor,binding,metabolism,cellcycling,signaling,constructionmolecularactivityandtransporter.
8.Comparedtheresolutiontoinsolution,theexpressionsofMmp-9,Mmp-12,Mmp-13,IL-1,Cxcl2,Cinc2,Ccl3,Ptges
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