基因组DNA的提取.docx
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基因组DNA的提取
第六章基因组DNA的提取
第一节概述
基因组DNA的提取通常用于构建基因组文库、Southern杂交(包括RFLP)及PCR分离基因等。
利用基因组DNA较长的特性,可以将其与细胞器或质粒等小分子DNA分离。
加入一定量的异丙醇或乙醇,基因组的大分子DNA即沉淀形成纤维状絮团飘浮其中,可用玻棒将其取出,而小分子DNA则只形成颗粒状沉淀附于壁上及底部,从而达到提取的目的。
在提取过程中,染色体会发生机械断裂,产生大小不同的片段,因此分离基因组DNA时应尽量在温和的条件下操作,如尽量减少酚/氯仿抽提、混匀过程要轻缓,以保证得到较长的DNA。
一般来说,构建基因组文库,初始DNA长度必须在100kb以上,否则酶切后两边都带合适末端的有效片段很少。
而进行RFLP和PCR分析,DNA长度可短至50kb,在该长度以上,可保证酶切后产生RFLP片段(20kb以下),并可保证包含PCR所扩增的片段(一般2kb以下)。
不同生物(植物、动物、微生物)的基因组DNA的提取方法有所不同;不同种类或同一种类的不同组织因其细胞结构及所含的成分不同,分离方法也有差异。
在提取某种特殊组织的DNA时必须参照文献和经验建立相应的提取方法,以获得可用的DNA大分子。
尤其是组织中的多糖和酶类物质对随后的酶切、PCR反应等有较强的抑制作用,因此用富含这类物质的材料提取基因组DNA时,应考虑除去多糖和酚类物质。
本实验以水稻幼苗(禾本科)、李(苹果)叶子、动物肌肉组织和大肠杆菌培养物为材料,学习基因组DNA提取的一般方法。
第二节从植物组织提取基因组DNA
一、材料
水稻幼苗或其它禾本科植物,李(苹果)幼嫩叶子。
二、设备
移液器,冷冻高速离心机,台式高速离心机,水浴锅,陶瓷研钵,50ml离心管(有盖)及5ml和1.5ml离心管,弯成钩状的小玻棒。
三、试剂
1、提取缓冲液Ⅰ:
100mmol/LTris·Cl,pH8.0,20mmol/LEDTA,500mmol/LNaCl,1.5%SDS。
2、提取缓冲液Ⅱ:
18.6g葡萄糖,6.9g二乙基二硫代碳酸钠,6.0gPVP,240ul巯基乙醇,加水至300ml。
3、80:
4:
16/氯仿:
戊醇:
乙醇
4、RnaseA母液:
配方见第一章。
5、其它试剂:
液氮、异丙醇、TE缓冲液,无水乙醇、70%乙醇、3mol/LNaAc。
四、操作步骤:
(一)水稻幼苗或其它禾木科植物基因组DNA提取
1.在50ml离心管中加入20ml提取缓冲液Ⅰ,60℃水浴预热。
2.水稻幼苗或叶子5-10g,剪碎,在研钵中加液氮磨成粉状后立即倒入预热的离心管中,剧烈摇动混匀,60℃水浴保温30-60分钟(时间长,DNA产量高),不时摇动。
3.加入20ml氯仿/戊醇/乙醇溶液,颠倒混匀(需带手套,防止损伤皮肤),室温下静置5-10分钟,使水相和有机相分层(必要时可重新混匀)。
4.室温下5000rpm离心5分钟。
5.仔细移取上清液至另一50ml离心管,加入1倍体积异丙醇,混匀,室温下放置片刻即出现絮状DNA沉淀。
6.在1.5mleppendorf中加入1mlTE。
用钩状玻璃棒捞出DNA絮团,在干净吸水纸上吸干,转入含TE的离心管中,DNA很快溶解于TE。
7.如DNA不形成絮状沉淀,则可用5000rpm离心5分钟,再将沉淀移入TE管中。
这样收集的沉淀,往往难溶解于TE,可在60℃水浴放置15分钟以上,以帮助溶解。
8.将DNA溶液3000rpm离心5分钟,上清液倒入干净的5ml离心管。
