生物制品化学检定规程.docx
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生物制品化学检定规程
生物制品化学检定规程
本规程载入的化学检定项目,如采用其他方式测定,其结果与本规程所列应无显著不同。
如遇制品质量存在疑问时,其最后判定应以本规程所列方式测定结果为准。
标准液的配制与标定方式参看最新版《中国药典》。
pH值测定(电位法)
1仪器校准(定位)用标准缓冲溶液
应利用分析纯标准缓冲物质配制。
1.1 0.05mol/L邻苯二甲酸氢钾溶液
称取于115土5℃干燥2~3小时的邻苯二甲酸氢钾(KHC8H4O4)10.12士,溶于蒸馏水,并稀释至1000ml。
1.2 /L磷酸氢二钠和/L磷酸二氢钾混合溶液
别离称取在115土5℃干燥2~3小时的磷酸氢二钠(Na2HPO4)3.53土0.01g和磷酸二氢钾(KH2PO4)3.39士0.01g,溶于预先煮沸过15~30分钟并迅速冷却的蒸馏水中,并稀释至1000ml。
1.3 0.01mol/L硼砂溶液
称取硼砂(Na2B4O7·10H2O)3.80士0.01g(注意:
不能烘!
),溶于预先煮沸过15~3O分钟并迅速冷却的蒸馏水中,并稀释至1000ml。
置聚乙烯塑料瓶中密闭保留。
标准缓冲溶液于0~50℃的标准PH值
温度(℃) 0、O5mol/L邻苯二甲酸氢钾 /L混合磷酸盐 /L硼砂
0 4.01 6.98 9.46
5 4.00 6.95 9.39
10 4.00 6.92 9.33
15 4.00 6.90 9.28
20 4.OO 6.88 9.23
25 4.OO 6.86 9.18
30 4.01 6.85 9.14
35 4.02 6.84 9.10
40 4.03 6.84 9.O7
45 4.04 6.83 9.04
50 4.O6 6.83 9.02
2操作
利用玻璃电极酸度计测定,操作方式按仪器说明书进行。
用两种标准缓冲溶液校正或核对,相差不得超过0.05。
固体总量测定
甲、105℃干烤法
1操作
精准量取必然体积样品于干燥至恒重的扁称量瓶中,置105℃烤箱中烘至恒重。
2计算
烘干后样品重量
样品固体总量%(g/ml)=-----------*100
样品m1数
乙、50℃干烤法
1操作
精准量取lml A群脑膜炎球菌多糖菌苗半成品原液于已干燥至恒重的称量瓶(2x2.5cm)中,置50℃干燥箱中,干燥至恒重。
2计算
同105℃干烤法。
半微量定氮法
1试剂
l.1硫酸
化学纯,比重1.84。
1.2消化剂
硫酸铜(CUSO4·5H2O)1份与硫酸钾(K2SO4)10份一路研细混匀即成。
1.312.5mol/L氢氧化钠液
取氢氧化钠500g,加蒸馏水至1000ml,摇匀。
1.4 2%硼酸吸收液
硼酸20g加蒸馏水使溶解成1000ml,加混合指示剂10ml,摇匀。
1.5混合指示剂
0.2%(g/ml)溴甲酚绿酒精溶液5份与0.1%(g/ml)甲基红酒精溶液2份混合配成。
1.6标准0.0lmol/L盐酸或0.005mol/L硫酸溶液。
2操作
2.1消化
准确量取必然体积样品(含氮量在1~2mg左右)于凯氏定氮瓶中,加消化剂约,浓硫酸1.0ml进行消化,至澄明蓝绿色,继续消化约60分钟,同时做空白。
2.2蒸馏与滴定
