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模式生物在分子细胞生物学研究中应用
第六章模式生物在分子细胞生物学研究中应用
对于生命科学研究来说,如何寻找到一个理想的研究系统是其关键所在。
回顾近代生命科学研究的历史我们不难发现,在许多划时代的突破性科学成就背后总有一些模式物种的默默奉献:
假若不是选择果蝇这一绝好的模式动物,摩尔根又怎能揭开“基因的连锁与互换”这一经典遗传学的第三大规律;假若没有利用非洲爪蟾所进行的体细胞核移植开创性工作,又怎会有今天克隆羊、克隆牛、克隆鼠的诞生;假若不是有酵母、海胆的“帮助”,又怎会有今天对细胞周期调控机制的了解;假若不是线虫的“贡献”,又怎会有对细胞凋亡机制的认识……类似的例子不胜枚举。
事实上,各种各样的模式动物与植物已经或正在走进生命科学研究的阵地,常见的如非细胞生物T4病毒,原核生物大肠杆菌,真核生物酵母、果蝇、小鼠、线虫、海胆、非洲爪蟾、斑马鱼、水螅等,植物如玉米、拟南芥、豌豆等,它们都因其所具有的独特的生物学特性而成为各种研究的模型,且都已被研究的相对比较透彻。
所有这些具一定代表性的生物常被统称为模式生物(modelorganism)。
模式生物与实验生物(experimentalorganism)并非一回事。
能成为模式生物的实验生物通通常具有易于培养、操作简单、生长繁殖快等特点,且均具有一些独特的生物学特性,适宜于进行一些具有一定广泛性和代表性的研究工作。
本章将就一些有代表性的模式生物的生物学特性及其在分子细胞生物学研究中的作用进行探讨。
第一节酵母
一、概论
酵母为单细胞真菌,属半子囊菌亚纲(Hemiascomycetes)内孢霉目(Endomycetales)酵母菌科(Saccharomycetaceae)。
作为模式生物的酵母主要有两种:
一种是酿酒酵母(Saccharomycescerevisia),其无性生殖方式为芽殖,故又称芽殖酵母(buddingyeast);另一种是粟酒裂殖酵母(Schizosaccharomycspombe),其无性生殖方式为裂殖,故又称裂殖酵母(fissionyeast)。
这两种酵母虽然同属于子囊真菌,均为模式生物,但二者在进化上的亲缘关系较远,在许多方面并不相同。
例如,粟酒裂殖酵母营养体为单倍体,而酿酒酵母营养体则为二倍体,这使得二者的生活史刚好相反。
酵母作为一种模式生物在实验系统研究方面具有许多内在的优势。
(1)酵母易于培养和操作、增殖快,是研究真核生物生命活动的首选模式生物,有真核生物中的“大肠杆菌”之称。
(2)酵母能在单倍体和二倍体的状态下稳定均能生长,并能在实验条件下较为方便地控制单倍体和二倍体之间的相互转换。
单倍体细胞可以是两个交配型中的任何一个,分别被称为a和α,二倍体细胞(a/α)由a细胞和α细胞融合而成,并可进一步通过有丝分裂进行无限期增殖。
这对其基因功能的研究十分有利,如在单倍体状态下,只需一次基因替换,就能得到某个特定基因缺失的酵母株;而对于一些缺失后致死的基因,人们可以在二倍体菌株中进行基因替换,然后通过孢子筛选,获得带有基因缺失的单倍体菌株。
(3)酵母DNA只存在于细胞核中,酵母菌染色体功能的支持主要由复制起点(ARS元件)、着丝粒(CEN元件)和端粒(telomer)构成,利用这些元件、克隆化的酵母选择基因能构建出既可在酵母菌又可在和大肠杆菌中进行稳定的自主复制与表达的穿梭质粒,构建出更适合真核生物基因表达的载体系统,甚至还可利用酵母染色体的这些元件构建出更大、更为有效的大片段序列克隆系统,如酵母人工染色体(YAC)。
同时,酵母菌还具有同时兼容几种不同质粒(带有酵母固有质粒2μm复制子)的特点,这与大肠杆菌明显不同。
(4)酵母的生命周期很适合经典的遗传学分析,使得在酵母条染色体上构建精细的遗传图谱成为可能。
更重要的是,目前已发展了一些非常有效的技术使得酵母基因组中约6000个基因中的任何一个基因均能被突变的等位基因取代,甚至从基因组中完全缺失,这种方法具有很高的效率和准确性。