9.加入5μlRNaseA(10μg/μl),37℃10分钟,除去RNA(RNA对DNA的操作、分析一般无影响,可省略该步骤)。
10.加入1/10体积的3mol/LNaAc及2×体积的冰乙醇,混匀,-20℃放置20分钟左右,DNA形成絮状沉淀。
11.用玻棒捞出DNA沉淀,70%乙醇漂洗,再在干净吸水纸上吸干。
12.将DNA重溶解于1mlTE,-20贮存。
13.取2μlDNA样品在0.7%Agarose胶上电泳,检测DNA的分子大小。
同时取15μl稀释20倍,测定OD260/OD280,检测DNA含量及质量。
[注意]5g样品可保证获得500μgDNA,足供RFLP、PCR等分析之用。
(二).从李(苹果)叶子提取基因组DNA
1.取3-5克嫩叶,液氮磨成粉状。
2.加入提取缓冲液Ⅱ10ml,再研磨至溶浆状。
10000rpm,10min。
3.去上清液,沉淀加提取液Ⅰ20ml,混匀。
65℃,30-60min,常摇动。
4.同本节
(一)中步骤3-13操作。
第三节从动物组织提取基因组DNA
一、材料
哺乳动物新鲜组织。
二、设备
移液管、高速冷冻离心机、台式离心机、水浴锅。
三、试剂
1、分离缓冲液:
10mmol/LTris·ClpH7.4,10mmol/LNaCl,25mmol/LEDTA。
2、其它试剂:
10%SDS,蛋白酶K(20mg/ml或粉剂),乙醚,酚:
氯仿:
异戊醇(25:
24:
1),无水乙醇及70%乙醇,5mol/LNaCl,3mol/LNaAc,TE。
四、操作步骤:
1.切取组织5g左右,剔除结缔组织,吸水纸吸干血液,剪碎放入研钵(越细越好)。
2.倒入液氮,磨成粉末,加10ml分离缓冲液。
3.加1ml10%SDS,混匀,此时样品变得很粘稠。
4.加50ul或1mg蛋白酶K,37℃保温1-2小时,直到组织完全解体。
5.加1ml5mol/LNaCl,混匀,5000rpm离心数秒钟。
6.取上清液于新离心管,用等体积酚:
氯仿:
异戊醇(25:
24:
1)抽提。
待分层后,3000rpm离心5分钟。
7.取上层水相至干净离心管,加2倍体积乙醚抽提(在通风情况下操作)。
8.移去上层乙醚,保留下层水相。
9.加1/10体积3mol/LNaAc,及2倍体积无水乙醇颠倒混合沉淀DNA。
室温下静止10-20分钟,DNA沉淀形成白色絮状物。
10.用玻棒钩出DNA沉淀,70%乙醇中漂洗后,在吸水纸上吸干,溶解于1mlTE中,-20℃保存。
11.如果DNA溶液中有不溶解颗粒,可在5000rpm短暂离心,取上清;如要除去其中的RNA,可加5μlRNaseA(10μg/μl),37℃保温30分钟,用酚抽提后,按步骤9-10重沉淀DNA。
第四节细菌基因组DNA的制备
一、材料
细菌培养物。
二、设备
移液管,高速冷冻离心机,台式离心机,水浴锅。
三、试剂
1、CTAB/NaCl溶液:
4.1gNaCl溶解于80mlH2O,缓慢加入10gCTAB,加水至100ml。
2、其它试剂:
氯仿:
异戊醇(24:
1),酚:
氯仿:
异戊醇(25:
24:
1),异丙醇,70%乙醇,TE,10%SDS,蛋白酶K(20mg/ml或粉剂),5mol/LNaCl。
四、操作步骤:
1.100ml细菌过夜培养液,5000rpm离心10分钟,去上清液。
2.加9.5mlTE悬浮沉淀,并加0.5ml10%SDS,50μl20mg/ml(或1mg干粉)蛋白酶K,混匀,37℃保温1小时。
3.加1.5ml5mol/LNaCl,混匀。
4.加1.5mlCTAB/NaCl溶液,混匀,65℃保温20分钟。
