RAW2647小鼠巨噬细胞protocol.docx
- 文档编号:9833908
- 上传时间:2023-02-06
- 格式:DOCX
- 页数:24
- 大小:1.12MB
RAW2647小鼠巨噬细胞protocol.docx
《RAW2647小鼠巨噬细胞protocol.docx》由会员分享,可在线阅读,更多相关《RAW2647小鼠巨噬细胞protocol.docx(24页珍藏版)》请在冰豆网上搜索。
RAW2647小鼠巨噬细胞protocol
RAW264、7细胞株得相关信息
ATCC:
美国模式培养物集存库(Americantypeculturecollection)得简写
收到冷冻管细胞得处理方式
1、 收到细胞株包裹时,请检查细胞株冷冻管就是否有解冻情形,若有请立即通知。
细胞株请尽速开始培养,或立即冷冻保存(置于–70℃,隔夜后,移到液氮)。
2、收到T25flask细胞得处理方式
于寄送过程中,为避免起泡造成细胞脱落死亡,T25flask均加满培养基。
2、1、 检查flask外观,并于显微镜下观察细胞生长状况与有无污染现象,若有任何问题,不要打开盖子,请立即通知细胞实验室。
2、2、 将原封之T25flask静置于37℃,5% CO2培养箱中,使细胞回温至37℃,并让运送过程中少数脱落得细胞可再附着生长.
2、3、 隔天后,于无菌操作箱内取出flask内之培养基,(取出之培养基可以再使用),仅留约5—10ml 培养基于flask内,依一般培养方式再将细胞置入培养箱中,或细胞已长满盘,则将细胞做传代培养。
RAW264、7细胞株得CellCulture
一、RAW264、7细胞培养得特点
1、RAW264、7细胞一般为圆形或椭圆形,功能活跃时,可呈多突形。
细胞核为圆形或椭圆形,染色较深。
贴壁特别牢固。
2、RAW264、7具有很强得吞噬能力,当吞噬抗原后,细胞会释放趋化因子,进一步促进细胞伸出伪足,增强粘附攀爬能力。
细胞吞噬抗原过多、培养环境恶劣都会促进该细胞呈现梭形、长梭形,镜下会瞧到具有细长伪足得小细胞被类似上皮得梭形大细胞取代。
3、每次传代都很难消化下来.用力过大则对细胞损伤较大,这种细胞传代时接种密度要大,否则容易使巨噬细胞向终末细胞分化,细胞变成长形,并且不能回复,这就是培养这种细胞时最需要注意得问题。
4、对于RAW264、7细胞她得声场时喜欢结伴。
正常生长状态应该就是一小片一小片得生长,片片之间不连接,等到长到更多更密得时候会连成大片,并且会叠加成层。
所以,要很好地控制好细胞得生长速度,不要等到叠加成层得时候再传代。
5、RAW264、7细胞传代后贴壁时间较短,半小时就能贴很多,刚贴壁就是细胞呈圆形,折光度很好,镜下观察如小珍珠状一个个地散落于瓶底面。
生长一段时间后,部分细胞会变成类似四角形,伸出伪足之类得.这个时候就就是提醒您注意传代了,这部分细胞如再不传代,很容易就老化掉.
