质粒DNA的提取纯化及鉴定.docx

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质粒DNA的提取纯化及鉴定

质粒DNA的提取、纯化与鉴定

摘要：

本实验利用碱变法从大肠杆菌DH5

（E.coliDH5

）中提取pUC19质粒，旨在学习并掌握质粒DNA提取的原理、纯化和检测方法及琼脂糖凝胶电泳技术。

同时通过对质粒DNA的提取、纯化过程及电泳图谱的分析，探讨碱变法提取高质量质粒DNA的关键步骤及影响所提质粒纯度和量的相关因子。

关键词：

碱变法质粒电泳

实验目的：

1.学习并掌握凝胶电泳进行DNA的分离纯化的实验原理。

2.学习并掌握凝胶的制备及电泳方法。

3.学习并掌握凝胶中DNA的分离纯化方法。

4.掌握碱变性提取发的原理及各种试剂的作用。

5.掌握碱变性法提取质粒DNA的方法。

实验原理：

1.质粒DNA的提取——碱变性提取法：

提取和纯化质粒DNA的方法很多，目前常用的有：

碱变性提取法、煮沸法、羟基磷灰石柱层析法、EB-氯化铯密度梯度离心法和Wizard法等。

其中，碱变性提取法最为经典和常用，适于不同量质粒DNA的提取。

该方法操作简单，易于操作，一般实验室均可进行。

提取质粒DNA纯度高，可直接用于酶切、序列测定及分析。

EB-氯化铯密度梯度离心法，主要适合于相对分子质量与染色体DNA相近的质粒，具有纯度高、步骤少、方法稳定，且得到的质粒DNA多为超螺旋构型等优点，但提取成本高，需要超速离心设备。

少量提取质粒DNA还可用沸水浴法、Wizard法等，沸水浴法提取的质粒DNA中常含有RNA，但不影响限制性核酸内切酶的消化、亚克隆及连接反应等。

碱变性法提取质粒DNA一般包括三个基本步骤：

培养细菌细胞以扩增质粒；收集和裂解细胞；分离和纯化质粒DNA。

在细菌细胞中，染色体DNA以双螺旋结构存在，质粒DNA以共价闭合环状形式存在。

细胞破碎后，染色体DNA和质粒DNA均被释放出来，但两者变性与复性所依赖的溶液pH值不同。

在pH值高达12.0的碱性溶液中，染色体DNA氢键断裂，双螺旋结构解开而变性；共价闭合环状质粒DNA的大部分氢键断裂，但两条互补链不完全分离。

当用pH值4.6的KAc（或NaAc）高盐溶液调节碱性溶液至中性时，变性的质粒DNA可恢复原来的共价闭合环状超螺旋结构而溶解于溶液中；但染色体DNA不能复性，而是与不稳定的大分子RNA、蛋白质-SDS复合物等一起形成缠连的、可见的白色絮状沉淀。

这种沉淀通过离心，与复性的溶于溶液的质粒DNA分离。

溶于上清的质粒DNA，可用无水乙醇和盐溶液，减少DNA分子之间的同性电荷相斥力，使之凝聚而形成沉淀。

由于DNA与RNA性质类似，乙醇沉淀DNA的同时，也伴随着RNA沉淀，可利用RNaseA将RNA降解。

质粒DNA溶液中的RNaseA以及一些可溶性蛋白，可通过酚/氯仿抽提除去，最后获得纯度较高的质粒DNA。

2.凝胶电泳进行DNA分离纯化：

电泳（electrophoresis）是带电物质在电场中向着与其电荷相反的电极方向移动的现象。

各种生物大分子在一定pH条件下，可以解离成带电荷的离子，在电场中会向相反的电极移动。

凝胶是支持电泳介质，它具有分子筛效应。

含有电解液的凝胶在电场中，其中的电离子会发生移动，移动的速度可因电离子的大小形态及电荷量的不同而有差异。

利用移动速度差异，就可以区别各种大小不同的分子。

因而，凝胶电泳可用于分离、鉴定和纯化DNA片段，是分子生物学的核心技术之一。

凝胶电泳技术操作简单而迅速，分辨率高，分辨范围广。

此外，凝胶中DNA的位置可以用低浓度荧光插入染料如溴化乙锭（ethidiumbromide，EB）或SYBRGold染色直接观察到，甚至含量少至20pg的双链DNA在紫外激发下也能直接检测到。

