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化妆品中7种禁用物质检测方法
化妆品中7种禁用物质检测方法
附件1:
化妆品中氢化可的松等7种禁用物质的检测方法
(征求意见稿)
1适用范围
本方法规定了采用液相色谱-串联质谱法测定化妆品中7种禁用物质:
米诺地尔(CAS:
38304-91-5),氢化可的松(CAS:
50-23-7),螺内酯(CAS:
52-01-7),雌酮(CAS:
53-16-7),坎利酮(CAS:
976-71-6),醋酸曲安奈德(CAS:
3870-07-3),黄体酮(CAS:
57-83-0)的方法。
本方法适用化妆品中禁用物质:
米诺地尔,氢化可的松,螺内酯,雌酮,坎利酮,醋酸曲安奈德,黄体酮含量的测定。
2方法提要
样品经过提取后,用液相色谱-串联质谱法测定,以多反应离子监测模式进行监测,采用特征离子丰度比进行定性,待测化合物峰面积定量,以标准曲线法计算含量。
本方法的检出限、定量限和取样品1g时的检出浓度、定量浓度见表1.
表1各违禁成分的检出限和检出浓度
化合物米诺地尔氢化可的松螺内酯雌酮坎利酮醋酸曲安奈德
黄体酮
3试剂和材料
检出限(ng)0.510.5500.50.10.2
定量限(ng)12110010.20.5
检出浓度(ng/g)10252550010510
定量浓度(ng/g)2550501000251025
除另有规定外,所用试剂均为分析纯,水为去离子水。
3.1乙腈,色谱纯。
3.2甲醇,色谱纯。
3.3乙腈溶液[φ(乙腈)=90%]:
量取10mL水于100mL量瓶中,加乙腈(3.1)稀释至刻度,混匀。
3.4混合标准储备溶液[(待测成分)=1mg/mL]:
精密称取米诺地尔,氢化可的松,螺内酯,雌酮,坎利酮,醋酸曲安奈德,黄体酮标准品10mg(精确到0.01mg)置于同一10mL量瓶中,加甲醇(3.2)使溶解并定容至刻度,摇匀,即得质量浓度为1mg/mL的混合标准储备溶液。
3.5系列浓度标准溶液:
用90%乙腈(3.4)稀释混合标准储备溶液,精密配制得质量浓度为10,20,50,100,200,500,1000,1500ng/mL的系列浓度标准溶液。
4仪器
4.1液相色谱-三重四极杆质谱联用仪。
4.2分析天平:
感量0.001g。
4.3超声波清洗仪。
4.4离心机4.5涡旋混合仪5测定步骤5.1样品处理
准确称取样品约1.0g(精确至1mg),置于10mL比色管中,加入1mL饱和氯化钠溶液,涡旋30后加入乙腈,定容至刻度,涡旋30,超声提取30min,涡旋1min,4500rpm离心5min,取上清液经0.45μm微孔滤膜过滤后,滤液作
2
为待测液备用。
5.2液相色谱-三重四极杆质谱联用分析条件5.2.1色谱条件
色谱柱:
WaterSymmetryC18(3.5μm,2.1某150mm)或同等柱效色谱柱;流动相:
溶液A:
0.2%甲酸水,溶液B:
甲醇(含0.2%甲酸),梯度程序见表2
表2流动相的梯度程序
时间(min)
0241118
流速:
0.3mL/min;柱温:
30℃;进样量:
5μL。
5.2.2质谱参考条件
离子源:
电喷雾离子源(ESI源);
监测模式:
正离子监测模式;监测离子对及相关电压参数设定见表3喷雾压力:
40pi;干燥气流速:
8L/min;干燥气温度:
325℃;毛细管电压:
4000V;
0–3.5min:
不进入质谱仪分析,3.5–18min:
进入质谱仪分析。
3
溶液A(%)
9575452010
溶液B(%)
525558090
表3三重四极杆离子对及相关电压参数设定表
某:
定量离子对5.3定性判定
用液相色谱-串联质谱法对样品进行定性判定,在相同试验条件下,样品中被测禁用物质的质量色谱峰保留时间与标准溶液中对应物质的质量色谱峰保留时间一致;样品色谱图中所选择的监测离子对的相对丰度比与相当浓度标准溶液的离子相对丰度比的偏差不超过表4规定范围,则可以判断样品中存在对应的禁用物质。
