慢病毒载体介导GFP标记大鼠骨髓间充质干细胞.docx
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慢病毒载体介导GFP标记大鼠骨髓间充质干细胞
慢病毒载体介导GFP标记大鼠骨髓间充质干细胞
作者:
魏峰,马爱群,王亭忠,张静
【摘要】目的探究慢病毒载体介导绿色荧光蛋白(greenfluorescentprotein,GFP)标记大鼠骨髓间充质干细胞(mesenchymalstemcells,MSCs)的理想条件,以获得稳定高表达GFP的MSCs亚群。
方法慢病毒载体介导GFP以25、50、100、200和400的感染复数(multiplicityofinfection,MOI)分别作用12h和24h感染MSCs,倒置荧光显微镜及流式细胞术检测各组的感染效率和荧光强度,MTT法评价感染对MSCs增殖的影响,从而确定理想的感染条件。
平皿克隆套环法挑选理想条件下感染的MSCs单克隆。
结果MOI为100、200和400作用24h时,感染效率较高,分别为88.94%、99.65%、99.42%;MOI为100和200时,感染对MSCs增殖无影响,MOI为400时,感染的MSCs增殖减慢。
挑选MOI为200、作用24h感染组的单克隆细胞,其1月时感染效率为99.95%,且荧光均一、强度很强。
结论MOI为200作用24h是慢病毒载体介导GFP标记MSCs的理想条件;通过细胞单克隆技术可获得稳定高表达GFP的MSCs亚群。
【关键词】间充质干细胞;慢病毒载体;绿色荧光蛋白;单克隆
ABSTRACT:
ObjectiveTodeterminetheoptimalconditionforlabelingratbonemarrowmesenchymalstemcells(MSCs)withgreenfluorescentprotein(GFP)infectionbylentiviralvectorsoastoestablishasubgroupofMSCswhichhaveahighlevelofGFPexpression.MethodsMSCswereinfectedwithGFPbylentiviralvectorfor12hor24hatdifferentMOI(25,50,100,200and400).Theinfectionefficiencyandfluorescenceintensitywereanalyzedbyinvertedfluorescentmicroscopyandflowcytometry.TheeffectofinfectionatdifferentMOIonproliferationofMSCswasevaluatedbyMTT.Basedonthosementionedabove,wecoulddeterminetheoptimalconditionforinfection.ThensinglecellclonesofMSCslabeledwithGFPunderoptimalconditionwereselectedbyusingcloningrings.ResultsTheefficiencyofinfectionfor24hatMOI100,200and400was88.94%,99.65%and99.42%,respectively.TheinfectionhadnosignificanteffectontheproliferationofMSCsinfectedatMOI100or200,comparedwithMSCswithoutinfection.However,thoseMSCsinfectedatMOI400proliferatedslowly.TherateofGFPexpressiononsinglecellcloneofMSCsinfectedfor24hatMOI200was99.95%,andtheirfluorescenceintensitywasstronganduniform.ConclusionInfectionfor24hatMOI200isoptimalforlabelingratbonemarrowMSCswithGFPbyalentiviralvector.AsubgroupofMSCswhichhaveastablyhighlevelofGFPexpressioncanbeobtainedbysinglecellcloningtechnique.
KEYWORDS:
mesenchymalstemcell;lentiviralvector;greenfluorescentprotein;monoclone
骨髓间充质干细胞(mesenchymalstemcells,MSCs)是一种来源于中胚层具有多向分化潜能的成体干细胞,在一定条件下可分化为软骨细胞[1]、神经细胞[2]、胰岛细胞[3]、肺上皮细胞[4]等各胚层的组织细胞。
目前已成为再生医学研究中的热点细胞。
然而稳定高效标记MSCs是进行体内示踪研究亟待解决的关键问题。
慢病毒载体介导的转基因具有效率高、外源基因长期稳定表达、安全性好[5]等优点。
因此,我们拟通过慢病毒载体介导绿色荧光蛋白(greenfluorescentprotein,GFP)来标记大鼠骨髓MSCs,探讨其标记的理想条件,从而建立稳定高表达GFP的MSCs亚群,为体内深入研究MSCs的分化行为奠定基础。
1材料与方法
