王亮级绿色荧光蛋白的应用.docx

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王亮级绿色荧光蛋白的应用

绿色荧光蛋白的应用

王亮学号：

1243410003

来源于水母Aequoreavictoria的绿色荧光蛋白（greenfluorescentprotein,GFP）现已成为在生物化学和细胞生物学中研究和开发应用得最广泛的蛋白质之一.其内源荧光基团在受到紫外光或蓝光激发时（λmax=395nm,小峰在479nm）可高效发射清晰可见的绿光.GFP的高分辨率晶体结构为了解和研究蛋白质结构和光谱学功能关系提供了一个极好的机会.GFP已成为一个监测在完整细胞和组织内基因表达和蛋白质定位的理想标记.通过突变和蛋白质工程构建的GFP嵌合蛋白在生理指示剂、生物传感器、光化学领域以及生产发光纤维等方面展示了广阔前景.

绿色荧光蛋白-GFP的理论应用

1．分子标记

利用绿色荧光蛋白独特的发光机制，可将GFP作为蛋白质标签（proteintagging），即利用DNA重组技术，将目的基因与GFP基因构成融合基因，转染合适的细胞进行表达，然后借助荧光显微镜便可对标记的蛋白质进行细胞内活体观察。

由于GFP相对较小，只有238个氨基酸，将其与其他蛋白融合后不影响自身的发光功能，利用GFP的这一特性已经加深了我们对细胞内一些过程的了解，如细胞分裂、染色体复制和分裂，发育和信号转导等。

利用GFP来检测目标蛋白的定位已为我们提供了一种对细胞内的一些基本的生理过程进行更详尽观察的新方法。

除用于特定蛋白的标记定位外，GFP亦大量用于各种细胞器的标记如细胞骨架、质膜、细胞核等等。

Shi等人曾报道将GFP融合到大肠杆菌细胞膜表面用作标记蛋白，这一技术将有助于提高多肽库的筛选效率、疫苗的研制、构建细胞生物传感器用作环境检测以及探测信号转导过程等等。

这些都为传统生物学研究提供了新思路和新方法，成为交叉学科研究的热点。

2．药物筛选

许多新发展的光学分析方法已经开始利用活体细胞来进行药物筛选，这一技术能从数量众多的化合物中快速筛选出我们所感兴趣的药物。

荧光探针分布是利用信号传导中信号分子的迁移功能，将一荧光蛋白与信号分子相偶联，根据荧光蛋白的分布情况即可推断信号分子的迁移状况，并推断该分子在迁移中的功能。

由于GFP分子量小，在活细胞内可溶且对细胞毒性较小，因而常用作荧光探针。

在细胞体内分子之间的相互作用非常复杂，其中很多涉及到信号分子在细胞器之间的迁移。

利用GFP荧光探针，将很容易从数量众多的化合物中判断出那些化合物具有与信号分子相似的能引起配体一受体复合物迁移并介导生理反应的功能，且这一筛选过程简单方便，所需成本也很低。

利用GFP来进行药物筛选由于受其必须与迁移的信号分子相偶联，其筛选容量相对较低，但是由于GFP在细胞内的穿透性强及独特的发光机制，因而在药物筛选中具有相当大的应用潜力。

3．融合抗体

单链抗体（Single-chainvariablefragment，ScFv）是研究得较多的一种小分子抗体，其优越陛在于可在宿主细胞内大量表达，易于基因工程操作，尤其易于构建抗体融合蛋白。

近年来，关于绿色荧光蛋白融合单链抗体的报道很多，国内也有相关报道，如程虹等报道将抗肝癌单链双功能抗体融合GFP真核表达载体并导人小鼠成纤维细胞NIH3T3表达并获得成功。

因融合抗体具有与抗原结合及发射荧光两种特性，故这一人工分子可用做免疫染色的检测试剂，直接应用于流式细胞仪和免疫荧光的标记及肿瘤的检测等等。

但近来也有报道在动物细胞细胞质中成功表达出具有抗原结合活性的单链抗体。

若能成功解决融合抗体的表达问题，则在免疫染色及肿瘤检测这一领域融合抗体将扮演极为重要的角色。

4．生物传感器

蛋白质工程技术已经开始采用将一具有信号传导功能分子识别位点的分子结合到另一分子上来设计生物感受器。

绿色荧光蛋白由于其独特的光信号传导机制，以及在表达后易被周围化学环境和蛋白之间的相互作用所影响的特性，因而极适于用做活细胞体内的光学感受器。

将受体蛋白插入到GFP表面的技术已经成为构建分子感受器的有力工具，这种GFP感受器能被用来检测多种分子，如蛋白质、核酸、激素、药物、金属及其他的一些小分子化合物等，其潜在应用前景极为广阔。