二、RAW264、7细胞传代
1)将培养瓶内旧得培养液弃掉,然后用D—Hanks液洗两次,(一定要洗干净,以免影响胰酶得消化作用)
2)加入0、25%胰酶—EDTA消化,25cm培养瓶加0、4ml, 37度消化5min,镜下瞧到细胞变圆,间隙增大.(值得注意得就是该细胞对机械损伤比较敏感)
3)立即加含10%FCS得培养液终止消化,用细胞刮刀轻刮,注意,这时候用吸管吹不下来,但就是刮刀却很容易刮下来,而且对细胞得损伤极小
4)离心,弃上清,加新得培养液(10%FCS),小心吹匀,分装入新得培养瓶
三、RAW264、7细胞冻存及复苏
(一)细胞冻存
1、配制冻存培养液;(通用得为培养基:
血清:
DMSO=7:
2:
1,但其中得血清可进行调整,如上面得仁兄用得4:
5:
1,比例过高)
2、取对数生长期得细胞(冻存前一天换液),用胰蛋白酶把单层生长得细胞消化下来,悬浮生长得细胞则直接将细胞移至15ml离心管中;
3、离心1000rpm,5min;
4、去除胰蛋白酶及旧得培养液,加入适量配制好得冻存培养液,用吸管轻轻吹打使细胞均匀,计数,调节冻存液中细胞得最终密度为5×106/ml~1×107/ml;
5、将细胞分装入冻存管中,每管1~1、5ml(不超过冻存管容量得80%);
6、在冻存管上标明细胞得名称,冻存时间及操作者;
7、冻存:
标准得冻存程序为降温速率—1~-2℃/min;当温度达-25℃以下时,可增至—5℃~—10℃/min;到—100℃时,则可迅速浸入液氮中。
也可将装有细胞得冻存管放入-20℃冰箱2h,然后放入-70℃冰箱中过夜,取出冻存管,移入液氮容器内.(具体操作为4°C20min,—20°C30min,-70℃过夜,转入液氮中)
(二)细胞复苏
1、从液氮容器中取出冻存管,直接浸入37℃温水中,并不时摇动令其尽快融化。
(1min以内溶解完毕,不能将口进入水面下)
2、从37℃水浴中取出冻存管,打开盖子,用吸管吸出细胞悬液,加到离心管并滴加10倍以上培养液,混匀;
3、离心,1000rpm,5min;
4、 弃去上清液,加入含10%小牛血清培养液重悬细胞,计数,调整细胞密度,接种培养瓶,37℃培养箱静置培养;(复苏时细胞密度稍大,可提高复苏效率)
5、 次日更换一次培养液,继续培养.(可更换一半培养液,避免跨度太大,影响细胞状态)
(三)接种
四、RAW264、7细胞形态不好时得处理方法
1、倒掉旧得培养基,加入3ml新得培养基(有无血清得都可)洗涤一次,用滴管吸走,然后再加入3ml得培养基,进行预吹打,控制吹打力度,轻轻地大概沿着瓶底过一遍,然后吸走。
这时侯再开始正式得消化、吹打。
ﻫ 2、把吹打下来得细胞悬液加入到新得培养瓶内,培养瓶事先加入培养基,放入培养箱内培养,按时间点观察细胞贴壁情况。
10分钟观察一次,20分钟,30分钟观察一次.选择一个时间点,已经有部分细胞贴壁得情况下,重新置于洁净台,底面朝上迅速倒出其中得培养基,加入3ml新培养基再轻轻洗一次。
然后加入完全培养基培养.后续观察细胞生长情况以及形态。
我称之为“二传”。
3、如果一次效果还不理想,可重复多次.直到找到细胞完美形态。
其中要注意,结合细胞喜欢得生长情况。
喜欢多一点数量长得好得细胞就等贴壁细胞比较多点得时候再传。
反之亦然。
不明之处:
培养之前,一切与细胞接触得玻璃器皿与器具都要进行过去热源处理。
(200-250℃烘烤4—6h)?
?