(5)酵母的基因组很小,比如酿酒酵母的单倍体就含有16条200-2200kb的线性染色体,DNA容量仅为大肠杆菌的3.5倍。
通过完整的基因组测序其基因组大小为12068kb,编码5885个专一性蛋白质的开放阅读框。
而裂殖酵母的基因组大小尽管与酿酒酵母相近,但仅分布在3条染色体上,编码4824个蛋白质。
这意味着在酵母基因组中平均每隔2kb就存在一个编码蛋白质的基因,即整个基因组有72%的核苷酸顺序由开放阅读框组成。
这说明酿酒酵母基因要比其它高等真核生物基因排列紧密。
如在人类基因组中,大约平均每隔30kb或更多的碱基才能发现一个编码蛋白质的基因。
酵母基因组的紧密性是因为基因间隔区较短与基因中内含子稀少。
酵母基因组的开放阅读框平均长度为483个密码子,最长的是位于XII号染色体上的一个功能未知的开放阅读框(4910个密码子)。
此外,酿酒酵母基因组中还包含有大约140个编码rRNA的基因,排列在XII号染色体的长末端;40个编码snRNA(smallnuclearRNA)的基因,散布于16条染色体;属于43个家族的275个tRNA基因也广泛分布于基因组中。
表6-1提供了酿酒酵母基因在各染色体上分布的大致情况。
表6-1 酿酒酵母染色体简况
染色体编号
染色体长度(bp)
基因数目
tRNA基因数目
I
2.3×104
89
4
II
807188
410
13
III
3.15×105
182
10
IV
1531974
796
27
V
569202
271
13
VI
2.7×105
129
10
VII
1090936
572
33
VIII
5.61×105
269
11
IX
439886
221
10
X
745442
379
24
XI
666448
331
16
XII
1078171
534
22
XIII
924430
459
21
XIV
784328
419
15
XV
1092283
560
20
XVI
948061
487
17
二、酵母与细胞周期研究
真核生物的细胞周期是一个严格按照G1→S→G2→M循环运转的增殖过程。
酿酒酵母和裂殖酵母的细胞周期存在着一定的差异:
(1)由于酿酒酵母的有丝分裂为核内分裂方式,其纺锤体常在S期就开始形成,故而其细胞周期几乎是缺少G2期或被认为是S期与G2期重叠,而裂殖酵母却具有完整的细胞周期。
(2)酿酒酵母染色质在间期凝集的程度亦较,但裂殖酵母的染色质在间期的可被压缩大约2000倍。
(3)酿酒酵母细胞周期中的G1期所占时间最长,是研究真核细胞细胞周期由G1→S期过渡的好模型,而裂殖酵母的G2期在细胞周期中所占的比例也最大,是研究真核细胞细胞周期由G2→M期过渡的好模型极佳模型。
在20世纪60年代末,美国西雅图FredHutchinson癌症研究中心的利兰·哈特韦尔(LelandHartwell)采用遗传学方法,用酿酒酵母作为实验对象研究细胞周期。
20世纪70年代,他通过温度敏感突变技术筛选出一些突变酵母细胞,这些突变的酵母细胞常停滞在特定的细胞周期时相,通过对相关突变的分析从而确定缺陷基因所编码的蛋白质在细胞周期调控中的作用。
利用这种方法,他成功地分离出上百个涉及细胞周期调控的基因,并将它们命名为细胞周期分裂基因(cdc)。
继哈特韦尔之后,英国伦敦帝国癌症研究基金会(ImperialCancerResearchFund,ICRF)的保罗·纳斯(PaulNurse)和蒂莫西·亨特(R.TimothyHunt),分别利用裂殖酵母和海胆发现了调节细胞周期的关键分子细胞周期素蛋白依赖性激酶(CDKs)以及调节CDKs功能的细胞周期素(cyclin)。
纳斯从裂殖酵母中筛选出了调控细胞周期进程的关键基因cdc2,并且发现cdc2和酿酒酵母的cdc28具有69%的同源性,均编码一个34kDa的蛋白激酶(p34cdc2),其功能可以相互代替,参与G1/S和G2/M转换的调控。
同时,他还证实了人的cdc2与酿酒酵母cdc28具有64.5%的同源性。
因此,纳斯认为以cdc2(cdc28)对细胞周期的调控机制在真核生物中具有普遍性。