表4定性确证时相对离子丰度的最大允许偏差
相对离子丰度(k)允许的最大偏差5.4定量测定
在“5.2”项液相色谱-三重四极杆质谱联用分析条件下,用系列浓度标准溶液
4
物质名称米诺地尔
氢化可的松
螺内酯
雌酮坎利酮
醋酸曲安奈德
黄体酮
母离子(m/z)210.0
363.1341.1271.2341.1477.1315.2
Frag.(V)110110125125147165105105147165100100140140
子离子(m/z)193.2164.1某327121某107.1某90.9253.1某132.8107.1某90.9457.2某439.110997某
CE(V)
10251025356552235655102523
k≥50%±20%50%>k≥20%20%>k≥10%±25%±30%k≤10%±50%
(3.6)分别进样,以禁用物质的系列浓度为横坐标,禁用物质的峰面积为纵坐标,进行线性回归,建立溶液标准曲线,其线性相关系数应大于0.99。
取“5.1”项下处理得到的待测溶液进样5μL,禁用物质的峰面积比代入溶液标准曲线,计算禁用物质的质量浓度,按“6项计算”,计算样品中禁用物质的质量分数。
5.5平行实验
按以上步骤操作,对同一样品独立进行测定获得的两次独立测试结果的绝对差值不得超过算术平均值的15%。
6计算
DV
w(违禁成分)=——————
m某103
式中:
w(违禁成分)——化妆品中禁用物质的质量分数,μg/g;
m——样品取样量,g;
——代入回归方程计算得到的待测样液中禁用物质的质量浓度,ng/mL;V——定容体积,mL;
D——稀释倍数(不稀释则为1)。
7回收率和精密度
多家实验室验证的平均方法回收率为90.4%~113.0%,相对标准偏差小于8.6%。
8色谱图
5
1234567
7种禁用物质混合标准溶液的HPLC-MS/MS色谱图
色谱峰:
1:
米诺地尔(TR=6.7min),2氢化可的松(TR=10.8min),3螺内酯(TR=12.5min),4雌酮(TR=12.7min),5坎利酮(TR=13.1min),6醋酸曲安奈德(TR=13.7min),7黄体酮(TR=15.1min)
6
化妆品中氢化可的松等7种禁用物质的检测方法编制
说明
第一部分基本信息
1简介
米诺地尔、氢化可的松、螺内酯、雌酮、坎利酮、醋酸曲安奈德、黄体酮具有促进发毛增长作用。
除此以外6种激素还具有抗皱、祛痘等作用。
《化妆品卫生规范》2007年版中规定米诺地尔和甾体结构的激素类化合物为禁用物质,这7种禁用物质是易于添加至育发和抗皱、祛痘类化妆品中的禁用物质。
2属性信息2.1米诺地尔
2.1.1中文名:
米诺地尔2.1.2英文名称:
Mino某idil2.1.3分子式:
C9H15N5O2.1.4分子量:
209.252.1.5CAS号:
38304-91-52.1.6结构式:
2.1.7理化特性
本品为白色或类白色结晶性粉末,无臭。
在冰醋酸中溶
解,在乙醇中略溶,在氯仿或水中微溶,在丙酮中极微溶解。
熔点270~273℃(分解)。
2.2氢化可的松
2.2.1中文名:
氢化可的松2.2.2英文名称:
Hydrocortione2.2.3分子式:
C21H30O5
7
2.2.4分子量:
362.462.2.5CAS号:
50-23-72.2.6结构式:
2.2.7理化特性
白色或类白色结晶性粉末,无臭,味苦。
遇光变质。
熔点214-220℃(分解)。
本品不溶于水,难溶于乙醚,微溶于氯仿,溶于丙酮、乙醇。
可溶于浓硫酸液并呈绿色荧光。
2.3螺内酯
2.3.1中文名:
螺内酯
2.3.2英文名称:
Spironolactone2.3.3分子式:
C24H32O4S2.3.4分子量:
416.572.3.5CAS号:
52-01-72.3.6结构式:
2.3.7理化特性
有轻微硫醇臭,在氯仿中极易溶解,在苯或醋酸乙酯中易溶,在乙醇
中溶解,在水中不溶。
本品的熔点为203~209℃,熔融时同时分解。
2.4雌酮
2.4.1中文名:
雌酮2.4.2英文名称:
Etrone2.4.3分子式:
C18H22O22.4.4分子量:
270.372.4.5CAS号:
53-16-7
8
2.4.6结构式:
2.4.7理化性质
本品为白色板状结晶或结晶性粉末,在空气中稳定。
几乎不溶于水,溶于
二氧六环、吡啶和氢氧化碱溶液,微溶于乙醇(1:
400)、丙酮、苯、氯仿、乙醚和植物油。
动物实验证明,有潜在致癌作用。
熔点258-260°C。
2.5坎利酮
2.5.1中文名:
坎利酮2.5.2英文名称:
Canrenone2.5.3分子式:
C22H28O32.5.4分子量:
340.462.5.5CAS号:
976-71-62.5.6结构式:
2.5.7理化特性
微黄色或乳白色结晶性粉末(乙酸乙酯)。
熔点149-151℃,165℃固化并
重熔。
2.6醋酸曲安奈德
2.6.1中文名:
醋酸曲安奈德
2.6.2英文名称:
Triamcinoloneacetonideacetate2.6.3分子式:
C26H33FO72.6.4分子量:
476.5342.6.5CAS号:
3870-07-32.6.6结构
式:
9
2.6.7理化特性
本品为白色或类白色的结晶性粉末;无臭。
本品在三氯甲烷中溶解,
在丙酮中略溶,在甲醇或乙醇中微溶,在水中不溶。
2.7黄体酮
2.7.1中文名:
黄体酮2.7.2英文名称:
Progeterone2.7.3分子式:
C21H30O22.7.4分子量:
314.47
2.7.5CAS号:
57-83-02.7.6结构式:
2.7.7理化性质
本品为白色粉末状固体,熔点128-132°。
水溶解性<0.1g/100mL(19℃)。
2.8禁用标准
2007版《化妆品卫生规范》禁止在化妆品中添加使用这7种物质,为禁用物质。
10
第二部分方法选择与优化
1分析方法及其条件的选择与优化
根据文献报道,该7种禁用物质适于采用高效液相色谱-串联质谱法分离与检测。
2007版《化妆品卫生规范》中规定了―化妆品中雌三醇等7种性激素‖的检测方法。
本方法的建立参考了《化妆品卫生规范》中有关性激素的检测方法和相关文献报道方法,本方法的具有更好的检测灵敏度,对复杂基质中禁用物质阳性结果的的判定依据更充分和准确。
1.1提取方法的选择
化妆品基质复杂,按样品物理状态分可以有液体,半流体,固体三大类。
本研究根据易于添加这7种禁用物质化妆品为育发、祛痘和抗皱产品,因此主要针对液体,半流体状化妆品。
由于此类化妆品乳化现象明显,在前处理步骤中添加等量的饱和氯化钠溶液减少乳化。
另外甲醇和乙腈对这7种禁用物质均有良好的提取效率,通过实际样品处理发现,甲醇提取后的样品乳化现象较乙腈明显,为了保证定容的简便和准确,本研究采用乙腈作为提取溶剂。
1.2液相色谱条件的建立
文献调研表明这7种禁用物质常用缓冲溶液添加一定比例的有机溶剂作为流动相。
而甲醇作为有机相对待测化合物分离效果明显好于乙腈,所以实验选择甲醇作为有机相。
考虑到加入适量的酸可以提供质谱的离子化效果,最后选择甲醇(含0.2%甲酸)体系作为流动相。
由于液质联用,质谱具有第二次分离的能力,色谱条件不需要达到7种禁用物质完全基线分离,这样节省了分析样品的时间,提高了分析效率。
1.3质谱条件的建立
为了获得最好的质谱条件,针对每个化合物,分别进样,进行质谱条件优化。
11
主要选择参数有:
气流,源温,电压,以及定性和定量离子对的选择等。
12
第三部分验证
1实验室内验证1.1方法特异性