5.用等体积酚:
氯仿:
异戊醇(25:
24:
1)抽提,5000rpm离心10分钟,将上清液移至干净离心管。
6.用等体积氯仿:
异戊醇(24:
1)抽提,取上清液移至干净管中。
7.加1倍体积异丙醇,颠倒混合,室温下静止10分钟,沉淀DNA。
8.用玻棒捞出DNA沉淀,70%乙醇漂洗后,吸干,溶解于1mlTE,-20℃保存。
如DNA沉淀无法捞出,可5000rpm离心,使DNA沉淀。
9.如要除去其中的RNA,可以按本章第三节中操作步骤处理。
第五节基因组DNA的检测
上述方法得到的DNA一般可以用作Southern,RFLP、PCR等分析。
由于所用材料的不同,得到的DNA产量及质量均不同,有时DNA中含有酚类和多糖类物质,会影响酶切和PCR的效果。
所以获得基因组DNA后,均需检测DNA的产量和质量。
1.DNA溶液稀释20-30倍后,测定OD260/OD280比值,明确DNA的含量和质量。
2.取2-5μl在0.7%agarose胶上电泳,检测DNA的分子大小。
3.取2μgDNA,用10单位(U)HindⅢ酶切过夜,0.7%agarose胶上电泳,检测能否完全酶解(做RFLP,DNA必须完全酶解)。
如果DNA中所含杂质多,不能完全酶切,或小分子DNA多,影响接续的分析和操作,可以用下列方法处理:
(1)选用幼嫩植物组织,可减少淀粉类的含量。
(2)酚:
氯仿抽提,去除蛋白质和多糖。
(3)Sepharose柱过滤,去除酚类、多糖和小分子DNA。
(4)CsCl梯度离心,去除杂质,分离大片段DNA(可用作文库构建)。
第七章RFLP和RAPD技术
第一节概述
DNA分子水平上的多态性检测技术是进行基因组研究的基础。
RFLP(RestrictionFragmentLengthPolymorphism,限制片段长度多态性)已被广泛用于基因组遗传图谱构建、基因定位以及生物进化和分类的研究。
RFLP是根据不同品种(个体)基因组的限制性内切酶的酶切位点碱基发生突变,或酶切位点之间发生了碱基的插入、缺失,导致酶切片段大小发生了变化,这种变化可以通过特定探针杂交进行检测,从而可比较不同品种(个体)的DNA水平的差异(即多态性),多个探针的比较可以确立生物的进化和分类关系。
所用的探针为来源于同种或不同种基因组DNA的克隆,位于染色体的不同位点,从而可以作为一种分子标记(Mark),构建分子图谱。
当某个性状(基因)与某个(些)分子标记协同分离时,表明这个性状(基因)与分子标记连锁。
分子标记与性状之间交换值的大小,即表示目标基因与分子标记之间的距离,从而可将基因定位于分子图谱上。
分子标记克隆在质粒上,可以繁殖及保存。
不同限制性内切酶切割基因组DNA后,所切的片段类型不一样,因此,限制性内切酶与分子标记组成不同组合进行研究。
常用的限制性内切酶一般是HindⅢ,BamHⅠ,EcoRⅠ,EcoRV,XbaⅠ,而分子标记则有几个甚至上千个。
分子标记越多,则所构建的图谱就越饱和。
构建饱和图谱是RFLP研究的主要目标之一。
运用随机引物扩增寻找多态性DNA片段可作为分子标记。
这种方法即为RAPD(RandomamplifiedpolymorphicDNA,随机扩增的多态性DNA)。
尽管RAPD技术诞生的时间很短,但由于其独特的检测DNA多态性的方式以及快速、简便的特点,使这个技术已渗透于基因组研究的各个方面。
该RAPD技术建立于PCR技术基础上,它是利用一系列(通常数百个)不同的随机排列碱基顺序的寡聚核苷酸单链(通常为10聚体)为引物,对所研究基因组DNA进行PCR扩增.聚丙烯酰胺或琼脂糖电泳分离,经EB染色或放射性自显影来检测扩增产物DNA片段的多态性,这些扩增产物DNA片段的多态性反映了基因组相应区域的DNA多态性。