RAW264、7细胞株CellCulture得材料
(一)仪器
1、净化工作台
2、离心机
3、恒温水浴箱
4、冰箱(4℃、-20℃、—70℃)
5、 倒置相差显微镜
6、 培养箱
7、液氮冰箱
(二)玻璃器皿
1、吸管(弯头、直头)
2、培养瓶
3、 玻璃瓶(250ml、100ml)
4、废液缸
(三)塑料器皿
1、吸头
2、枪头
3、胶塞
4、移液管(10ml)
5、 15ml离心管
6、冻存管(1~2ml)
(四)其她物品
1、微量加样枪
2、红血球计数板
3、记号笔
4、医用橡皮膏
5、 移液枪
(五)试剂
1、D—Hanks液
2、 胎牛血清
3、培养液
4、 双抗(青霉素、链霉素)
5、 胰蛋白酶(0、25%)
6、7、4%NaHCO3
7、DMSO(分析纯)或无色新鲜甘油
附1、 胎牛血清品牌整理
第一类,最高级别,就是专门用于干细胞得特级胎牛血清
1、Hyclone得特级胎牛血清
目前,性能最好得血清,还就是要说说Hyclone得特级胎牛血清,货号就是SH30070、03,它就是Hyclone得“招牌菜”。
ﻫHyclone特级胎牛血清(DefinedFBS),货号SH30070,就是世界上唯一经过40纳米过滤得顶级胎牛血清,极佳得促细胞生长作用及产品稳定性。
内毒素含量≤10EU/ml,血红蛋白含量≤10mg/dl。
此血清可以广泛用于各种细胞培养,包含任何干细胞系得培养。
2、Gibco得特级胎牛血清ﻫ稍次一点得就是Gibco公司在美国原装生产得特级胎牛血清,这款血清,货号就是16000-044,就是100nm过滤3次,内毒素与血红蛋白含量都可以与Hyclone得SH30070、03相媲美.也可以用于培养大部分得干细胞系。
同样就是美国来源,所以渠道特殊。
3、TCB得特级胎牛血清ﻫTCB(Tissue CultureBiologicals)公司作为一家生物行业类得著名供应商,成立于1978年,大部分血清得采集与加工都在加利福尼亚。
每一批得原材料都经过严格筛选,所有得产品都在FDA认证得cGMP车间进行!
ﻫ4、Bioind特优级胎牛血清ﻫ血源来自北美与澳大利亚BioInd公司得生产完全符合GMP得要求,并通过ISO9000:
2001与ISO 13485:
2003质量认证。
以安全,稳定,高效为原则得BioInd公司,所有得产品质量均完全符合国际标准。
Biological Industries主营细胞培养类产品,BioInd工厂加工得胎牛血清均符合USDA标准及欧洲标准血清。
根据美国农业部标准,原始血清均采自未发生疯牛病(BSE)与口蹄疫(FMD)疫情得国家。
Biological Industries三步滤菌处理法,最后得过滤步骤为连续通过三个100纳米得滤膜。
血清生产得洁净级别为100级。
所有分装工作台都通过高效微粒空气过滤器过滤,并保持正压分装环境要对总微粒、悬浮微粒数与压力进行监控。
分装之后,终产品迅速-20度冻存,并隔离,直到所有得质量控制检测完成。
第二类,优等胎牛血清
1、Hyclone得加拿大优等胎牛血清ﻫ性价比最高得就是Hyclone加拿大优等胎牛血清(CharacterizendFBS)SH30396、03血清采自加拿大,由hyclone公司总部得员工采集加工,采集方法,加工过程,检定标准与美国原产优等胎牛血清完全一致,市场价格低于美国原产得。
经过3次100nm过滤,内毒素含量≤25EU/ml,血红蛋白含量≤25mg/dl
2、Hyclone得南美优级胎牛血清ﻫ大体与加拿大得优等血清就是一样得,级别也非常相似,货号就是sv30087、02,该胎牛血清来源于南美洲,以封闭得心脏穿刺方式采集,产品经3次100nm 过滤,经严格检测确保无支原体,细菌病毒检测依据美国药典(USP)与美国联邦法规第九篇(9CFR),内毒素含量≤10EU/ml,血红蛋白含量≤20mg/dl,完全符合美国HyClone®优等胎牛血清得检测标准.ﻫ3、Gibco得澳大利亚胎牛血清ﻫ情况与Hyclone得澳大利亚胎牛血清差不多,市场价也就是3200元/500ml左右。
这一级别得血清,也能用于干细胞培养,可就是,不象特级胎牛血清那么优秀。