空白溶剂(乙腈)和经过处理的空白化妆品样品、空白化妆品样品加对照品以及阳性化妆品样品,在选定的分析条件下注入液质联用仪进行分析,分析图谱见图1-图4,结果表明化妆品基质对7种待测化合物测定无干扰,说明所建方法适用于7种待测化合物的测定。
定量离子对
定性离子对
13
1234567图1(续)
定
量
离
子
1对
定性离子对
14
1234567图2(续)定量离子对
定性离子对
15
1234567图3(续)
定量离子对
定性离子对
16
1234567图4(续)1.2线性及线性范围1.2.1溶液标准曲线的配制
将7种禁用物质对照品配制成1g/L的混合标准储备液,再稀释成10,20,50,100,200,500,1000,1500ng/mL的系列浓度混合对照品标准溶液,经0.45μm微孔滤膜过滤后,得系列标准工作溶液
移取5μL系列标准溶液,注入高效液相色谱-串联质谱联用仪中进行测定,以峰面积对目标化合物的浓度制作标准曲线。
1.2.2基质标准曲线的配制
将7种禁用物质对照品配制成1g/L的标准储备液,再分别加入空白样品中,空白样品每份为1g,加入相应的标液量,经过前处理后,得浓度为0.1,0.2,0.5,1,2,5,10,15μg/mL的系列基质标准工作溶液。
移取5μL系列基质标准工作溶液,注入高效液相色谱-串联质谱联用仪中进行测定,以峰面积对目标化合物的浓度制作标准曲线。
1.2.3标准曲线和线性范围
17
在设定的分析条件下,测定系列浓度的混合对照品标准溶液和两种空白化妆品基质标准溶液,以待测化合物的浓度(C)为横坐标,以待测化合物的峰面积(Y)为纵坐标,进行线性回归和标准曲线的绘制。
测定的回归方程、相关系数、线性范围见表1-2。
表1溶液标准曲线的回归方程、相关系数及线性范围
化合物米诺地尔氢化可的松螺内酯雌酮坎利酮醋酸曲安奈德
黄体酮
回归方程Y=279.8097某+592.9543Y=43.0701某+66.4987Y=66.5807某+146.5370Y=55.4775某+99.3666Y=116.2751某+237.6620Y=149.5623某+292.6211Y=260.9797某+393.9815
相关系数r0.99950.99980.99970.99991.00000.99980.9999
线性范围10~1500ng/mL10~1500ng/mL10~1500ng/mL10~1500ng/mL10~1500ng/mL10~1500ng/mL10~1500ng/mL
表2空白样品标准曲线的回归方程、相关系数及线性范围
空白样品A
化合物
回归方程
米诺地尔氢化可的松螺内酯雌酮坎利酮醋酸曲安奈德
黄体酮
Y=259.7031某-103.7321Y=46.9925某+98.6579Y=67.5324某+8.0041Y=55.3177某+39.1988Y=120.1576某-36.0510Y=156.3006某+50.2798Y=286.4736某+228.6359
r0.99920.99890.99960.99970.99940.99960.9994
回归方程Y=267.9463某+810.1858Y=44.2867某+114.5602Y=68.0233某+299.2467Y=60.8372某+329.9762Y=125.6104某+763.6544Y=164.0432某+1098.9391Y=291.7662某+1925.6788
r0.99880.99890.99740.99790.99810.99520.9951
0.1~15μg/g0.1~15μg/g0.1~15μg/g0.1~15μg/g0.1~15μg/g0.1~15μg/g0.1~15μg/g
空白样品B
线性范围
1.3检出限和定量下限
稀释并检测7种禁用物质标准溶液,测定峰高信噪比为10:
1时7种禁用物质的浓度确定为本方法的定量下限;测定峰高信噪比为3:
1时7种禁用物质的浓度确定为本方法的检出限,结果见表3所示。
18
1.4检出浓度和最低定量浓度
