铁皮石斛组培技术.docx

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铁皮石斛组培技术

铁皮石斛组培技术

铁皮石斛的组织培养研究

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植物组织培养

摘要

铁皮石斛（Dendrobiumofficinale）是兰科（Orchidaceae）石斛属（DendrobiumSw．）多年生草本植物。

铁皮石斛为石斛之极品，它因表皮呈铁绿色而得名。

铁皮石斛是传统名贵中药材，有生津益胃、清热养阴和清咽利嗓等功效，主要药用成分石斛多糖是一种免疫调节剂。

铁皮石斛蒴果成熟时易开裂，且种子粒径小，自然繁殖率低。

为了保护和有效利用铁皮石斛，通过组织培养技术大量快速繁殖铁皮石斛组培苗显得尤为重要。

关键词：

铁皮石斛组织培养移栽培养基转接快速繁殖

Abstract

DendrobiumorchidDendrobiumisaperennialherb.ItistheultimateinDendrobiumSw,namedforitsferricgreenepidermis.AsararetraditionalChineseherbalmedicine,itcontributestodrydampnessandstrengthenthespleen,clearawaylung-heat,nourishyin，clearawayheat,andsoon.ThemainmedicinalcomponentsofDendrobiumpolysaccharideisakindofimmunemodulators.Whenmature,itscapsulecracks,inwhichseedsareinsmallparticlesizeandhavealowrateofnaturalreproduction.InordertoprotectandutilizetheDendrobiumorchidDendrobium,itisparticularlyimportanttoestablisharapidpropagationbythetissueculturetechnique.

keywords:

DendrobiumorchidDendrobiumtissueculture

culturemediumadapterrapidpropagation

前言

多年生草本，具有气生根。

茎直立丛生、高30-50cm，肉质稍扁，有节、有槽沟，黄绿色。

单叶互生，叶片革质，无柄，狭长椭圆形或近披针形，叶鞘抱茎。

总状花序腋生，每个花序有花2-3朵，白色，先端淡紫红色。

铁皮石斛为兰科石斛属多年生草本植物。

作为我国传统的名贵中药,具有重要的药用价值。

由于长期过度采挖,加之本身繁殖率低,导致其野生资源急剧减少,日趋濒危,现已被列为国家重点保护植物,成为国家重点保护的药材品种。

试验结果表明,MS、N6和B5等3种基本培养基对铁皮石斛芽诱导和增殖的效果,B5要优于其他基本培养基;在激素浓度配中,铁皮石斛原球茎在6-BA2.0mg/L+NAA0.5mg/L中,增殖系数最大;天然附加物对铁皮石斛增殖的影响差异很大,实际应用中宜选用香蕉汁为添加剂;在B5+蔗糖30g/L+香蕉汁100mg/L+琼脂5.8g/L基本培养基中,加入的NAA对铁皮石斛芽的生根以1.0mg/L处理的效果最好,但考虑到NAA价格较贵,且在浓度范围为0.2-1.0之间对生根的影响差异不明显,在实际应用中以选用0.2mg/L的NAA为好;生成的小苗经过炼苗后,在铺有一层苔藓的含有75％锯末+20％泥炭土+5％碎磁片的基质上能够良好的生长。