需要的话，这些分离的DNA条带可以从凝胶中回收，用于各种各样目的的实验。

分子生物学中，常用的两种凝胶为琼脂糖（agarose）和聚丙烯酰胺凝胶。

这两种凝胶能灌制成各种形状、大小和孔径，也能以许多不同的构型和方位进行电泳。

聚丙烯酰胺凝胶分辨率高，使用于较小分子核酸（5—500bp）的分离和蛋白质电泳。

它的分辨率非常高，长度上相差1bp或质量上相差0.1%的DNA都可以彼此分离，这也是采用聚丙烯酰胺凝胶电泳进行DNA序列分析的分子基础。

虽然它能很快地进行电泳，并能容纳较大的DNA上样量，但是与琼脂糖凝胶相比，在制备和操作上繁琐。

琼脂糖是从海藻中提取的长链状多聚物，由β-D-吡喃半乳糖与3,6-脱水-L-吡喃半乳糖组成，相对分子质量为104-105。

琼脂糖加热至90℃左右，即可溶化形成清亮、透明的液体，浇在模版上冷却后形成凝胶，其凝固点为40-45℃。

琼脂糖凝胶相对于聚丙烯酰胺凝胶分辨率低，但它的分离范围更大（50至百万bp），小片段DNA（50-20000bp）最适合在恒定轻度和方向的电场中水平方向的琼脂糖凝胶内电泳分离。

琼脂糖凝胶电泳易于操作，适用于核酸电泳，测定DNA的相对分子质量，分离经限制酶水解的DNA片段，进一步纯化DNA等。

琼脂糖凝胶电泳是一种常用的方法。

在溶液中，由于核酸有磷酸基而带有负电荷，在电场中向正极移动。

DNA在琼脂糖凝胶中的电泳迁移率主要取决于6个因素：

样品DNA分子的大小、DNA分子的构象、琼脂糖浓度、电泳所用电场、缓冲液和温度。

主要仪器和材料试剂：

1.仪器和材料：

恒温振荡培养箱，高速冷冻离心机，旋涡振荡器，水浴锅，1.5mL离心管，50mL离心管，不同型号的吸头，微量移液器，微波炉，电泳仪，制胶槽，电泳槽，梳子，锥形瓶，电子天平，手套，紫外灯，Eppendorf管等。

菌体：

E.coliDH5α受体菌，具有Ampr标记的质粒pUC19。

2.实验试剂：

LB培养基，抗生素（氨苄青霉素），溶液Ⅰ，溶液Ⅱ，溶液Ⅲ，RNaseA母液，TE缓冲液，饱和酚，氯仿/异戊醇混合液，酚/氯仿/异戊醇（PCI）混合液，预冷无水乙醇，TAE电泳缓冲液（10×），上样缓冲液（6×），琼脂糖，溴化乙锭（EB）,DNA相对分子质量标准物DNAMarkerλ/HindⅢ，5mol/LpH5.2的醋酸钠。

实验方法

菌体培养

1

配制40mL液体LB培养基（加入5%葡萄糖）、100mL固体LB培养基、并准备足量的移液管、200μl微量移液器头、1000μl微量移液器头、50mL离心管、1.5mL离心管，灭菌备用。