取10ml硼酸吸收液于100ml三角瓶内,将凯氏蒸馏器冷凝管结尾浸入硼酸吸收液内,将消化好的样品移入凯氏蒸馏器内,用蒸馏水洗定氮瓶3~4次,洗液亦移入蒸馏器内,再加5ml/L氢氧化钠溶液,然后进行蒸馏,待接收液整体积约35~50ml,将冷凝管结尾掏出液面,让蒸汽冲洗约1分钟,再用少量蒸馏水冲洗冷凝管结尾,接收液用标准0.01mol/L盐酸或0.005mol/L硫酸进行滴定,至溶液显著变色。
3计算
(样品滴定数-空白滴定数)x标准盐酸mol/L×14
样品总氮含量(mg/ml)-——————————————————————
样品ml数
附注
1.蒸馏前应蒸洗蒸馏器15分钟。
2蒸汽发生瓶内应加数滴硫酸及甲基红指示剂至呈明显红色。
蛋白质含量测定
甲、钨酸沉淀法
1试剂
1.110%钨酸钠溶液
取钨酸钠10g,加蒸馏水使溶解成1OOml。
1.20.33mol/L硫酸溶液
量取化学纯硫酸1.86ml,缓缓注入适量的蒸馏水中,待冷加水稀释至100ml。
1.3/L氯化钠溶液
取氯化钠9g,加蒸馏水使溶解成1000ml。
2操作
2.1钨酸除蛋白质
精准量取样品2ml加蒸馏水14ml,加10%钨酸钠2ml,0.33mol/L硫酸2ml,摇匀,静置30分钟过滤。
2.2精准量取样品lml,用0.145mol/L氯化钠溶液准确稀释至每ml含氮量1mg左右。
2.3精准量取稀释液lml及除蛋白质滤液5ml,别离移入凯氏定氮瓶中,用半微量定氮法测定样品的总氮及非蛋白氮含量。
3计算
样品总氮含量(mg/ml)=(样品滴定数-空白液定数)×标准盐酸mol/L×14×稀释倍数
样品非蛋白氮含量(mg/ml)=(样品滴定数-空白滴定数)×标准盐酸mol/L×14×2
样品蛋白质含量%(g/ml)=(总氮一非蛋白氮)×6.25×1/10
附注
1.样品蛋白质含量如超过10%(g/ml),除蛋白质时应适当加大样品稀释倍数,10%钨酸钠及mol/L硫酸用量相应地按比例增加,使溶液钨酸浓度仍维持1%。
2.总氮与非蛋白氮可用同一空白。
乙、三氯醋酸沉淀法
1试剂
12%三氯醋酸溶液
取三氯醋酸12g,加蒸馏水溶解至100ml。
2操作
精准量取必然体积的样品(含蛋白质6~12mg左右)于10ml尖底离心管中,加等体积的12%三氯醋酸混匀,放置半小时后3000r/min离心30分钟,倾净上清,沉淀用蒸馏水约3ml(分数次)洗人凯氏烧瓶,按半微量定氮法测定氮含量。
3计算
(样品滴定数-空白滴定数)×标准盐酸mol/L×14
样品蛋白质含量(mg/ml)=————————————————————————×
样品ml数
丙、微量法(Lowry法)
1试剂
4%碳酸钠溶液
取4g碳酸钠,加蒸馏水溶解成100ml。
1.20.2mol/L氢氧化钠溶液
取0.8g氢氧化钠加蒸馏水,溶解成100ml。
1.30.04mol/L硫酸铜溶液
取1g加蒸馏水溶解成100m1。
1.42%酒石酸钾(或0.lmol/L酒石酸钠)
取2g酒石酸钾(或酒石酸钠),加蒸馏水溶解成100ml。
1.5碱性铜液
临用前取试剂1.1和各25ml,试剂1.3和1.4各0.5ml混匀配制而成。
1.6酚试剂
称取1009钨酸钠(Na2WO4·2H2O),259钼酸钠(Na2MoO4·2H2O),置1500ml烧瓶中,加入700ml蒸馏水,50ml85%磷酸及100ml浓盐酸,上联回流管(利用木塞或锡纸包裹的橡皮塞)微沸回流10小时,取下回流管,加入1509硫酸钾,50ml蒸馏水,几滴溴液,煮沸约15分钟,驱除过量的溴。
冷却,加蒸馏水稀释至1000ml,过滤,为酚试剂贮备液。
酚试剂贮备液经标准氢氧化钠液滴定,测定酸浓度,而后用蒸馏水稀释至相当lmol/L盐酸浓度,即为酚试剂。