RAPD所用的一系列引物DNA序列各不相同,但对于任一特异的引物,它同基因组DNA序列有其特异的结合位点.这些特异的结合位点在基因组某些区域内的分布如符合PCR扩增反应的条件,即引物在模板的两条链上有互补位置,且引物3'端相距在一定的长度范围之内,就可扩增出DNA片段.因此如果基因组在这些区域发生DNA片段插入、缺失或碱基突变就可能导致这些特定结合位点分布发生相应的变化,而使PCR产物增加、缺少或发生分子量的改变。
通过对PCR产物检测即可检出基因组DNA的多态性。
分析时可用的引物数很大,虽然对每一个引物而言其检测基因组DNA多态性的区域是有限的,但是利用一系列引物则可以使检测区域几乎覆盖整个基因组。
因此RAPD可以对整个基因组DNA进行多态性检测。
另外,RAPD片段克隆后可作为RFLP的分子标记进行作图分析。
本实验将学习RFLP的酶切,电泳和膜的制作以及RAPD技术。
探针标记及杂交检测方法请另详见分子杂交技术。
第二节 RFLP技术
一、材料
基因组DNA(大于50kb,分别来自不同的材料)。
二、设备
电泳仪及电泳槽,照相用塑料盆5只,玻璃或塑料板(比胶块略大)4块,吸水纸若干,尼龙膜(依胶大小而定),滤纸,eppendorf管(0.5ml)若干。
三、试剂:
1、限制性内切酶(BamHⅠ,EcoRⅠ,HindⅢ,XbaⅠ)及10×酶切缓冲液。
2、5×TBE电泳缓冲液:
配方见第一章。
3、变性液:
0.5mol/LNaOH,1.5mol/LNaCl。
4、中和液:
1mol/LTris·Cl,pH7.5/1.5mol/LNaCl。
5、10×SSC:
配方见第九章。
6、其它试剂:
0.4mol/LNaOH,0.2mol/LTris·Cl,pH7.5/2×SSC,ddH2O,Agarose0.8%,0.25mol/LHCl。
四.操作步骤
1.基因组DNA的酶解
(1)大片断DNA的提取详见基因组DNA提取实验,要求提取的DNA分子量大于50kb,没有降解。
(2)在50μl反应体系中,进行酶切反应:
5μg基因组DNA
5μl10×酶切缓冲液
20单位(U)限制酶(任意一种)
加ddH2O,至50μl
(3)轻微振荡,离心,37℃反应过夜。
(4)取5μl反应液,0.8%琼脂糖电泳观察酶切是否彻底,这时不应有大于30kb的明显亮带出现。
[注意]未酶切的DNA要防止发生降解,酶切反应一定要彻底。
2.Southern转移
(1)酶解的DNA经0.8%琼脂糖凝胶电泳(可18V过夜)后EB染色观察。
(2)将凝胶块浸没于0.25mol/LHCl中脱嘌呤,10分钟。
(3)取出胶块,蒸馏水漂洗,转至变性液变性45分钟。
经蒸馏水漂洗后转至中和液中和30分钟。
(4)预先将尼龙膜,滤纸浸入水中,再浸入10×SSC中,将一玻璃板架于盆中铺一层滤纸(桥)然后将胶块反转放置,盖上尼龙膜,上覆二层滤纸,再加盖吸水纸,压上半公斤重物,以10×SSC盐溶液吸印,维持18-24小时。
也可用电转移或真空转移。
(5)取下尼龙膜,0.4mol/LNaOH30秒,迅速转至0.2mol/LTris·Cl,pH7.5/2×SSC,溶液中,5分钟。
(6)将膜夹于2层滤纸内,80℃真空干燥2小时。
(7)探针的制备和杂交见第九章分子杂交部分。
[注意]1、步骤
(2)中脱嘌呤时间不能过长。
2、除步骤
(1)、(4)、(5)外,其余均在摇床上进行操作。