1.培养基

1.1配方

根据不同阶段，培养基配方有所差异。

如表1-1

表1-1各种培养基配方

不同阶段

培养基

备注

愈伤组织（原球茎）的诱导

MS+2.0mg/L6-BA+3%蔗糖+0.8%琼脂

pH=5.8

原球茎的增殖

MS+20%马铃薯+3%蔗糖+0.8%琼脂

pH=5.8

原球茎的分化

MS+20%马铃薯+2.0mg/LNAA+3%蔗糖+0.8%琼脂

pH=5.8

幼株的生根壮苗

MS+10%香蕉+2.0mg/LNAA+3%蔗糖+0.8%琼脂

pH=5.4-5.6

1.2配制（以1000ml幼株的生根壮苗培养基为例）

配方：

10%香蕉（w/w）+MS+3%蔗糖（w/w）+0.8%琼脂（w/w）+2.0mg/LNAA

1）量取800ml蒸馏水于洁净的大烧杯中，加热至沸腾；

2）准确称量100g香蕉果肉，切成碎片状，并倒入上述烧杯中，加热煮沸5min，其间搅拌使之充分溶解；

3）按照大量、微量、Fe2+盐、有机Ⅰ、有机Ⅱ顺序，量取MS各种母液于盛有50ml蒸馏水的烧杯，混合均匀；

4）将2）和3）的溶液混合，然后加入30g蔗糖，并移取2mlNAA（0.1mg/ml），混合均匀；

5）加热至沸腾，加入8g琼脂并煮沸5min，其间不断搅拌使之充分溶解；

6）冷却至50±5℃时，调pH至5.4—5.6。

分装于培养瓶内，33.3ml/瓶。

培养基附加物：

（1）天然添加物

在基本培养基中加人香蕉汁、马铃薯汁、绿豆芽汁、苹果汁仁、椰子乳等能促进铁皮石斛幼苗的生长和根系的发育，香蕉汁的促进作用最为显著。

（2）炭源

铁皮石斛在生根培养时加入活性炭有利于试管苗的生长，能使根系长得更加粗壮闭。

唐桂香等认为在培养基中添加活性炭有助于提高试管苗的成活率，但对苗的根数和根长影响小。

注意事项

①溶解香蕉的蒸馏水尽可能多，以确保香蕉各种成分完全溶解；

②各种母液混合时，要按照大量、微量、Fe2+盐、有机Ⅰ、有机Ⅱ的顺序；

③煮沸时，小心溶液溢出；

④分装时不要污染培养瓶瓶口。

1.3灭菌

1.3.1培养基灭菌

1）检查灭菌锅的水位、电源、排气阀、排气管、安全阀以及压力表，确保灭菌锅各指标和功能的正常，以防事故发生；

2）把带灭菌的培养基装入锅内，盖上锅盖，对称而均匀地扭紧螺丝；

3）打开电源和排气阀，调节电压至220V；

4）待排气阀排除水蒸气30s—1min后，关闭排气阀；

5）当温度上升到121℃后，调节电压至135V，保持20min；

6）关闭电源，使之自动降温至0℃。

10min后，打开排气阀和锅盖；

7）5—10min后，取出培养基放于试验台上冷却，待用。

表1-2灭菌时间统计

阶段

单锅灭菌（耗时64min）

多锅连续灭菌

第一锅（耗时63min）

第二锅（耗时46min）

起始

22:

21

8:

04

9:

30

排气

22:

41

8:

23

9:

43

T=121℃

22:

50

8:

32

9:

50

关闭电源

23:

10

8:

52

10:

10

气压降至0

23:

25

9:

07

10:

16

1.3.2外植体灭菌

①原材料清洗

选择生长旺盛、无病害的铁皮石斛健康植株，每2节为一段放入500ml的烧杯中，加入少量洗衣粉，用纱布单层棚扎杯口，然后用工程线扎紧，放在自来水龙头下冲洗30min，冲水量调整到能使铁皮石斛茎段在水中漂动为好。

主要作用是洗去外表尘土和大颗粒菌落、菌丝等。

②材料二次消毒灭菌

将上述完成后的材料带到无菌室超净工作台上，进行二次消毒灭菌:

将茎段腋芽的苞叶拨去。

70%的酒精速浸25s，用0.1%的升汞溶液浸泡10min用无菌水冲洗5次，灭菌过程中不断摇动烧杯使灭菌更加彻底，以去掉表面药物残留。

2.转接

2.1转接前准备

1）培养皿、镊子、剪刀等转接用具的灭菌（可以在培养基灭菌时附带）；

2）检查超净台内各种用具，及时补充酒精灯的酒精，确保用具齐全；

3）放置待转接材料和待接入培养基，以“方便操作为宜”而陈列；

2.2转接

1）揭去防尘膜，打开电源、通风和紫外灯，灭菌15—20min；

2）关掉紫外，打开白炽灯，用75%酒精仔细擦拭手指、指甲、材料瓶瓶盖及盖边缘、工作区等处，确保“消毒”彻底；

3）点燃酒精灯，用无菌镊子把材料夹取于无菌培养皿内，挑选生命力旺盛的植株用于转接；

4）用无菌剪刀修去多余的根系，“双镊子”法将材料转接于新的培养基中；

5）标注相关日期和品系，转至培养室培养。

注意事项

①操作时，所有用具均不能从“核心工作区”和开启的培养瓶上面晃过，防止细菌落入而导致污染；

②在打开材料瓶和培养瓶后，其盖均在酒精灯外焰灼烧3-5s，瓶口灼烧5-10s；盖瓶盖时，亦如此操作；

③转接时，确保手一直在超净台内，以免带入外界细菌。

2.3培养

石斛组培常用的温度为（26±1）℃

光强1600～2000lx

日照光8~12h/d

（1）组培苗在光照度为2000lx，温度以22℃为宜。

（2）在20一22℃时丛生芽增殖较好，温度超过25℃丛生芽就开始分化成苗。

待增殖芽数量较多时，将高1～2cm、带有2～3片叶的小芽切下转入生根培养基上进行生根培养。

培养30天左右，基部开始出现2～3条约1cm长的白色根，随后逐渐伸长，生根率达到90％以上。

3.炼苗

3.1炼苗目的

炼苗的主要目的是使组培苗适应外界的环境——温差，湿度差以及微生物环境。

3.2炼苗方法

1）将待炼苗的材料放置于欲移栽的环境，不开盖保持4-5天；

2）半开盖保持1-2天后，全开盖再炼苗2-3天；

方法（整个过程：

适应期，半开瓶期，开瓶期，出瓶，洗根，浸泡，移栽或框炼并移栽）。

4.移栽

4.1基质选择

栽培的基质为火山岩1+椰衣2+木炭1的基质配比石斛兰长势最好，椰衣1+水苔1和块状椰衣的基质配比稍微次之。

多数树皮中含有较多的酚类物质，这对于植物是有害的，而且树皮的C/N比值都较高，直接使用会引起微生物对速效氮的竞争作用，造成N素缺乏，树皮保水性能差。

4.2移栽技术要求

将已经灭菌地石斛茎段，在无菌条件下切成至少带有一个茎节地茎段，接种于事先准备好的诱导芽培养基中诱导出芽。

从茎尖或茎段培养得到的小苗，大多数是无根小苗，需转入1／2MS加马铃薯进行生根和壮苗培养，才能出管移栽。

铁皮石斛不宜深植，种植时根系向四周均匀展开，将基质填充根部、基部必须露出，否则易造成烂根。

移栽后隔5天再浇水效果较好。

30天内每隔1天喷雾1次，水量不宜过多，期间勿施肥，待小苗恢复正常生长后才开始常规的水肥管理。

4.3移栽后期管理

营养生长期施用氮肥较高的花多多复合肥（N:

P:

K=30:

10:

10），花芽分化期开始施偏重磷钾肥（N:

P:

K=10:

30:

20），其余时期施（N:

P:

K=15:

20:

25）以促进假鳞茎的生长，采用“薄肥多施”的原则，施肥频率为1次／1周，浓度为0.1%叶面喷施，雨天不施肥。

石斛生长季节应注意追肥，每年可追肥两次,第一次在春季,以促进石斛生长,第二次在秋末,既可使石斛储蓄养分,又可使石斛保温过冬。

可用腐熟的花生鼓、菜籽饼、过磷酸钙等加入河泥等混合物撒在根部，此外尚可用0.05—0.1%磷酸二氢钾进行根外追肥。

5.结论与分析

本文以铁皮石斛为材料,通过研究不同基本培养基对铁皮石斛茅诱导和增殖的影响、不同激素浓度组合对原球茎生长影响、天然附加物对铁皮石斛茅增殖的影响、不同浓度NAA对铁皮石斛原球茎增殖的影响,找出适合石斛组织培养快速繁殖的方法及条件,以便更好的用于生产实践。

通过本实验，有助于我们更好地掌握组织培养技术，了解铁皮石斛的组织培养特点。

本试验结果表明：

铁皮石斛形成的愈伤组织有群体效益，在培养容器中的分布密度和愈伤组织0.5cm2为宜；铁皮石斛在组培增殖和生根培养过程中需添加土豆汁等辅助物质，才能使组培苗正常生长；铁皮石斛的种子是呈粉状的，从表现性来看无法用肉眼观察出种子的品质好坏，若用种子做外植体进行组培繁育，无法预计培育的后代性状是否优良。

用茎段为外植体建立快繁体系则具有较多的优点（诱导时间短、发生过程简单），在已知母本材料遗传特性的前提下，不存在分化的组织或基本植物结构的丧失，能够较好地保持母本的生物学性状和经济性状。

随着近年来中药产业的蓬勃发展，人们在不断的开发挖掘铁皮石斛药用价值，企业也为提高其经济效益，确保铁皮石斛药材原料基地的建设，盲目地进行规模化产业化生产育苗，而忽视了合理的繁育手段。

一旦建立组培快繁体系，繁育的后代却无法保持亲本良好特性，这样的话前期工作将毁于一旦，还会带来巨大的经济损失，所以在良种选好的前提下需选择能最大极限的保持亲本的特性高效、稳定、经济合理繁育体系来保持铁皮石斛资源达到长期有效地永续利用。

本研究只在铁皮石斛法、遗传稳定性方面做了研究分析，还有待于进行组培苗成年个体差异跟踪调查，组培成品苗药物活性提取及分析等方面进行全面的、更详细的研究。

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