5.Proteintagging

GFP蛋白首先被应用在观察活体细胞中蛋白的位置及动态的变化.使用GFP进行此类研究的好处是细胞在实验之前不需要进行固定或破坏,如此便能在几乎不影响细胞的正常生理作用下进行即时的观察及分析.主要可以应用在Biologicalscreen及Drugscreen上.

GFP蛋白除了能在细胞中标定特定fusionprotein的位置及存在,另外也能利用生物分子之间的特殊作用力标定特定DNA序列的位置.例如有研究就利用bacteriallacrepressorprotein（lacI）跟其DNA目标之间的特殊强结合力来标定lacI的目标基因.

GFP的barrel-likestructure能确保GFP在fusionprotein中的结构及其发光的性质,使其适宜接在不同fusionprotein中表现.但利用GFP有期限制性,因为要将GFP折叠成具有活性（会发光）的形状可能会花较长的时间,这使得应用GFP在短生命周期的蛋白研究中相形困难.

6.Monitoringofgeneexpression

将GFP当作报告子基因在生医研究上有很多的应用,主要分成下列两种:

1、测知transcriptase或reversetranscriptase的存在

2、Promoter强度之研究

7.信号转导

新近研究发现,某些突变的GFP能够发生荧光共振能量转移（fluorescenceresonanceenergytransfer,FRET）。

FRET是一种从荧光分子的激发状态到临近基态接受分子之间量子力学能量转移的现象。

FRET发生的前提条件是,荧光接受分子必须在荧光提供分子释放态所具有的波长范围内接受能量。

如果供应分子和接受分子相互定位在几个纳米之内,则非常利于FRET的产生。

因为FRET对于两个荧光分子相互间的定位和距离高度敏感（在纳米范围内）。

两个分子间微小的线性或空间定位关系的破坏可以强烈地改变能量转移的效率。

我们可以通过偶联GFP到适当的转录因子、跨膜受体、细胞间信号转导指示分子,来动态观测活细胞的生理功能。

8.改进GFP的应用前景

野生型GFP合成后需经一定的折叠过程形成正确构象后才有功能,而且在470nm处的荧光强度相对较低。

为了改善GFP荧光特性（如摩尔吸收值及释放波谱）,对GFP进行了突变和重组实验。

研究人员合成了高GC含量的特殊GFP,并且发现这种GFP有更强的荧光强度。

此外,用人蛋白质中偏爱的密码子替代相应的野生型GFP中密码子可提高GFP在哺乳动物中的表达效率。

许多GFP突变蛋白,不仅改变了激发和释放波谱,而且提高生色团形成的效率、溶解度、蛋白质表达等。

检测特定类型的细胞、细胞器或特定的细胞内区域中的pH值。

这样开创了检测以前所不能到达部位pH值的可能性。

到目前为止,荧光蛋白已有非常广泛的应用,GFP可应用于转染细胞的确定,体内基因表达的测定,蛋白质分子的定位和细胞间分子交流的动态监测,免疫分析、核酸碱基探针分析,以及分子间第二信使钙离子和cAMP水平的指示,细胞间隙pH变化的检测。

另外,GFP也可以和其他蛋白质形成融合蛋白,作为基因治疗检测指标。

但是,GFP在应用中还发现有许多问题亟待解决:

（1）荧光信号强度的非线性性质使得定量非常困难,

（2）多数生物具有微弱的自发荧光现象,并有着类似的激发和发射波长,这个荧光背景会影响某些GFP的检测,（3）实验中发现很难建成GFP稳定细胞株,可能与GFP参与细胞凋亡过程有关。