（1）注意无菌操作

（2）挑了单菌落的接种环要在三角瓶的液避接面处研辗，瞬间可看到菌体进入培养液造成的局部浑浊。

2

向液体LB培养基移取32μl氨苄青霉素，混合均匀。

3

将提前活化的E.coliDH5α受体菌，接种于液体LB培养基中。

将锥形瓶放入恒温震荡培养箱中，37℃，160r/min培养过夜至对数生长晚期。

质粒DNA的提取

1

称量50mL离心管重量W1，取30mL菌液于已称重的50mL离心管中，配平后7000r/min离心5min。

W1=13.46g

2

弃上清，向离心管中加入5mL溶液Ⅰ，涡旋振荡，7000r/min离心5min。

注意溶液Ⅰ要悬滴5次。

3

弃上清并称重W2，求W=W2-W1。

W2=14.47gW=1.01g

4

按照1.0mL/100mg菌体的量加入溶液Ⅰ，充分涡旋振荡，置于冰面上10min。

加入溶液Ⅰ后,盖好离心管,振荡至液体中无白色菌体丝状物既已振荡均匀。

5

再按照2.0mL/100mg菌体的量加入溶液Ⅱ，温和颠倒混匀，（置于冰面上10min。

）

（1）可观察到溶液变清亮透明粘稠如蛋清状。

（2）注意加入溶液Ⅱ时摇匀一定要轻柔，剧烈会导致基因组DNA断裂；静置时间也不能过长，因为基因组DNA在碱性条件下会慢慢断裂。

6

然后再按照1.5mL/100mg菌体的量加入溶液Ⅲ，温和颠倒混匀，置于冰面上15min。

（1）溶液出现白色絮状沉淀（蛋白质SDS复合物、细胞碎片和其他大分子成分）

（2）冰浴的目的是降低DNA酶的活性,防止质粒DNA被降解。

7

平衡后12000r/min离心15min。

取上清至新50mL离心管内，记录体积。

（1）上清液中含大量RNA、断裂的DNA片段和质粒DNA。

（2）此时沉淀不实，宁愿少吸上清，也不要带入沉淀，因为带入的沉淀在之后操作中无法去除。

加入两倍体积的冰乙醇，混匀后在-20℃环境下保存30min。

取出后12000r/min离心15min，弃上清。

加入冰乙醇沉淀DNA。

加入5mL70%乙醇，12000r/min离心5min，弃上清，室温干燥

（1）如果钠盐浓度高，会影响之后的酶切反应等，所以要进行洗涤。

同时，若乙醇浓度过低，则会使DNA溶解损耗。

（2）标记好DNA沉淀位置,以便下一步的溶解。

（3）离心时注意沉淀物位置。

8

取出离心管，加入1mLTE溶液得到粗提物，加入RNaseA液，使溶液浓度为150μg/mL，37℃保存60-120min。

（1）TE溶液的作用：

pH缓冲液，为DNA提供稳定的生理状态，呈弱碱性，有利于保护碱基对。

同时含有EDTA是二价阳离子的螯合剂，抑制DNA酶作用。

（2）RNase：

去除DNA沉淀中残留的RNA。

质粒DNA的纯化

1

取500μl粗提物于1.5mL离心管中，加入等体积的饱和酚，混匀，7000r/min离心5min,取上层到另一洁净离心管中。

苯酚是强的蛋白阻断剂，可使蛋白变性

2

转移上清（体积V1）至新管，加入等V1的酚：

氯仿：

异戊醇溶液，混匀，7000r/min离心5min,取上层到另一洁净离心管中。

氯仿也是蛋白阻断剂，但强度弱于苯酚，其主要作用是将同水以极小比例互溶的苯酚萃取出来。

如果不加氯仿，残留的苯酚会阻碍酶切反应等，且水饱和酚的密度略轻于水，苯酚相位于上层，不利于获得含质粒的水相，加入氯仿后可以增加比重，使得酚/氯仿始终在下层，方便水相的回收