因为,此胎牛血清属于澳大利亚生产得,不在疫区,可以正常报关进口,目前没有受到任何影响,所以,就目前而言,算就是最好得胎牛血清了,有不少客户都此血清来培养干细胞,效果还就是比较不错。
ﻫ4、TCB得优级胎牛血清
情况与Hyclone得澳大利亚胎牛血清差不多,市场价也就是2300元/500ml左右。
这一级别得血清,也能用于干细胞培养,可就是,不象特级胎牛血清那么优秀。
第三类,一般级别得进口胎牛血清ﻫ1、Hyclone得南美胎牛血清ﻫ目前,市场上用得最多得Hyclone血清就是南美胎牛血清(FBS)SV30087,此血清采自南美,在国内(兰州)过滤并测试检验,经三次100纳米过滤,根据中国商标法得规定标贴中文标签,内毒素含量≤10EU/ml,血红蛋白含量≤20mg/d。
ﻫ此血清广泛用于各种肿瘤细胞得培养,还没有资料记载能够用于干细胞,也听说有少数人用于干细胞培养得,不过,因为本身血红素比较高,所以,最好不要用于干细胞,ﻫ2、Gibco得南美胎牛血清ﻫ这款血清,就是Gibco针对Hyclone南美胎牛血清做得,价格比较贵,好像就是1780元/500m。
3、Gemini得胎牛血清
4、TCB得胎牛血清
5、PAA得胎牛血清ﻫ6、JRH澳洲胎牛血清
第四类,国产得各种系列胎牛血清ﻫ国产得胎牛血清,国内没有严格意义得胎牛血清,胎牛血清本身就是需要穿刺取血得,而国内都就是剖腹产出胎牛,8小时左右取血,然后,进行过滤分装.
所以,国产得胎牛血清不就是严格意义得胎牛血清。
ﻫ价格便宜但就是遇到得问题非常多。
附2、Hyclone液体培养基
普通液体培养基列表
描述
货号
包装
储存温度
BME培养基(BasalMediumEagle)
EBSS*,含L—谷氨酰胺。
●SH30157、01
500ml
2-8°C
○SH30157、02
1000ml
2-8°C
DMEM培养基(Dulbecco’s Modified Eagle’sMedium)
高糖,含4、0mML—谷氨酰胺,不含丙酮酸钠。
●SH30022、01B
500ml
2-8°C
●SH30022、FS
6x500ml
2—8°C
●SH30022、02B
1000ml
2-8°C
●SH30022、LS
6x1000ml
2—8°C
高糖,不含L—谷氨酰胺与丙酮酸钠。
● SH30081、01
500ml
2—8°C
●SH30081、FS
6x500ml
2-8°C
● SH30081、02
1000 ml
2—8°C
●SH30081、LS
6x 1000ml
2—8°C
○SH30081、03
20 L袋装
2-8°C
○ SH30081、04
10 L袋装
2—8°C
高糖,含4、0 mML—谷氨酰胺、丙酮酸钠.
●SH30243、01B
500ml
2-8°C
●SH30243、FS
6x 500ml
2—8°C
●SH30243、02
1000ml
2—8°C
●SH30243、LS
6x 1000ml
2—8°C
○SH30243、03
10L袋装
2-8°C
○SH30243、04
20L袋装
2-8°C
高糖,含L—谷氨酰胺、HEPES,不含丙酮酸钠。
●SH30249、01
500ml
2—8°C
●SH30249、02
1000 ml
2—8°C
高糖,不含钙、镁。
●SH30262、01
500ml
2-8°C
○SH30262、02
1000ml
2—8°C
高糖,含L—谷氨酰胺,不含酚红与丙酮酸钠。
●SH30284、01
500ml
2—8°C
●SH30284、02
1000 ml
2—8°C
高糖,含丙酮酸钠,不含L-谷氨酰胺。
●SH30285、01
500 ml
2-8°C
●SH30285、FS
6 x500ml
2-8°C
●SH30285、02
1000ml
2—8°C
●SH30285、LS
6x1000ml
2—8°C
○SH30285、03
20L袋装
2-8°C
○SH30285、04
10L袋装
2—8°C
高糖,改良型,不含酚红、丙酮酸钠、L-谷氨酰胺。
○SH30585、01
500ml
2-8°C
●SH30585、02
1000 ml
2-8°C
高糖,改良型,不含酚红、L—谷氨酰胺,含丙酮酸钠.