9.光伏发电

瑞典研究人员不再盯着植物作为样板，转而将目光投向拥有高超光伏转化能力的水母，开发出提升收获太阳能的技术。

利用水母身上提取的绿色荧光蛋白（GFP），该小组制作的装置可用这些“黏黏绿”将紫外光转化为自由电子。

该小组制造的电池由在二氧化硅基底上被一个小缝隔开的两个简单的铝电极组成，GFP置于两电极中间并起连接作用。

当把紫外光放进来的时候，GFP不断将光子抓走，并产生电子进入电路产生电流。

同时，GFP非常廉价，不需要昂贵的添加剂或昂贵的加工，此外，它还能被封装成独立的不需要外光源的燃料电池。

科学家相信，此能源装置缩小后可用来驱动微小的纳米设备。

绿色荧光蛋白-GFP的实际应用

1.绿色荧光蛋白

来源于水母Aequoreavictoria的绿色荧光蛋白（greenfluorescentprotein,GFP）现已成为在生物化学和细胞生物学中研究和开发应用得最广泛的蛋白质之一.其内源荧光基团在受到紫外光或蓝光激发时（λmax=395nm,小峰在479nm）可高效发射清晰可见的绿光.GFP的高分辨率晶体结构为了解和研究蛋白质结构和光谱学功能关系提供了一个极好的机会.GFP已成为一个监测在完整细胞和组织内基因表达和蛋白质定位的理想标记.通过突变和蛋白质工程构建的GFP嵌合蛋白在生理指示剂、生物传感器、光化学领域以及生产发光纤维等方面展示了广阔前景.

2.应用GFP基因转染技术示踪组织工程技术构建角膜基质

目的应用基因转染技术将绿色荧光蛋白（GFP）标记角膜基质细胞,以此为种子细胞构建角膜基质并对构建过程进行示踪.方法构建携带EGFP基因的重组逆转录病毒载体PLNCX2-EGFP,转染兔角膜基质细胞,然后将该细胞接种于PGA,形成细胞-生物材料复合物,移植于母兔角膜基质板层内.术后8周,组织学切片,HE染色,荧光显微镜下对绿色荧光蛋白（GFP）进行示踪观察.结果8周后,组织工程化角膜组织形成,组织学切片显示PGA完全降解,新生组织形成,组织排列规整,荧光显微镜下见新生组织呈绿色,提示EGFP表达.结论组织工程角膜基质的组织学结构与角膜基质相类似.新生组织表达GFP,证实组织工程角膜基质组织的构成源于供体细胞.

3.绿色荧光蛋白标记检测枯草芽孢杆菌在水体中的存活动态

基于生物-化学协同控制植物病害的原理,构建了一种由枯草芽孢杆菌和烯酰吗啉组成的对辣椒等作物疫病具有较好的防治效果的菌药合剂（DMBS）.按照农药降解研究基本规则,采用绿色荧光蛋白（greenfluorescentprotein,GFP）标记技术和细菌学研究方法研究了DMBS在去离子水、地下水、自来水、河水和雨水中的降解动态.结果表明,GFP标记可以用于枯草芽孢杆菌在5种水环境中的存活检测.在（25±1）℃条件下,枯草芽孢杆菌菌剂和DMBS中的枯草芽孢杆菌数量主要表现为前12d迅速下降,此后则随时间的延长在一定的范围内呈变动的上升或下降趋势.在（50±1）℃灭菌和不灭菌的条件下,均表现为前12d迅速下降,12d后趋于稳定或缓慢下降.枯草芽孢杆菌在5种水中的降解速度较慢,在（25±1）℃和（50±1）℃条件下存放86d后,其含量均在104cfu/mL以上.培养温度和灭菌条件对枯草芽孢杆菌在不同水体中存活动态有一定的影响,菌药合剂中的烯酰吗啉对该菌的存活则没有显著影响.

4.一种基于绿色荧光蛋白的蛋白酶体抑制剂细胞筛选模型

为建立基于绿色荧光蛋白（GFP）的药物筛选模型,并用此模型从包括中药提取物在内的化合物中筛选新型蛋白酶体抑制剂,本研究构建了pGC-E1-ZU1-GFP融合蛋白慢病毒表达载体并感染A549细胞,筛选稳定表达细胞株,用已知蛋白酶体抑制剂PS-341处理细胞,荧光显微镜检测处理前后细胞GFP水平变化.结果获得了稳定表达pGC-E1-ZU1-GFP的A549细胞,这些细胞用PS-341处理24h后用荧光显微镜检测.发现细胞绿色荧光强度相对于对照组明显增强.利用这一模型对一些化合物进行筛查,发现了一些新的蛋白酶体抑制剂.