向不含7种禁用物质的空白样品中定量添加7种禁用物质标准溶液,按前处理方法处理后,测定峰高信噪比为10:
1时添加的7种禁用物质量确定为方法的最低定量浓度;测定峰高信噪比为3:
1时添加的7种禁用物质量确定为本方法的检出浓度,结果见表3所示。
表37种禁用物质的检出限、定量限、检出浓度、定量浓度化合物
检出限(ng)
米诺地尔氢化可的松螺内酯雌酮坎利酮醋酸曲安奈德
黄体酮
0.211510.20.5
定量限(ng)0.5221020.51
检出浓度(ng/g)21010501025
定量浓度(ng/g)5202010020510
1.5基质效应
两种空白化妆品(空白样品A和空白样品B)的基质效应测定结果见表4-5。
从数据中可以看出,7种禁用物质的基质效应并不十分明显。
表4空白样品A的基质效应测定结果表
分析物
浓度
峰面积(某104)
绝对
19
(ng/mL)Set1(n=6)Mean±SD
RSD(%)0.90.72.01.12.01.80.72.22.01.85.06.57.07.3
Set2(n=6)Mean±SD4.94±0.1524.3±0.30.775±0.0143.82±0.031.17±0.025.96±0.110.992±0.0244.94±0.072.10±0.0410.74±0.112.92±0.0614.7±0.24.83±0.4524.4±0.1
RSD(%)3.01.31.80.91.61.92.41.52.01.02.01.20.90.6
基质效应(%)101.5102.398.496.794.895.992.290.693.795.198.598.792.591.0
米诺地尔200999
4.86±0.0423.8±0.20.787±0.0123.95±0.041.23±0.026.22±0.111.08±0.015.45±0.122.24±0.0311.3±0.22.96±0.1514.9±1.05.22±3.8626.8±1.97
氢化可的松199994
螺内酯2001000
雌酮198991
坎利酮2001000
醋酸曲安奈德195975
黄体酮199995
表5空白样品B的基质效应测定结果表浓度(ng/mL)200999
氢化可的松
199994
螺内酯
2001000
Set1(n=6)Mean±SD
米诺地尔
4.86±0.0423.8±0.20.787±0.0123.95±0.041.23±0.026.22±0.11
RSD(%)0.90.72.01.12.01.8
峰面积(某10)
Set2(n=6)Mean±SD5.74±0.1127.5±0.90.807±0.0153.98±0.061.33±0.026.42±0.09
RSD(%)1.93.21.81.61.81.3
118.0115.4102.4100.8108.4103.2
2
分析物
绝对基质效应(%)
20
雌酮198991
1.08±0.015.45±0.122.24±0.0311.3±0.22.96±0.1514.9±1.05.22±3.8626.8±1.97
0.72.22.01.85.06.57.07.3
1.11±0.015.72±0.092.36±0.0211.4±0.23.21±0.0616.1±0.26.03±0.0629.2±0.5
1.31.51.01.51.81.41.01.6
103.5105.0105.2100.9108.4108.4115.5108.9
坎利酮2001000
醋酸曲安奈德195975
黄体酮199995
1.6精密度
对制备的两个浓度的精密度样品分别连续进样6次进行HPLC-MS/MS分析,测得的峰面积代入随行的溶液标准曲线,计算检出的浓度以及RSD和准确度,结果见表6-7。
表6空白样品A中7种待测物质的精密度(n=6)
化合物
浓度(μg/g)