1.1材料低糖DMEM(DulbeccosmodifiedEaglesmedium)和胎牛血清购自Gibco公司;Percolls细胞分离液(1.131g/mL)购自Pharmacia公司;四甲基偶氮唑蓝(MTT)和二甲基亚砜(DMSO)均购自Sigma公司;携带GFP的慢病毒载体pGCFUGFPLV购自上海吉凯基因化学有限公司。
克隆环为Corning公司生产;酶标仪为美国BioTek公司生产;流式细胞仪为美国BD公司生产。
1.2方法
1.2.1大鼠骨髓MSCs的培养及表面标志鉴定参照文献方法[6],主要采用Percolls密度梯度离心结合贴壁培养法分离纯化大鼠骨髓MSCs,流式细胞术检测2代MSCs表面CD34、CD45、CD54、CD90的表达。
1.2.2慢病毒载体介导GFP感染MSCs将3代MSCs制成单细胞悬液,连续计数3次,取平均值为最终细胞密度。
将细胞稀释为1×104个/mL,接种于96孔板中(2个时间点,5个MOI梯度,每个梯度3个复孔,共30个孔),每孔200μL,培养16h后,各孔以25、50、100、200、400的MOI加入携带GFP的慢病毒载体,分别感染12h和24h,PBS冲洗5遍,换为不含病毒载体的完全培养基继续培养,以后每天观察感染结果。
1.2.3流式细胞仪检测GFP的感染效率将MOI为100、200、400感染24h的MSCs制成单细胞悬液,20g/L的多聚甲醛固定10min,流式细胞仪测定GFP的表达率及平均荧光强度,未感染的MSCs作为对照。
1.2.4MTT法检测感染后的MSCs增殖情况MOI为100、200、400感染24h的MSCs和未感染的MSCs共4组,每组7孔,每孔3个复孔,每孔接种1×103个细胞。
培养24h后,加入浓度为5mg/mL的MTT20μL,培养4h后弃去培养液,加入DMSO200μL,震荡培养10min,用全自动酶标仪测定波长490nm处的吸光度(A值),连续检测6d,记录A值。
1.2.5GFP标记的MSCs的克隆培养将MOI为200作用24h感染的MSCs制成密度为10个/mL的单细胞悬液。
取5mL接种至已补加DMEM和100mL/L血清的90mm培养皿中,轻轻晃动培养皿,使细胞分布均匀,置于培养箱中培养。
16h后,观察标记单个细胞。
约1周后,单个细胞可形成80~100个细胞的克隆集落。
标记生长良好、荧光强度较强且周围较大范围内无其他细胞生长的单克隆集落。
弃去旧培养基,用沾有少许灭菌凡士林的克隆环准确套住标记的单克隆集落。
于克隆环中消化细胞,将细胞悬液转移至预先加有完全培养基的24孔培养板中扩大培养。
1.2.6统计学分析采用SPSS17.0统计软件进行统计处理,组间比较采用重复测量设计方差分析,组间两两比较采用Dunnettt检验,显著性水平α=0.05。
2结果
2.1MSCs的形态学特征及表面标志鉴定第2代MSCs呈典型的成纤维细胞样形态,分布均匀(图1),其表达CD54和CD90,不表达CD34和CD45[6]。
在整个传代培养过程中,细胞始终保持其成纤维细胞样的形态和较强的增殖能力。
2.2慢病毒载体介导GFP感染MSCs
2.2.1感染后MSCs形态变化MOI为25、50、100、200、400作用12h及MOI为25、50、100作用24h的感染组未发现细胞死亡及细胞形态改变(图2A)。
作用24h,MOI为200的感染组细胞形态基本无明显改变,偶见个别细胞呈中毒样改变(图2B);MOI为400的感染组可见部分细胞死亡,一些细胞胞体皱缩,表面粗糙,有颗粒样物质沉积(图2C)。
A:
MOI为100,细胞形态无明显改变;B:
MOI为200,细胞形态基本无改变,偶见个别细胞呈凋亡样改变;C:
MOI为400,可见较多细胞死亡,部分细胞呈凋亡样改变。
2.2.2感染后MSCs中GFP的表达感染后4d,可见较弱的绿色荧光;6d时GFP表达达到高峰,后维持在此高水平。
感染后7d,MOI为25、50、100、200、400作用12h及MOI为25、50作用24h的感染组感染率相对较低,且荧光强度较弱。
作用24h,MOI为100的感染组感染率超过80%,MOI为200和400的感染组感染效率超过90%,且荧光强度较强(图3)。
经流式细胞术分析,作用24h,MOI为100、200和400的感染组感染效率分别为88.94%(图4A)、99.65%(图4B)和98.88%(图4C),平均荧光强度分别为194.87、818.38和586.79。
2.3GFP感染对MSCs增殖的影响感染后1~6d,与未感染的MSCs(MOI为0)相比,作用24h,MOI为100和200的感染组细胞生长速度无明显变化;MOI为400的感染组细胞生长速度相对较慢,4d后生长速度则明显加快。
MTT检测结果显示:
各组细胞在接种后24h,开始进入明显的增殖期,MOI为400的感染组,细胞增殖相对较慢,4d后生长速度明显加快(图5)。
经统计学分析,MOI为400的感染组,相对未感染组细胞增殖较慢(P=0.001);MOI为100和200的感染组,相对于未感染组细胞增殖无显著性差异(P=0.285,P=0.070)。
2.4感染1月后GFP在MSCs中的表达MOI为200作用24h的感染组感染后1月,细胞仍保持成纤维细胞样形态,GFP的表达仍维持在较高的水平,但荧光强度稍有减弱,且荧光强弱不等。
经流式细胞仪检测分析,GFP的表达率为99.38%,平均荧光强度为785.32(图4D)。
图4不同感染条件及观察时间MSCs的感染效率及荧光强度分析
Fig.4Analysisofinfectionefficiencyandfluo
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