3、步骤(4)中,当尼龙膜覆于胶上时,绝对防止胶与膜之间有气泡发生,加盖滤时也不应有气泡发生。
4、有时用一种限制性内切酶不能发现RFLP的差异,这时应该试用另一种酶。
第三节RAPD技术
一、材料
不同来源的DNA(50ng/ul)。
二、设备
PCR仪,PCR管或硅化的0.5mleppendorf管,电泳装置。
三、试剂
1、随机引物(10mer)(5umol/L):
购买成品。
2、Taq酶:
购买成品。
3、10xPCR缓冲液:
配方见第八章。
4、MgCl2:
25mmol/L。
5、dNTP:
每种2.5mmol/L。
四、操作步骤:
1.在25ul反应体系中,加入
模板DNA1ul(50ng)
随机引物1ul(约5pmol)
10xPCRBuffer2.5ul
MgCl22ul
dNTP2ul
Taq酶1单位(U)
加ddH2O至25ul
混匀稍离心,加一滴矿物油。
2.在加热至90℃以上的PCR仪中预变性94℃2分钟,然后循环:
94℃1分钟,36℃1分钟,72℃1分钟,共40轮循环。
3.循环结束后,72℃10分钟,4℃保存。
4.取PCR产物15ul加3ul上样缓冲液(6x)于2%琼脂糖胶上电泳,稳压50-100V(电压低带型整齐,分辨率高)。
5.电泳结束,观察、拍照。
[注意]1、电泳时一般RAPD带有5-15条,大小0.1-2.0kb。
2、特异性的DNA带可以克隆作为一个新的分子标记应用。
第八章聚合酶链式反应(PCR)扩增和扩增产物克隆
第一节概述
PCR(PolymeraseChainReaction,聚合酶链反应)是一种选择性体外扩增DNA或RNA的方法.它包括三个基本步骤:
(1)变性(Denature):
目的双链DNA片段在94℃下解链;
(2)退火(Anneal):
两种寡核苷酸引物在适当温度(50℃左右)下与模板上的目的序列通过氢键配对;(3)延伸(Extension):
在TaqDNA聚合酶合成DNA的最适温度下,以目的DNA为模板进行合成.由这三个基本步骤组成一轮循环,理论上每一轮循环将使目的DNA扩增一倍(图4),这些经合成产生的DNA又可作为下一轮循环的模板,所以经25-35轮循环就可使DNA扩增达106倍。
一、PCR反应中的主要成份
1.引物:
PCR反应产物的特异性由一对上下游引物所决定。
引物的好坏往往是PCR成败的关键。
引物设计和选择目的DNA序列区域时可遵循下列原则:
(1)引物长度约为16-30bp,太短会降低退火温度影响引物与模板配对,从而使非特异性增高。
太长则比较浪费,且难以合成。
(2)引物中G+C含量通常为40%-60%,可按下式粗略估计引物的解链温度Tm=4(G+C)+2(A+T).(3)四种碱基应随机分布,在3'端不存在连续3个G或C,因这样易导致错误引发。
(4)引物3'端最好与目的序列阅读框架中密码子第一或第二位核苷酸对应,以减少由于密码子摆动产生的不配对。
(5)在引物内,尤其在3'端应不存在二级结构。
两引物之间尤其在3'端不能互补,以防出现引物二聚体,减少产量。
两引物间最好不存在4个连续碱基的同源性或互补性。
(7)引物5'端对扩增特异性影响不大,可在引物设计时加上限制酶位点、核糖体结合位点、起始密码子、缺失或插入突变位点以及标记生物素、荧光素、地高辛等.通常应在5'端限制酶位点外再加1-2个保护碱基。
引物不与模板结合位点以外的序列互补。
所扩增产物本身无稳定的二级结构,以免产生非特异性扩增,影响产量。
(9)简并引物应选用简并程度低的密码子,例如选用只有一种密码子的Met,3'端应不存在简并性。
否则可能由于产量低而看不见扩增产物。