并于1990年提出了“M期启动调节的普遍机制”,认为“从酵母到海洋无脊椎动物直至人类的所有真核细胞中都存在一个共同的分子机制来调节M期的启动”。
cdc2与cdc28基因的编码产物CDC2和CDC28就是最早发现的CDKs。
而蒂莫西·亨特通过用海胆做模型发现了蛋白质的周期性降解,这种周期性降解的蛋白就是细胞周期素,并阐明周期素的降解是细胞周期中一种重要的普遍控制机制。
目前,从酵母中所鉴定出来的细胞周期相关基因已达已达200多个,其中许多都在人类和哺乳类动物中找到了同源基因,而仅在人体内就发现了十余种不同的周期素,并较为成功地揭示了细胞周期的调控机制
三、酵母双杂交系统(yeasttwo-hybridsystem)
细胞生命活动中的许多过程诸如酶催化代谢反应、信号转导、蛋白质的修饰与加工、蛋白质的转运等都表现为一种蛋白质与蛋白质间的相互作用。
传统的免疫印迹、Westernblot等方法很难满足对蛋白质分子之间相互作用这一动态过程的研究需要。
在这样的需求下,FieldsS和SongO于1989年创立了一种非常简便而有效的研究蛋白质相互作用的方法——酵母双杂交系统,它最突出的特点是可以在酵母这种生长迅速且易操作的体系中研究真核细胞的蛋白质-蛋白质相互作用,而且还可通过cDNA文库筛选直接找到与未知蛋白质相互作用蛋白的基因。
酵母双杂交系统一经问世,便极大地加速了人们对蛋白质功能和生命活动分子机制的认识进程。
(一)酵母双杂交系统的原理
酵母双杂交系统的理论基础源自20世纪80年代末对真核转录因子特性的认识。
研究证实,很多真核基因的表达通常处于本底水平或不表达,在有转录激活蛋白的诱导的情况下才会出现高水平表达。
通常,这种转录因子均具有两个相互独立的功能:
与特异性DNA序列(启动子)结合的功能和引导RNA聚合酶激活转录的功能。
同时更重要的发现是:
这两种功能分别由两个独立的功能区域负责,即DNA结合结构域(DNA-bindingdomain,DNA-BD)和转录激活结构域(activationdomain,AD)。
通常,前者负责结合基因上游顺式激活序列(upstreamactivationsequence,UAS),后者则负责引导RNA聚合酶复合体激活基因转录。
DNA-BD和AD对激活转录均是必不可少的,在理论上,任何一个AD都可以与任何一个DNA-BD结合并激活转录,即杂合的DNA-BD和AD可以组成一个具有功能的转录激活蛋白。
不仅如此,只要DNA-BD和AD能够通过一定的方式在空间上足够的靠近(例如借助其他蛋白质的帮助使其足够靠近),这样,即使它们之间没有共价结合也同样可以激活转录。
目前最成熟也最常用的DNA-BD和AD均来自酵母的GAL4转录因子(它们分别定位于1-147位和768-881位氨基酸)。
第一步,通过DNA重组技术设计两个杂交蛋白:
将编码已知蛋白质(常称为诱饵蛋白,baitprotein)的基因与编码BD的序列融合并在酵母中表达产生融合蛋白BD-Bait,同时将编码末知蛋白(该蛋白常称为捕获蛋白或猎物蛋白,preyprotein)的基因与编码AD的序列融合并在酵母中表达产生另一融合蛋白AD-Prey。
第二步,将表达上述两个杂交蛋白的载体通过共同转移到一特别的酵母细胞株中去。
该酵母中的gal4基因是缺失的,但却有一个受GAL4转录因子激活的报告基因(一般是β-半乳糖苷酶基因。
这样,如果诱饵蛋白和猎物蛋白能够相互作用的话,就会使DNA-BD和AD发生,从而激活报导基因转录。
如果诱饵蛋白和猎物蛋白不能发生相互作用,则DNA-BD和AD不能结合的话,报导基因的转录就不能被激活。
与许多传统的方法相比,酵母双杂交系统具有重大的突破:
(1)整个操作均在体内进行,避免了体外条件下所出现的许多不利因素的影响;
(2)灵敏度高,尤其是在检测蛋白质之间弱相互作用时更为突出;(3)勿需进行蛋白的纯化等操作,整个过程较为简单;(4)所使用诱饵蛋白既可以是完整蛋白,也可以小到仅为一个功能结构域。
图6-1 酵母双杂交系统的原理
(二)酵母双杂交系统的应用