1.7标准蛋白质溶液
取牛血清白蛋白标准品(由检定所统一标定发给),准确稀释至lmg/ml(含0.02%NaN3),为标准蛋白质贮备液。
精准量取标准蛋白质贮备液2.5ml于25ml容量瓶中,用含0.02%NaN3的蒸馏水稀释至刻度,为标准蛋白质溶液(100μg/ml)。
2操作
2.l样品
精准量取必然体积样品(含蛋白质50μg左右)于试管中,加5ml碱性铜液,混匀,于室温放置10分钟,快速加入0.5ml酚试剂,摇匀,于室温放置30分钟,用650nm波长或红色滤光片比色(呈色后,如发现混浊,经3000r/min离心15分钟后再比色)。
2.2标准曲线
精准量取标准蛋白质溶液(10Oμg/ml)0、0.二、0.4、0.六、0.八、1.0ml,别离置于试管中,加蒸馏水补至lml,其余操作一样品,可得一标准曲线。
3计算
从标准曲线查出样品相当标准蛋白质溶液之ml数A;
A×%
样品蛋白质含量(g/ml)=————————————
样品ml数
附注
检测A群脑膜炎多糖抗原半成品原液可取lml(含抗原3~10mg)。
硫酸铵含量测定
1试剂
lmol/L氢氧化钠液
取化学纯氢氧化钠20g,加蒸馏水溶解成500ml。
2操作
2.1除蛋白质
方式同蛋白质含量测定。
2.2蒸馏
精准量取除蛋白质滤液10ml于凯氏蒸馏器内,加lmol/L氢氧化钠lml,加少量蒸馏水,按半微量定氮法进行蒸馏、滴定。
3计算
样品硫酸铵含量%(g/ml)=(样品滴定数-空白滴定数)×标准盐酸mol/L×14××1/10
氯化钠含量测定
1试剂
1.10.lmol/L硝酸银溶液
取硝酸银17g,加蒸馏水溶解成1000ml。
1.2标准0.05mol/L硫氰酸铵溶液
5.5mol/L硝酸
1.48%硫酸铁铵指示液
取8g硫酸铁铵,加蒸馏水溶解成100ml。
饱和高锰酸钾
取高锰酸钾6.5g,加蒸馏水溶解成100ml。
2操作
2.1精准吸取样品lml,准确加入/L硝酸银溶液5ml,混匀,(蛋白质含量高者加2ml饱和高锰酸钾),加10ml硝酸(5.5mol/L),直接加热消化至溶液澄清为止。
待冷,加蒸馏水50ml,8%硫酸铁铵指示液lml,用标准0.05mol/L硫氰酸铵溶液滴定至溶液呈淡棕红色,振摇后仍不褪色,即为终点。
2.2空白实验
准确量取L硝酸银溶液5ml,加硝酸(5.5mol/L)10ml,可不消化,其余操作一样品。
3计算
样品氯化钠含量%(g/ml)=(空白滴定数-样品滴定数)×硫氰酸铵mol/L×
钠离子含量测定(火焰光度法)
1试剂
标准钠溶液:
精准称取于110℃干燥至恒重的NaCl2.92279,用双蒸水溶解并稀释至1000ml,为50mmol/L标准钠溶液。
2操作
样品
精准量取样品于50ml容量瓶中,用蒸馏水稀释至刻度,于火焰光度计,589nm波长(或黄色滤光片)测其透光度。
2.2标准曲线
精准量取标准钠溶液0.九、1.一、、、1.7ml于50ml容量瓶中,用蒸馏水稀释至刻度,钠含量别离为O九、、1.3、、1.7mmol/L,其余操作一样品。
3计算
由标准曲线上查出稀释后样品钠含量为Ammol/L。
样品钠含量(mmol/L)=A×100
钾离子含量测定(火焰光度法)
1试剂
标准钾溶液:
精准称取于110℃干燥至恒重的KCIO.3728g,用双蒸水溶解并稀释至500ml,为10mmol/L标准钾溶液。
2操作
样品
精准量取样品2ml于50ml容量瓶中,用蒸馏水稀释至刻度,于火焰光度计769nm波长(或红色滤光片)测其透光度。
标准曲线