3

转移上清（体积V2）至新管，加入等V2的氯仿：

异戊醇溶液，混匀，7000r/min离心5min,取上层到另一洁净离心管中。

异戊醇可起消除抽提过程中出现的泡沫，有利于分层更明显。

4

转移上清（体积V3）至新管，加入

V3的3MNaAc溶液（pH5.2），再加入2V4（V4=V3+

V3）的冰乙醇，混匀，-20℃保存30min以上，取出后12000r/min离心15min。

收集沉淀DNA。

5

在沉淀中，加入200μl70%乙醇，12000r/min离心1min，可将离心管倒置于纸巾上净上清。

（1）注意不打散沉淀小心倒去上清液。

（2）离心时注意离心管中沉淀物的位置。

（3）尽量用大量程的枪一次吸尽上清。

6

取出离心管，向一只离心管中加入25μlTE溶液，溶解沉淀后，转移入另一只离心管中，再取25μlTE溶液加入第一只离心管中，溶解后再移入另一只离心管中，得到50μl纯化质粒DNA。

注意小心温和振荡。

DNA纯度检测

1

取40mLTAE（1×）于300mL锥形瓶中，加入0.4g琼脂糖，放入微波炉内使其熔化，60℃时倒入准备好的制胶槽中。

制胶时，胶液温度过高，会使模具变性，影响胶孔大小和胶形状，从而间接影响加样量和跑条带。

胶液温度过低，会凝固，所以在胶液冷却至50~60℃左右倒胶。

2

取5.0μl纯化DNA加入1.0μl上样缓冲液，混合，进行点样。

注意加样时枪尖应恰好置于液面下凝胶点样孔上方，不可刺穿凝胶，也要防止将样品溢出孔外。

3

点样完毕后，100V，200mA条件下电泳30min。

4

电泳完毕后，进行EB染色，用凝胶成像仪拍照，得到实验结果。

溴化乙锭是一种强致突变剂，应严格戴手套操作！

注意事项

1）扩大培养菌体时，挑了单菌落的接种环要在三角瓶的液避接面处研辗，瞬间可看到菌体进入培养液造成的局部浑浊。

2）沉淀菌体的量不要贪多，适宜即可，菌体过多，可能会导致溶液Ⅰ无法混匀，细胞裂解不充分。

3）加入溶液Ⅰ重悬要充分，如果细胞没有完全散开悬浮，将会影响溶液Ⅱ裂解细胞，最终导致提取产物中含较多的蛋白质，染色体DNA等杂质。

4）加入溶液Ⅱ时摇匀一定要轻柔，剧烈会导致基因组DNA断裂；静置时间也不能过长，因为基因组DNA在碱性条件下会慢慢断裂。

5）使用离心机时，样品放置要对称平衡，否则会严重损害离心机的使用寿命。

6）制胶时，胶液温度过高，会使模具变性，影响胶孔大小和胶形状，从而间接影响加样量和跑条带。

胶液温度过低，会凝固，所以在胶液冷却至50~60℃左右倒胶。

7）注意加样时枪尖应恰好置于凝胶点样孔中，不可刺穿凝胶，也要防止将样品溢出孔外。

跑多个样时，应依次快速点样，否则时间一久，样品会弥散掉！

8）DNA分子在高于其等电点的pH溶液中带负电荷，在电场中向正极移动，点样孔在负极。

注意使电泳槽中缓冲液没过琼脂糖凝胶2mm为宜。

9）EB是一种强致突变剂，应严格戴手套操作！

实验结果

凝胶电泳拍照结果

图质粒DNA纯度检测凝胶成像结果

标注：

1号泳道：

λDNAmarker/HindⅢ

2号泳道：

线性的pUC19质粒DNA

3号泳道：

超螺旋状态的pUC19质粒DNA

4至15泳道：

1至12组的pUC19质粒DNA

16泳道：

加葡萄糖培养的线性的pUC19质粒DNA

17泳道：

隔夜菌株培养的线性的pUC19质粒DNA

18号泳道：

未加RNaseA的线性的pUC19质粒DNA

Ⅰ以上带是λDNA出现处

Ⅱ以上带是线性的pUC19质粒DNA出现处

Ⅲ处是RNA出现处

Ⅳ处是点样槽，其中的光斑则是代表蛋白质

各带光斑由上向下分别代表的分子量由大到小，各光斑的亮度则表示该物质含量的高低，越亮则代表浓度越高

分析

理论上碱变法提取质粒DNA琼脂糖凝胶电泳可能出现条带情况如下（按离点样孔远近排序,即电泳速度快慢排序）：

1.RNA：

没有完全裂解除去的RNA浅条带；观察Ⅲ处各组均有RNA残留,但是俩都不是很多。

2.cccDNA：

共价闭合环状质粒DNA,即所要提取的pUC19质粒超螺旋结构；观察Ⅱ区域各组条带亮度相差不多,因此产量相近,只有9号条带几乎观察不到,对于九号后面会有专门的分析。