5.绿色荧光蛋白标记的D-氨基酸氧化酶基因在人宫颈癌细胞中的表达研究

为了探讨绿色荧光蛋白标记的红色酵母D-氨基酸氧化酶（DAAO）基因在人宫颈癌细胞（HeLa细胞）中的表达及其功能,采用基因重组技术构建了含有CMV启动子和EGFP、DAAO基因开放阅读框（ORF）的真核表达载体pIRES-DAAO.脂质体法转染HeLa细胞,荧光显微镜下观察转染细胞中绿色荧光蛋白的表达,流式细胞术分析转染效率并筛选荧光阳性细胞,命名为HeLa-D.以不同浓度的前药D-Ala处理HeLa-D细胞,MTT法检测细胞存活率.结果显示,荧光显微镜下可见绿色荧光蛋白在HeLa-D细胞中表达,流式细胞术成功筛选出HeLa-D细胞.前药D-Ala能明显杀伤HeLa-D细胞.结果表明,EGFP可作为报告基因快速筛选DAAO表达载体转染的细胞,DAAO/D-Ala自杀基因系统可进一步用于肿瘤的基因治疗研究.

6.利用绿色荧光蛋白进行microRNAs靶点分析的研究

目的利用绿色荧光蛋白作为报告基因,研究微RNAs（microRNAs）与靶点相互作用.方法在pEGFP-C1下游非编码区插入含miR-122a作用靶序列HCV5′UTR,构建pEGFP-UTR载体,将miR-122a与pEGFP-UTR共转染HEK293细胞,观察增强绿色荧光蛋白EGFP表达强度变化,并与双荧光素酶报告系统比对.结果miR-122a能明显抑制含UTR靶序列的EGFP蛋白表达,与双荧光素酶报告系统相比,绿色荧光蛋白在检测灵敏度上与双荧光素酶相接近.结论利用绿色荧光蛋白作为报告基因,能够清楚直观反映miRNAs与靶点作用情况.

7.绿色荧光蛋白标记成人骨髓间充质干细胞的超微结构特征

背景:

研究表明,绿色荧光蛋白标记的骨髓间充质干细胞免疫学表型、细胞周期、分化潜能等均未发生明显改变.目的:

进一步观察绿色荧光蛋白标记对骨髓间充质干细胞超微结构的影响.方法:

分离培养成人骨髓间充质干细胞,抗CD34、抗CD105免疫细胞化学染色鉴定,选第3代细胞进行绿色荧光蛋白标记,超薄切片后用透射电镜观察细胞超微结构,以未经绿色荧光蛋白标记骨髓间充质干细胞为对照.结果与结论:

骨髓间充质干细胞表达CD105,不表达CD34.绿色荧光蛋白标记后,骨髓间充质干细胞细胞质发出绿色荧光,绿色荧光主要集中于细胞核周围的胞浆内,远离细胞核的胞浆内荧光强度逐渐减弱.相对于未标记的骨髓间充质细胞,经绿色荧光蛋白标记后细胞粗面内质网、高尔基体等细胞器较多,而线粒体相对较少;另外,脂滴和"空泡"样结构也多一些.结果证实绿色荧光蛋白对骨髓间充质干细胞性状的影响较为局限,是一种较为理想的细胞标记示踪剂.

8.慢病毒介导绿色荧光蛋白基因转染豚鼠巩膜成纤维细胞的实验研究

目的观察慢病毒载体转染豚鼠巩膜成纤维细胞的有效性及对细胞活性的影响.方法转染组用慢病毒携带绿色荧光蛋白（lentiviralmediatedgreenfluorescentprotein,Lenti-GFP）转染豚鼠巩膜成纤维细胞,对照组加入空白培养液,转染组按最佳感染复数（multiplicityofinfection,MOI）为50、100、200、400加入Lenti-GFP,转染2d、3d、4d、5d、6d和7d后,在倒置显微镜下观察绿色荧光蛋白表达情况,流式细胞仪检测转染效率,MTT法检测病毒对细胞增殖的影响.结果Lenti-GFP转染细胞后48h可以看见绿色荧光；在同一MOI值下,随时间延长转染效率增高,第5天达到高峰；在MOI为400,转染5d时转染效率达82.86％；转染5d行MTT检测显示:

MOI为50～400时,同一转染时间各组IOD值与对照组比较,差异均无统计学意义（均为P＞0.05）.结论慢病毒载体可以在体外稳定而有效地转染豚鼠巩膜成纤维细胞,且不影响细胞活性,是巩膜成纤维细胞理想的基因转染载体.