一般PCR反应中的引物终浓度为0.2-1.0μmol/L。
引物过多会产生错误引导或产生引物二聚体,过低则降低产量。
利用紫外分光光度计,可精确计算引物浓度,在1cm光程比色杯中,260nm下,引物浓度可按下式计算:
Xmol/L=OD260/A(16000)+C(70000)+G(12000)+T(9600)
X:
引物摩尔浓度,A、C、G、T:
引物中4种不同碱基个数。
2.4种三磷酸脱氧核苷酸(dNTP):
dNTP应用NaOH将pH调至7.0,并用分光光度计测定其准确浓度.dNTP原液可配成5-10mmol/L并分装,-20℃贮存。
一般反应中每种dNTP的终浓度为20-200μmol/L。
理论上4种dNTP各20μmol/L,足以在100μl反应中合成2.6μg的DNA。
当dNTP终浓度大于50mmol/L时可抑制TaqDNA聚合酶的活性.4种dNTP的浓度应该相等,以减少合成中由于某种dNTP的不足出现的错误掺入。
3.Mg2+:
Mg2+浓度对TaqDNA聚合酶影响很大,它可影响酶的活性和真实性,影响引物退火和解链温度,影响产物的特异性以及引物二聚体的形成等。
通常Mg2+浓度范围为0.5-2mmol/L.对于一种新的PCR反应,可以用0.1-5mmol/L的递增浓度的Mg2+进行预备实验,选出最适的Mg2+浓度。
在PCR反应混合物中,应尽量减少有高浓度的带负电荷的基团,例如磷酸基团或EDTA等可能影响Mg2+离子浓度的物质,以保证最适Mg2+浓度。
4.模板:
PCR反应必须以DNA为模板进行扩增,模板DNA可以是单链分子,也可以是双链分子,可以是线状分子,也可以是环状分子(线状分子比环状分子的扩增效果稍好).就模板DNA而言,影响PCR的主要因素是模板的数量和纯度.一般反应中的模板数量为102-105个拷贝,对于单拷贝基因,这需要0.1μg的人基因组DNA,10ng的酵母DNA,1ng的大肠杆菌DNA.扩增多拷贝序列时,用量更少.灵敏的PCR可从一个细胞,一根头发,一个孢子或一个精子提取的DNA中分析目的序列.模板量过多则可能增加非特异性产物.DNA中的杂质也会影响PCR的效率。
5.TaqDNA聚合酶:
一般TaqDNA聚合酶活性半衰期为92.5℃130min,95℃40min,97℃5min.现在人们又发现许多新的耐热的DNA聚合酶,这些酶的活性在高温下活性可维持更长时间.TaqDNA聚合酶的酶活性单位定义为74℃下,30min,掺入10nmol/LdNTP到核酸中所需的酶量.TaqDNA聚合酶的一个致命弱点是它的出错率,一般PCR中出错率为2×10-4核苷酸/每轮循环,在利用PCR克隆和进行序列分析时尤应注意.在100μlPCR反应中,1.5-2单位的TaqDNA聚合酶就足以进行30轮循环.所用的酶量可根据DNA、引物及其它因素的变化进行适当的增减.酶量过多会使产物非特异性增加,过少则使产量降低.反应结束后,如果需要利用这些产物进行下一步实验,需要预先灭活TaqDNA聚合酶,灭活TaqDNA聚合酶的方法有:
(1)PCR产物经酚:
氯仿抽提,乙醇沉淀。
(2)加入10mmol/L的EDTA螯合Mg2+。
(3)99-100℃加热10min.目前已有直接纯化PCR产物的Kit可用。
6.反应缓冲液:
反应缓冲液一般含10-50mmol/LTris·Cl(20℃下pH8.3-8.8),50mmol/LKCl和适当浓度的Mg2+.Tris·Cl在20℃时pH为8.3-8.8,但在实际PCR反应中,p
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