酵母双杂交系统现已被广泛应用于包括核蛋白、胞质蛋白、膜蛋白、线粒体蛋白、胞外蛋白等各种蛋白质在内的的功能研究中。
根据研究目的之不同常被用于:
(1)检测已知的蛋白之间是否存在相互作用;
(2)寻找蛋白质发生相互作用所必需的功能结构域(domain)或基序(motif);(3)寻找可与已知蛋白结合的未知蛋白;(4)确定蛋白或多肽类药物的作用机理。
(三)酵母双杂交系统的发展
大量未知的、重要的蛋白质之间的相互作用已随着酵母双杂交系统这个方法的广泛应用而被揭示。
同时近年来为了适应更广泛的用途,在原有酵母双杂交系统基础上发展了大量的衍生系统:
如用于研究蛋白质-DNA的相互作用的单杂交系统(one-hybridsystem);用于研究解离或破坏蛋白质相互作用因子的逆向双杂交系统(reversetwo-hybridsystem);用于研究蛋白质-蛋白与RNA、多肽、小配体等不同种类分子的相互作用的三杂交系统(three-hybridsystem),这种三杂交系统既利用了双杂交系统中的两个融合蛋白AD-Prey和BD-Bait,同时这两个融合蛋白的相互作用必须借助于第三种分子,而这第三种分子可以是蛋白质、小分子多肽和核酸,因而就产生了蛋白质三杂交系统、激酶三杂交系统、小配体三杂交系统、RNA三杂交系统等类型。
此外,还出现了为研究膜蛋白的相互作用而改进的SOS富集系统(SOSrecruitmentsystem,SRS)。
在该系统中,蛋白质之间的相互作用被人为限制在酵母细胞膜上。
四、酵母与基因功能研究
酵母作为高等真核生物特别是人类基因组研究的模式生物,其重要作用还体现在:
当人们发现了一个功能未知的人类新基因时,可以通过到相关酵母基因组数据库中检索与之同源的功能已知的酵母基因,并获得其功能方面的相关信息,从而加快对人类基因的功能研究。
有许多涉及遗传性疾病的基因均与酵母基因具有很高的同源性,研究这些基因编码的蛋白质的生理功能以及它们与其它蛋白质之间的相互作用将有助于加深对这些遗传性疾病的了解。
例如,早在1970年Cleaver等就曾报道,着色性干皮病和紫外线敏感的酵母突变体都与缺乏核苷酸切除修复途径(nucleotideexcisionrepair,NER)有关。
1990年,人们就克隆了着色性干皮病相关基因XPD,并发现它与酵母NER途径的RAD3基因有极高的同源性(参见表13-14)。
Francoise等研究了170多个通过功能克隆得到的人类基因,发现它们中有42%与酵母基因具有明显的同源性,这些人类基因的编码产物大部分与信号转导途径、膜运输或者DNA合成与修复有关,而那些与酵母基因没有明显同源性的人类基因主要编码一些膜受体、血液或免疫系统组分,或人类特殊代谢途径中某些重要的酶和蛋白质。
五、几个与酵母有关的网站
http:
//www.yeastgenome.org/
http:
//cmgm.stanford.edu/pbrown/explore/
http:
//cgsigma.cshl.org/jian/
http:
//genome-www.stanford.edu/Saccharomyces/
第二节果蝇
一、概述
果蝇(fruitfly或vinegarfly)是一种广泛存在于全球温带及热带气候区,以腐烂水果为主食的一种昆虫。
果蝇的生活周期短,繁殖快,子代多。
一般在250C下由卵发育成成虫大约需要11天,在180C则所需时间加倍,在160C则需要3倍的时间。
此外,果蝇的饲养也极为简单,而且还有大量易于辨认的体外表型,适合大规模饲养。
在全球所发现的果蝇的种类大约有1000种之多,但被用于科学研究作为模式生物的主要是黑腹果蝇(drosophilamelanogaster)。
1998年,Celera公司开始对果蝇基因组进行研究,在不到两年的时间里破译了果蝇的序列,并于2000年3月宣布了基因组全序列为180Mb,包括有13601个基因,其中一半的基因功能还没有搞清楚,有1600个碱基跨度区仍未能完全测序。