精准量取标准钾溶液、0.30、、0.60、于50ml容量瓶中,用蒸馏水稀释至刻度,钾含量别离为0.03、0.0六、0.0九、0.1二、0.15mmol/L,其余操作一样品。
3计算
由标准曲线上查出稀释后样品钾含量为Ammol/L。
样品钾含量(mmol/L)=A×25
枸橼酸离子含量测定
1试剂
标准枸橼酸钠浓溶液
精准称取枸橼酸钠(N23C6H5O7·2H2O)0.5882g,加蒸馏水溶解,并准确稀释至100ml,为20mmol/L枸橼酸钠液。
l.2标准枸橼酸钠溶液
精密量取标准枸橼酸钠浓溶液5ml,用5%三氯醋酸准确稀释至50ml,为2mmol/L枸橼酸钠标准液。
l.310%三氯醋酸:
称取三氯醋酸10g,用蒸馏水稀释至100ml。
1.45%三氯醋酸:
称取三氯醋酸5g,用蒸馏水稀释至100ml。
1.5砒啶(A·R)。
1.6醋酸酐(A·R)。
2操作
2.l样品
精准量取样品,加4.5ml蒸馏水,加5mll0%三氯醋酸,混匀,置60℃水浴5分钟,离心去沉淀。
精准量取lml上清液于25ml玻塞试管中,加1.3ml吡啶,混匀,加醋酸酐,当即混匀并置于31℃水浴,准确培育35分钟后,于425nm波长下测OD值,同时做空白实验:
取lml5%三氯醋酸代替lml去蛋白后样品上清液,其余操作一样品。
2.2标准曲线
精准量取标准枸橼酸钠溶液、、0.50、、,别离加5%三氯醋酸、0.7五、0.五、0.2五、0.0ml(其相应的枸橼酸钠离子含量为0、、1.0、1.五、2.0mmol/L),其余操作从加13ml吡啶开始一样品。
可得一标准曲线。
3计算
由标准曲线查得样品稀释液相当标准枸橼酸离子Ammol/L。
样品枸橼酸离子含量(mmol/L)=A×20
亚硫酸氢钠含量测定
1试剂
1.1/L碘液
1.2标准mol/L硫代硫酸钠液
0.5%淀粉指示剂
取可溶性淀粉0.5g,加蒸馏水5ml搅匀后,缓缓倾入100ml沸蒸馏水中,随加随搅拌,煮沸,至适成稀薄的半透明液,放置使沉淀,倾取上层清液(配制时可加适当的防腐剂)。
6mol/L盐酸
2操作
精准量取脑炎疫苗5~10ml或必然体积亚硫酸氢钠液(含亚硫酸氢钠左右)于碘瓶中,精准加入/L碘液2Oml,放置5分钟,沿瓶壁加6mol/L盐酸2ml,摇匀,用标准0.1mol/L硫代硫酸钠液滴定至溶液呈浅黄色,加0.5%淀粉指示剂约0.5ml,滴定至蓝色消失,同时做空白。
(空白滴定数-样品滴定数)×硫代硫酸钠mol/L×
样品亚硫酸氢钠含量%(g/ml)=———————————————————————————
样品ml数
附注
如测定样品为亚硫酸氢钠液,只需按照其浓度和取样量,在测按时适当增加/L碘液的用量即可。
氢氧化铝(或磷酸铝)含量测定
甲、滴定法
1试剂
1.1005mol/LEDTA标准液。
1.2标准0.025mol/L锌液
取标准0.05mol/L锌液稀释。
pH4.5醋酸铵缓冲液
称取醋酸铵77.1g,溶于适量的蒸馏水中,加冰醋酸58ml,稀释至1000ml。
1.40.l%二甲酚橙指示剂。
0.95mol/L磷酸
量取磷酸6ml,稀释至100ml。
2操作
精准量取吸附精制类毒素适量(含铝1~10mg),置250ml三角瓶中,加0.95mol/L磷酸,使完全溶解。
必要时于水浴加温(难于溶解时尚可适当增加磷酸量)。
加0.05mol/LEDTA10ml,pH4.5醋酸铵缓冲液10ml,于滚水浴中加热10分钟,冷至室温加0.1%二甲酚橙1ml,用L锌标准液进行滴定,当溶液由亮黄转变成橙色,即为终点。