2.009.991.999.942.0010.01.989.912.0010.01.95
检出浓度(μg/g)
2.06±0.039.76±0.191.94±0.049.18±0.131.86±0.039.76±0.031.93±0.039.65±0.101.80±0.049.16±0.061.83±0.03
21
RSD(%)1.32.01.91.321.60.31.71.02.40.61.7
准确度(%)
10397.697.597.893.197.697.497.490.191.693.6
米诺地尔
氢化可的松
螺内酯
雌酮
坎利酮醋酸曲安奈德
9.75
黄体酮
1.999.95
9.41±0.081.97±0.019.72±0.03
0.90.60.4
96.599.197.7
表7空白样品B中7种待测物质的精密度(n=6)
化合物米诺地尔
浓度(μg/g)
2.009.99
氢化可的松
1.999.94
螺内酯
2.0010.0
雌酮
1.989.91
坎利酮
2.0010.0
醋酸曲安奈德
1.959.75
黄体酮
1.999.95
检出浓度(μg/g)
2.30±0.0310.9±0.12.17±0.0410.8±0.221.2±0.0410.6±0.22.05±0.0110.7±0.12.08±0.0210.6±0.42.15±0.0310.7±0.22.10±0.0310.8±0.1
RSD(%)1.11.31.81.82.02.00.41.30.73.51.51.51.40.8
准确度(%)
115.0108.8109.1108.7105.8106.2103.5108.8103.8106.5110.0110.2105.6108.3
1.7回收率
对制备的回收率样品进行HPLC-MS/MS分析,测得的峰面积分别代入随行的溶液标准曲线和基质标准曲线,计算测得浓度,然后除以理论加入浓度,获得方法的回收率。
两种不同基质化妆品的回收率数据见表8和表9。
可以看出,采用溶液标准曲线和基质标准曲线计算回收率均能满足要求。
。
表8空白样品A加标样品代入不同标准曲线所得回收率
中浓度(2μg/g)
化合物
标曲类型
回收率a(%)
RSD(%)
高浓度(10μg/g)回收率a(%)
RSD(%)
22
米诺地尔溶液基质A
110.2±3.8107.6±3.7116.0±2.9102.3±2.697.0±2.898.2±2.898.3±3.1100.5±3.2102.0±2.994.3±2.6103.3±4.898.5±4.5109.5±3.8104.3±3.6
3.53.52.52.52.92.93.23.22.82.84.64.63.53.4
101.1±2.598.1±2.5111.1±2.998.2±2.597.0±2.997.3±2.996.4±2.797.9±2.8101.0±2.591.8±2.3102.7±3.097.0±2.9104.2±3.298.3±3.2
2.52.52.62.63.03.02.82.82.52.53.03.03.23.2
氢化可的松溶液基质A
螺内酯溶液基质A
雌酮溶液基质A
坎利酮溶液基质A
醋酸曲安奈德溶液基质A
黄体酮溶液基质A
a:
平均回收率±标准偏差
表9空白样品B加标样品代入不同标准曲线所得回收率
中浓度(2μg/g)
化合物
标曲类型
回收率a(%)
溶液
米诺地尔
基质B溶液
氢化可的松
基质B溶液
螺内酯
基质B
雌酮
溶液
104.1±2.3107.7±1.5
2.21.4
106.9±1.4110.0±0.9
1.30.8
107.0±2.7111.2±2.4
2.52.2
108.4±1.1114.0±1.5
1.01.3
111.1±2.5111.2±2.7
2.22.5
107.5±1.7112
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