果蝇基因组的完成使人们确信“全基因组鸟枪法”(wholegenomeshotgun)和“片断处理法”的结合将成为解译大基因组最有效的方法。
另外,Celera在果蝇基因组计划中发现了几千条新基因,这些新基因与一些重要蛋白例如激酶、离子通道、分泌蛋白、G-蛋白受体等有关。
这些重要蛋白在研究新的医疗方法和杀虫剂方面都有极重要的价值。
二、模式生物果蝇的应用
自从摩尔根使果蝇成为经典遗传学的主要模式生物以来已有100年了。
果蝇作为一种重要的模式生物在生物学研究中占有重要位置,其它最大的优势在于基因组已研究清楚,而且易于进行遗传操作,有较丰富的行为,它作为研究遗传、发育、神经系统退行性疾病、学习记忆和类认知行为的模式生物亦受到了广泛重视,被誉为“遗传学与分子发育生物学国王”。
对果蝇的研究也分别于1933年、1946年、1995年三度获得诺贝尔奖。
(一)果蝇与基因定位研究
黑腹果蝇是经典遗传学家喜欢的实验材料。
当年摩尔根就是利用果蝇才发现了“基因的连锁与互换”定律。
果蝇不仅饲养容易、繁殖快,有着很多很容易鉴别的表型,是典型的“雌雄异体”生物,雌雄容易识别,可以进行各种有目的的交配,得到各种重组性状,进而揭示基因的位置。
“遗传作图”的建立在很多方面是采用了研究果蝇得到的经验。
果蝇只有三对染色体。
更有趣的是,果蝇幼虫的唾液腺的染色体很大,大到人的肉眼就可以看到,上面还有有规律的条纹,可以把一个基因的位点准确定位到某一条纹上。
(二)果蝇与基因功能鉴定
在经典的遗传学研究中,基因的功能主要是通过反向遗传学的方法而确定的。
即先使某个基因产生突变,通过分析基因突变后的异常表型从而再反推正常基因的正常表型。
传统的基因诱变主要是通过物理和化学诱变的方法而实现的。
但自从发现果蝇中存在转座子(如P因子)后,通过利用独特的P因子插入诱变法,实现了大规模诱发单基因突变并进行基因功能研究。
P因子是果蝇中的一种自主转座因子,由转座基因和转座酶两个基因组成。
当转座基因和转座酶基因两者都存在时,P因子转座,从而引起插入位点及其附近的基因产生突变;但如果转座酶基因缺失,转座便不能发生。
根据上述理论依据,因此只要建立两个品系,其中一个含有正常的转座基因,而转座酶基因异常;另一个含有正常的转座酶基因,而转座基因异常,则在该品系内,转座便不能发生。
但若让两个品系杂交,则F1代可以发生转座,并大规模地引起插入位点的单基因产生突变。
由于P因子的插入位点可以通过染色体原位杂交的方法检测到,而P因子插入位点两侧的基因又可以通过质粒获救的方法克隆出来,因此果蝇的P因子诱变与其它生物只能通过化学诱变的方法相比,不仅诱变效率高,而且所诱发的主要是单基因突变,并且诱变基因容易分离和克隆,使后续的研究更加方便和容易。
基因组测序的结果显示,人类基因与果蝇的同源性高达80%,大多数人类基因为昆虫同等物的复制(根据HollandPWH与MiklosGL以及RubinGM的研究)。
人类和果蝇之间同源性,不仅仅只表现在简单的结构域和蛋白质的保守,实际上,某些复合物和多步骤的代谢途径也是保守的。
而果蝇与人类基因的这种同源性必然使得对人类基因功能的解析更为快捷。
(三)与人类疾病
根据美国能源部的相关统计,利用模式生物果蝇,已有100多种人类疾病的致病基因被鉴定出来。
而我国学者,湖南师范大学生命科学学院吴秀山博士所率领的的课题组,利用P因子插入诱变法已在果蝇体内筛选出200多个导致心脏畸形的突变系和100多个周围神经突变系,然后初步克隆和鉴定了50个有关人类心脏发育的候选基因,该成果已申请了7项国家发明专利。
中科院上海生化所研究员费俭等人在实验鼠身上发现,当神经系统负责传递抑制性信号的GABA转运蛋白过度表达时,小鼠的学习记忆力就变得差劲,并会诱发癫痫等疾病,为研制人为调控基因的药物提供了有益启示。
三、几个与模式生物果蝇有关的网站
http:
//www.hanfbuch.de/datenbank/schaedling.htm
http:
//www.fruitfly.org/
http:
//www.tigr.org/tigr-scripts/tgi/T_index.cgi?