同时做空白实验。
3计算
(空白液定数一样品滴定数)×标准锌液mol/L×
样品氢氧化铝含量(mg/ml)=————————————————————————————
样品ml数
(空白滴定数-样品滴定数)×标准锌液mol/L×
样品磷酸铝含量(mg/ml)=—————————————————————————————
样品ml数
(空白滴定数-样品滴定数)×标准锌液mol/L×
样品铝含量(mg/ml)=———————————————————————————————
样品ml数
乙、比色法
1试剂
1.1/L磷酸
取磷酸6ml,稀释至100ml。
1.2L盐酸
1.31.2mol/L盐酸
0.2%铝试剂溶液
1.51.3mol/L醋酸铵溶液
1.6标准铝溶液
精准称取钾明矾[KAl(SO4)·12H20]0.3518g,加1.mol/LHCl8ml,加蒸馏水到100ml,为含铝20μg/ml的标准液。
2操作
2.1样品
精密量取吸附制品lml(含铝O.5~lmg)于50ml容量瓶中,加0.95mol/L磷酸1.5ml,使完全溶解(必要时于水浴加温),用水稀释至刻度。
取稀释样品lml于25ml带塞刻度试管中,加1.2mol/L盐酸lml,加水15ml,0.2%铝试剂lml,摇匀,加1.3mol/L醋酸铵溶液5ml,加水至25ml,摇匀,放置15分钟,用530nm波长比色。
2.2标准曲线
取标准铝溶液0、0.2五、、、1.0、1.25ml于25ml带塞刻度试管中,铝含量别离为0、五、10、1五、20、25μg,其余操作一样品管。
绘制标准曲线。
3计算
由标准曲线查出铝含量为Aμg
Al(OH)3(mg/ml)=A×2.8918×50/1000
Al(PO4)(mg/ml)=A××50/1000
附注
边缘制品以滴定法为准。
游离甲醛测定
1试剂
1.1复红亚硫酸试剂
1.1.1取碱性复红4.5g于3000ml三角瓶中加蒸馏水1500ml,振摇或加温使复红全数溶解,待冷后,加10g亚硫酸钠,摇匀,静置5~10分钟,再加入40ml3mol/L硫酸,摇匀,以橡皮塞塞紧瓶口,放置留宿,如有颜色,加骨炭5~10g迅速摇匀,以布氏漏斗快速抽滤。
1.1.2试剂之SO2含量可控制在28~48mmol/L(SO2含量过量可通空气驱除之,过少可通人SO2)。
SO2含量测定:
吸取复红亚硫酸试剂10ml于三角瓶内。
加蒸馏水20ml,%淀粉指示剂5ml,用0.lmol/L碘液滴定至呈浅蓝色。
计算:
SO2mmol/L=50×碘液ml数×碘液mmol/L
1.2混合酸
量取蒸馏水783ml于烧杯内,缓缓注入42ml盐酸,175ml硫酸,混匀。
1.3标准甲醛溶液
为0.005%(g/ml)甲醛溶液。
精准量取已标定的甲醛溶液Vml,于500ml容量瓶中,用蒸馏水稀释至刻度,摇匀,临历时10倍稀释。
500×0,05
V=——————————————
标定甲醛溶液含量%(g/ml)
2操作
2.l样品
精准量取样品lml,用蒸馏水稀释至甲醇含量在0.003%(g/ml)左右。
取稀释液2ml于50ml比色管中加蒸馏水到5ml,加10ml复红试剂,10ml混合酸,摇匀,在25℃放置3小时,用590nm波长比色。
标准曲线
精准量取0.005%(g/ml)标准甲醛溶液0、0.五、、1.五、2.0ml,别离置于50ml比色管中,加蒸馏水至整体积为5ml,其余操作一样品。
可得一标准曲线。
3计算
从标准曲线查出样品相当标准甲醛溶液之ml数A