各组也均有拖带的现象,但都不是很明显。

对于我们组8号,个人还是比较满意,毕竟第一次做,个人观察产量估计是180ng/ml。

3.ocDNA:

质粒的一条链断裂，超螺旋松弛开环结构。

4.LDNA:

DNA复制中间体，即没有复制完全的两个质粒连在了一起。

经典的实验教材一般认为这条带是线性结构质粒，实际上,这是一种误解。

正常情况下,碱法提取的质粒很少有线性的,电泳一般不出现。

经验也提示,只有一个酶切位点的内切酶切割质粒时,结果总是只有一条电泳条带。

如果有线性结构质粒,则不可能出现这种结果。

因为如果有线性质粒的话,单一酶切不可能出现单一条带。

5.染色体DNA:

如果在加入溶液Ⅱ后过渡振荡，会产生这条带，该带泳动得较慢，是20—100Kb的大肠杆菌基因组DNA片段,即Ⅰ线上方区域,观察各组条带均有白色暗斑,相对来说我感觉我们组的8号带还是比较好的,而5、7、16号就比较明显了。

6.如在点样孔附近出现荧光，则说明提取的质粒DNA中含有较多的蛋白质，阻碍了部分DNA泳动，形成荧光。

观察各组的点样孔Ⅳ，5、7、11、12、14、16号带白色较明显,很可能是蛋白质去除不彻底,也可能是点样时戳破了点样孔。

我组是8号,相对来说比较好,蛋白质去除比较干净。

7.第九组没有提取出pUC19的可能性分析：

（1）有的组得出了很好的结果，作为对照，排出了菌体或实验方法本身等源头出现问题，只能是自己实验操作出了问题；

（2）电泳图谱显示出了RNA浅条带，又RNA一直和质粒DNA处于同一相，所以不可能是将提取的质粒误丢；

（3）两次电泳结果都一样，排除点样跑胶问题；

（4）整个提取质粒过程应该没有问题。

因为，从实际现象上看，得到的DNA粗沉淀为乳白色，其颜色和量都正常。

从理论上分析，即使是加溶液Ⅰ没有充分悬浮，或者是加溶液Ⅱ和Ⅲ时震荡过于激烈，那产物中也应该会有质粒DNA，只是带有较多蛋白质，染色体DNA等杂质；

（5）最大的可能性是最后一步加1/10V3mol/LNaAc（pH5.2）和2V冰乙醇沉淀纯化后的DNA出了问题，因为上清液不是按既定量程一次性吸取出来的，当时操作人也不清楚第二次吸取的上清体积，所以就大约估计为350ul。

可能是体积估计误差较大，所以加入NaAc和冰乙醇后，Na+和乙醇浓度都没有达到沉淀DNA的标准，DNA没有被沉淀！

讨论

1.酚具有腐蚀性，能损伤皮肤和衣物，使用时应小心。

皮肤如不小心沾到酚，应立即用碱性溶液、肥皂或大量清水冲洗。

2.本次实验中，原应灭菌之前加入培养基内的葡萄糖由于操作疏忽而忘记加入，随后按照老师指示配制100mL10%的葡萄糖溶液一起灭菌，待灭菌后再将葡萄糖溶液加入培养基中。