species=drosoph
http:
//www.sciencemag.org/feature/plus/sfg/special/special.html#fly
http:
//sdb.bio.purdue.edu/fly/aimain/1aahome.htm
http:
//sdb.bio.purdue.edu/dbcinema/kaufman/kaufman.html
http:
//flyview.uni-muenster.de/
第三节小鼠
一、概述
小鼠属脊椎动物门,哺乳纲,啮齿目,鼠科,小鼠属动物。
小鼠的世代短,成熟早,繁殖很强,属全年、多发情动物,一年可产仔胎数6-10胎,每胎产仔数8-15头,且具有体型小、易于管理等特点。
在进化上,小鼠与人类的距离较近,约有1亿年。
其解剖学结构、发育过程、生化代谢途径都与人接近,为人类疾病的克隆提供了极佳的实验材料。
作为经典的医学实验动物,小鼠已经对医学诸多领域的研究作出了卓越贡献。
二、小鼠成为模式生物的历程
从第一次被作为实验材料,到基因组测序的完成,小鼠在遗传学研究中已经有上百年的历史了。
作为十分重要的模式生物之一,小鼠不仅为基础生物学研究做出了一系列重要贡献,更是在人类认识自身,战胜疾病的进程中功不可没。
回顾历史,我们不难发现,小鼠成为重要的模式生物是偶然中的必然。
小鼠成为模式生物大概经历了以下几个阶段。
(一)属鼠的出现
鼠属出现在地球上大约是在6000万年前,。
(二)宠物鼠的出现
19世纪,由于宠物爱好者在19世纪选择性的饲养家鼠,从而逐渐出现了一些具有各种可爱颜色皮毛的宠物鼠。
(三)从宠物鼠到实验鼠
1897年,生物学家WilliamHaacke发现白鼠和杂色鼠杂交会产生重组表型。
他注意到所出生的第一代老鼠全部是杂色的,但到了第二代却出现了重组表型:
既有白色鼠又有杂色鼠。
WilliamHaacke观察到的现象实际上已经触及了孟德尔遗传学,但却因为没有严格的实验数据,使得他的报告受到了一些争议,这项重要的工作最终也被忽视了。
20世纪初,科学家们也开始意识到可以用这些不同颜色的老鼠进行一些遗传学实验,这些宠物鼠成了实验鼠的“先驱”。
1902年,哈佛大学的WilliamErnestCastle利用以一位名叫AbbieLathrop的退休教师所饲养的宠物鼠为实验材料,通过对这些老鼠的毛色进行观察,以验证孟德尔定律的正确性。
1905年,法国遗传学家LucienClaudeCuéno通过对黄白相间的杂色鼠进行研究发现,两个携带黄色皮毛基因的老鼠之间交配,其子代老鼠中黄色老鼠和白色老鼠的数量比总是2:
1。
Cuénot据此认为,黄色基因对白色基因来说是显性的。
但是这个数据似乎并不完全符合孟德尔
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