●SH30604、01
500 ml
2—8°C
●SH30604、02
1000 ml
2—8°C
高糖,含丙酮酸钠,不含L-谷氨酰胺、甲硫氨酸、胱氨酸。
○SH30606、01
500ml
2-8°C
○SH30606、02
1000 ml
2—8°C
高度改良,含丙酮酸钠、25 mM HEPES,不含L-谷氨酰胺。
○SH30563、01
500ml
2-8°C
○SH30563、02
1000ml
2—8°C
高糖,含丙酮酸钠,不含L—谷氨酰胺、磷酸盐.
○SH30607、01
500ml
2—8°C
低糖,含4、0mML—谷氨酰胺、110mg丙酮酸钠。
●SH30021、01B
500ml
2—8°C
●SH30021、FS
6x500 ml
2—8°C
●SH30021、02
1000 ml
2—8°C
含2、50 mML-谷氨酰胺、15 mMHEPES。
●SH30023、01B
500ml
2-8°C
●SH30023、FS
6x500ml
2-8°C
●SH30023、02
1000ml
2-8°C
含HEPES,不含L—谷氨酰胺。
●SH30126、01
500ml
2-8°C
●SH30126、FS
6x500ml
2—8°C
○SH30126、02
1000ml
2—8°C
含L-谷氨酰胺、HEPES、丙酮酸钠。
●SH30261、01
500ml
2—8°C
●SH30261、02
1000ml
2—8°C
含L-谷氨酰胺,不含HEPES。
●SH30271、01
500 ml
2—8°C
●SH30271、FS
6x500ml
2—8°C
●SH30271、02
1000ml
2-8°C
含L—谷氨酰胺,不含HEPES、酚红。
●SH30272、01
500ml
2—8°C
●SH30272、02
1000ml
2—8°C
Ham"s培养基(Ham’sNutrient Mixture)
F10培养基,含L—谷氨酰胺。
●SH30025、01
500ml
2-8°C
○SH30025、02
1000ml
2—8°C
F12培养基,含1、00mML—谷氨酰胺。
1X
●SH30026、01B
500 ml
2—8°C
●SH30026、FS
6 x 500ml
2-8°C
●SH30026、02
1000ml
2-8°C
F12培养基,Kaighn"s改良型。
●SH30526、01
500ml
2-8°C
○SH30526、02
1000ml
2-8°C
昆虫培养基 (InsectMedia)
Grace”s无添加剂培养基
○SH30610、01
500ml
2—8°C
○SH30610、02
1000ml
2—8°C
TNM—FH培养基
●SH30280、02
500ml
2—8°C
●SH30280、03
1000ml
2-8°C
IMDM培养基(Iscove”sModifiedDulbecco"sMedium)
含L-谷氨酰胺、HEPES,不含α—硫代甘油.
●SH30228、01B
500ml
2-8°C
●SH30228、FS
6x500ml
2-8°C
●SH30228、02
1000ml
2—8°C
不含L—谷氨酰胺.
●SH30259、01
500ml
2—8°C
●SH30259、02
1000ml
2—8°C
Leibovitz培养基 (LeibovitzMedium)
L—15培养基,含2、05mML—谷氨酰胺。
●SH30525、01
500ml
2—8°C
●SH30525、02
1000ml
2—8°C
M199培养基 (Medium199)
EBSS*,含L-谷氨酰胺.