3.为最大限度去除上清，可在倒掉部分上清后，再将离心管放入离心机稍作离心，使残留在管壁的液体集中到离心管底部，再用移液器移除液体。

4.为获得高纯度的质粒DNA，必须彻底去除杂蛋白、染色体DNA和RNA。

在整个质粒提取过程中出去染色体DNA的关键步骤是加入溶液Ⅱ、溶液Ⅲ的变性和复性环节，应控制好变性和复性的时机。

加入溶液Ⅰ时，可剧烈震荡，使菌体沉淀转变成均匀的菌悬液，此时细胞尚未破裂，染色体不会断裂；加入溶液Ⅱ时，菌液变粘稠、透明，无菌块残留；加入溶液Ⅲ时，会立即出现白色沉淀。

加入溶液Ⅱ和溶液Ⅲ后，应缓慢上下颠倒离心管数次，切忌在旋涡振荡器上剧烈振荡，否则染色体DNA会断裂成小片段，不形成沉淀，而溶解在溶液中，与质粒DNA混合在一起，不利于质粒DNA提纯。

因此，操作时一定要缓慢柔和，采用上下颠倒的方法，既要使试剂与染色体DNA充分作用，又不破坏染色体的结构。

5.在纯化DNA加入冰乙醇的步骤中，2只离心管在加入的DNA样品量相同的情况下，出现了从-20℃环境下取出后2只离心管内液体体积相差较多的情况，分析后发现量较少的1只离心管内加入的各种试剂的量是合适的。

可能的原因：

①在用移液器移取冰乙醇时下按力度太大，吸入过多液体；②2只离心管分别由2名组员加液，操作上可能出现个人之间的误差。

6.本次实验得到的质粒DNA较少，最主要原因是选择了菌体生长较少的培养基，仅得到较少的粗提物，导致最终纯化得到的质粒DNA也较少。

附注：

培养基及实验试剂配方：

1.LB（LuriaBroth）培养基

LB液体培养基：

1%蛋白胨（typtone），0.5%酵母粉（yeastextract），1%NaCl。

用NaOH调pH至7.2,121℃灭菌20min备用。

LB固体培养基：

除以上LB培养基成分外，还需要添加1.5%~2%琼脂，121℃灭菌20min备用。

LB半固体培养基：

在LB液体培养基中加入0.75%琼脂，121℃灭菌20min备用。

2.氨苄青霉素：

母液浓度为100μg/μl，工作浓度为50~100μg/mL。

3.TE缓冲液：

10mmol/LTris-HCl（pH8.0），1mmol/LEDTA。

4.氯仿/异戊醇混合液：

按氯仿：

异戊醇为24：

1（V/V）的比例在氯仿中加入异戊醇。

5.酚/氯仿/异戊醇（PCI）混合液：

饱和酚：

分析纯的酚溶化后经160℃重蒸后，加入0.1%（V/V）的抗氧化8-羟基喹啉，再加入等体积的0.1mol/LTris-HCl（pH8.0）缓冲液反复抽提，使之饱和，并使其pH为8.0，亦可购买商品化的饱和酚。

按酚与氯仿/异戊醇为1：

1的比例混合饱和酚与氯仿/异戊醇混合液，即得酚/氯仿/异戊醇（PCI）（25:

24:

1）混合液。

6.6×上样缓冲液：

30%甘油，0.25%溴酚蓝（bromophenolblue,BPB），0.25%二甲苯氰FF。

7.溶液Ⅰ：

50mmol/L葡萄糖，25mmol/LTris-HCl（pH8.0），10mmol/LEDTA。

8.溶液Ⅱ：

0.2mol/LNaOH，1%SDS（临用前用10mol/LNaOH和20%SDS母液配制）。

9.溶液Ⅲ：

5mol/LKAc60mL，冰醋酸11.5mL，重蒸水28.5mL；溶液终浓度为：

K+3mol/L，Ac-5mol/L；

10.RNaseA母液：

将RNaseA溶于含10mmol/LTris-HCl（pH7.5）和15mmol/LNaCl的溶液中，配成10mg/mL溶液，于100℃加热15min，使污染的DNase失活。

冷却后用1.5mL无菌离心管分装，保存于-20℃。