样品游离甲醛含量%(g/ml)=A××稀释倍数
附注
1标准液和样品与复红试剂的显色时间,有时不一致,测按时,显色慢者应酌情早加复红试剂。
2样品中如含有酚红,标准管中应予以校正。
3可做限度测定。
苯酚含量测定
1试剂
1.1L溴液
取溴酸钾,加3g溴化钾,加蒸馏水溶解成1000ml。
1.225%碘化钾溶液
取碘化钾25g,加蒸馏水溶解成100ml。
1.3标准mol/L硫代硫酸钠溶液
取标准0.lmol/L硫代硫酸钠溶液准确稀释5倍。
1.46mol/L盐酸溶液
淀粉指示剂
取可溶性淀粉0.5g,加蒸馏水5ml,搅匀后,缓缓倾入100ml的滚水中,随加随搅拌,煮沸,至适成稀薄的半透明液,放置,俟沉淀,倾取上层清液(配制时可加适当的防腐剂)。
/L硫酸锌溶液
取硫酸锌5g加蒸馏水溶解成100ml。
1.7饱和氢氧化钡溶液
取氢氧化钡[Ba(OH)2·8H2O]5.6g,加蒸馏水溶解成100ml。
1.80.5%酚酞指示剂
取酚酞0、5g,加乙醇100ml,使溶解即得。
2操作
菌苗类样品
精准量取样品lml于碘瓶中,加入蒸馏水约50ml,精准加入0.02mol/L溴液15~25ml(样品含苯酚量%~0.5%加25ml,小于0.3%则加15ml),沿瓶壁加入盐酸(6mol/L)10ml,摇匀,密塞,在暗处置30分钟后,加25%碘化钾2ml于碘瓶颈口,稍启瓶塞,使流下,密塞,摇匀。
以少量蒸馏水洗瓶颈,用标准/L硫代硫酸钠溶液滴定至溶液呈浅黄色,加淀粉指示剂约0.5ml,滴定至蓝色消失。
同时做空白实验。
人胎盘血丙种球蛋白及疫苗类样品
精密量取除蛋白(方式同蛋白含量测定钨酸除蛋白法)后滤液5ml于碘瓶中,其余操作同2.1项。
2.3人胎盘组织液
精准量取样品5ml于50ml容量瓶内,加适量蒸馏水,加0.5%酚酞指示剂2滴,加5%硫酸锌溶液2ml,饱和氢氧化钡溶液约2.5ml(加至溶液呈粉红色),加蒸馏水稀释至刻度,摇匀,放置30分钟,过滤。
精准量取滤液5ml于碘瓶中,其余操作同项。
3计算
3.l菌苗类样品
苯酚含量%(g/ml)=(空白液定数-样品滴定数)×硫代硫酸钠mol/L×
3.2人胎盘血丙种球蛋白(或人胎盘组织液)及疫苗类样品
苯酚含量%(g/ml)=(空白滴定数-样品滴定数)×硫代硫酸钠mol/L××2
附注
1蛋白类制品由于除蛋白后滤液仍含有小分子物质,对苯酚含量测定有干扰,使结果偏高,边缘制品可用蒸馏法,取除蛋白滤液5ml于凯氏蒸馏器内,接受液为/L溴液15~25ml,蒸馏约20分钟后其余操作同上。
2可做限度测定。
硫柳汞及硝酸汞苯含量测定
1试剂
1.1%双硫腙浓溶液
称取纯净双硫腙50mg,溶于100ml氯仿中,保留于冷暗处。
%双硫腙滴定液
临历时取0.05%双硫腙浓溶液,用四氯化碳稀释至100ml。
1.3浓硫酸
1.4mol/L硝酸溶液
20%盐酸羟胺溶液
1.6标准汞浓溶液
精准称取于H2SO4干燥器干至恒重的氯化高汞(HqCl2分析纯)0.1354g,用0.5mol/LH2SO4溶解并准确稀释至100ml,为lmg汞/ml溶液。
1.7标准汞溶液(50μg汞/ml)
精准量取标准汞浓溶液5ml,用0.5mol/LH2SO4准确稀释至100ml。
2操作
2.1消化
精准量取样品(含汞约50μg)于150ml圆底磨口烧瓶(附长40cm回流管)中,加浓硫酸2ml,5.5mol/L硝酸0.5ml,电炉上加热回流15分钟(或于
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