9.3个不同品系小鼠ES细胞的绿色荧光蛋白标记

用电穿孔法将线性化的质粒pEGFP-N3分别导入来自129/ter、C57BL/6J和BALB/c3个品系的小鼠胚胎干细胞MESPU-13、MESPU-35和MESPU-62中,经G418筛选、荧光显微镜镜检、阳性克隆扩增、流式细胞仪分选、再扩增以及核型分析等过程,分别得到核型大于85%的被EGFP稳定标记的细胞株5个（129/ter2个、C57BL/6J1个、BALB/c2个）,分别命名为MESPU-13/G1和MESPU-13/G2、MESPU-35/G1、MESPU-62/G1和MESPU-62/G2.从不同品系中各选一个增殖生长快、形态典型的标记细胞株,进行碱性磷酸酶染色、oct4基因产物的表达检测、类胚形成和体内分化鉴定,结果表明所得到的核型正常的、稳定标记的ES细胞系具有原ES细胞的典型特征.

10.共表达O型FMDV衣壳蛋白和绿色荧光蛋白重组腺病毒的构建

为构建表达O型口蹄疫病毒（FMDV）的P12A3C基因及GFP基因的重组腺病毒rAdV-P12aEGFP2a3C,本研究以FMDV的2A基因序列为Linker,将报告基因EGFP插入FMDV的P12A与3C之间.重组腺病毒感染HEK-293细胞后可以观察到绿色荧光,表明EGFP蛋白获得表达.应用FMDV的VP2单克隆抗体4B2对重组病毒感染细胞进行westernblot检测,反应条带与FMDV衣壳蛋白VP0和VP3的分子量大小相符,表明FMDV的完整衣壳蛋白和3C蛋白酶也均获得表达,而且EGFP的插入并未影响P1蛋白的表达和3C蛋白酶对P1的正确切割.重组腺病毒的生长特性分析表明,EGFP的插入也未影响该重组腺病毒的增殖特性.上述研究结果显示,表达FMDV衣壳蛋白P12A3C的重组腺病毒可以作为载体,以2A蛋白作为Linker表达一个小分子蛋白,为改进以腺病毒为载体的口蹄疫基因工程疫苗提供了新思路.

11.肿瘤细胞中表达的GFP蛋白的荧光漂白特性的研究

GFP作为生物源性荧光探针具有其他荧光标记物所无法比拟的优势,目前已广泛应用于生物学研究的各个领域.利用常规转染方法将带有EGFP基因的质粒载体导入人肺腺癌肿瘤细胞（ASTC-a-1）,并得到GFP稳定表达的细胞株.研究中发现,肿瘤细胞中表达的GFP长时间暴露于强激发光中会发生非常强列的荧光漂白作用,并且这种漂白作用是不可恢复的.对不同强度的激发光（饱和光源、阻断片ND4/ND8/ND16）对GFP的漂白作用进行了研究,并对冷冻保存样品的光漂白作用进行了初步的探讨.

12.利用绿色荧光蛋白标记革兰氏阴性细菌的研究

构建了具有不同抗性且能够组成型表达绿色荧光蛋白的一系列转座子质粒pTnMod-OCm-G、pTnMod-OTc-G、pTnMod-OKm3-G和pTnMod-OGm-G,并通过三亲本杂交的方法,成功地将荧光蛋白基因分别插入到多环芳烃降解菌株Sphingomonassp.12A和Pseudomonassp.12B的基因组内,获得了具有降解多环芳烃特性,同时在没有抗生素选择压力下连续传代多次仍能够稳定组成型表达荧光的转化子.结果表明,该系列转座子不仅适合其它革兰氏阴性菌的遗传标记,也为进一步研究降解菌在污染环境中的存活能力和生态安全奠定了基础.