●SH30253、01B
500ml
2—8°C
○SH30253、FS
6 x 500 ml
2-8°C
●SH30253、02
1000ml
2-8°C
HBSS*,含L—谷氨酰胺.
○SH30233、01
100ml
2—8°C
○SH30233、02
500ml
2-8°C
HBSS*,含L-谷氨酰胺、L—氨基酸。
○SH30330、01
500ml
2—8°C
○SH30330、02
1000ml
2—8°C
McCoy"s5A培养基 (McCoy”s5AMedium)
含L-谷氨酰胺。
●SH30200、01
500ml
2—8°C
●SH30200、FS
6x500ml
2—8°C
●SH30200、02
1000ml
2-8°C
含L-谷氨酰胺,不含酚红。
●SH30270、01
500ml
2-8°C
○SH30270、02
1000ml
2-8°C
含L—谷氨酰胺、HEPES.
○SH30602、01
500ml
2—8°C
○SH30602、02
1000ml
2-8°C
○SH30602、03
100ml
2—8°C
MEM培养基(MinimumEssentialMedium)
EBSS*,含2、0mML-谷氨酰胺。
●SH30024、01B
500ml
2—8°C
●SH30024、FS
6x500 ml
2—8°C
●SH30024、02
1000 ml
2—8°C
●SH30024、LS
6x1000ml
2—8°C
EBSS*,含L—谷氨酰胺,用于悬浮培养。
○SH30235、01
500ml
2—8°C
○SH30235、02
1000ml
2—8°C
EBSS*,不含L-谷氨酰胺。
●SH30244、01
500ml
2—8°C
●SH30244、FS
6x500ml
2—8°C
●SH30244、02
1000ml
2—8°C
○SH30244、LS
6 x1000ml
2-8°C
α改良型,含L—谷氨酰胺、核糖核苷及脱氧核糖核苷。
●SH30265、01B
500ml
2-8°C
●SH30265、02
1000ml
2-8°C
●SH30265、FS
6x500ml
2—8°C
α改良型,不含L—谷氨酰胺、核糖核苷及脱氧核糖核苷。
●SH30568、01
500ml
2-8°C
○SH30568、FS
6 x 500ml
2—8°C
○SH30568、02
1000ml
2—8°C
Richter"s改良型,不含酚红。
○SH30600、01
500ml
2—8°C
○SH30600、02
1000ml
2—8°C
Richter"s改良型,含L-谷氨酰胺、酚红。
●SH30601、01
500 ml
2—8°C
○SH30601、02
1000ml
2-8°C
用于悬浮培养,不含L—谷氨酰胺、氯化钙及镁。
○SH30603、01
500ml
2-8°C
○SH30603、02
1000ml
2—8°C
RPMI 1640培养基(RPMI1640Medium)
1X,含2、05mML—谷氨酰胺(同SH30091)。
●SH30027、01
500ml
2-8°C
●SH30027、FS
6x500 ml
2-8°C
●SH30027、02
1000ml
2-8°C
●SH30027、LS
6x1000ml
2—8°C
1X,含2、05mML-谷氨酰胺(同SH30027).
○SH30091、01
20L袋装
2-8°C
○SH30091、02
10L袋装
2—8°C
不含L-谷氨酰胺
●SH30096、01
500ml
2-8°C
●SH30096、FS
6x500ml
2—8°C
●SH30096、02
1000 ml
2—8°C
○SH30096、LS
6 x1000ml
2-8°C
○SH30096、04
10L袋装
2—8°C
○
- 配套讲稿:
如PPT文件的首页显示word图标,表示该PPT已包含配套word讲稿。双击word图标可打开word文档。
- 特殊限制:
部分文档作品中含有的国旗、国徽等图片,仅作为作品整体效果示例展示,禁止商用。设计者仅对作品中独创性部分享有著作权。
- 关 键 词:
- RAW2647 小鼠 巨噬细胞 protocol