第四章 灭菌DOC.docx

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第四章灭菌DOC

第四章灭菌（sterilization）

}第一节　灭菌的原理及方法

}第二节　培养基和发酵设备的灭菌工艺

}第三节　空气除菌

}第四节染菌的防治

灭菌：

指用化学或物理的方法杀灭或去除物料及设备中所有生命物质的技术或工艺过程。

第一节灭菌的原理及方法

一、几种常见的灭菌方法

1化学物质灭菌

原理：

药物与微生物细胞中的成分发生反应而具有杀菌作用，如使蛋白质变性或酶失活。

常用的灭菌剂:

使用范围：

器皿、双手和实验室、无菌室的环境灭菌，不能用于培养基灭菌

2.      辐射灭菌

}原理：

利用高能量的电磁辐射与菌体核酸的光化学反应造成菌体死亡。

}常用：

紫外线、X射线和γ射线。

}使用范围：

用于室内空气及器皿表面灭菌

3．干热灭菌

}原理：

利用高温对微生物进行有氧化、蛋白质变性和电解质浓缩作用而杀灭微生物。

}常用方法：

火焰灼烧和电热箱加热，140-180℃

1-2小时

}使用范围：

玻璃及金属用具及沙土管灭菌

4．过滤除菌

}原理：

利用微生物不能透过滤膜除菌。

}方法:

0.01~0.45m孔径滤膜，

}使用范围：

用于压缩空气、酶溶液及其他不耐热化合物溶液除菌。

5．湿热灭菌

}原理：

蒸汽冷凝放出大量潜热，具有穿透力，且在高温有水分条件下，蛋白质易变性。

}常用方法：

水煮常压灭菌：

100℃

饱和蒸汽灭菌：

一般121℃，30分钟

使用范围：

培养基和发酵设备灭菌。

二、湿热灭菌原理

}1.生物热死动力学（对数残留定律）

-dN/dt=KN

N：

残留活菌体个数（个）

t:

灭菌时间（min）

k：

灭菌速率常数（min-1）

dN/dt:

菌受热死亡速率（个/min）

LnN/N0=-KtN/N0=e-Kt

以菌的残留数N/N0的对数与时间t作图，得出一条直线，其斜率为-K（P66图4-5）

如何通过实验根据对数残存定律确定某一温度，某一微生物的K？

2.反应速率常数K

1）.K与菌种的特性有关

相同温度下，微生物越耐热，k值越小。

相同温度下，微生物越不耐热，k值越大。

2）.K与灭菌温度有关

K=Ae–E/RT

（阿累尼乌斯方程）

LnK=LnA-E/RT

A：

比例常数

R：

气体常数（J/molK）

T：

绝对温度（K）

△E：

杀死细菌所需的活化能（J/mol）

第二节培养基和发酵设备的灭菌工艺

}一、培养基灭菌时间的选择

t=1/k×Ln（N0/N）

其中K：

一般耐热的细菌芽孢的K值

N0：

细菌及芽孢数之和

N：

10-3

二、培养基灭菌温度的选择

选择即能达到灭菌要求，又保证营养成分不被破坏的温度

}1.培养基营养成分破坏动力学方程

-dC/dt=K’C

-dC/dt:

营养物降解速度mol/Ls

C:

营养物浓度mol/L

K’:

营养物降解反应速度常数1/s

t：

时间（S）

Ln（C/C0）=-K't

K’=A’e-E’/RTLnK’=LnA’-E’/RT

A’：

阿累尼乌斯常数（s-1）

R：

气体常数8.314J/（molK）

T：

绝对温度（K）

E’：

营养物破坏所需的活化能（J/mol）

2.根据实验结果灭菌活化能大于培养基破坏活化能

E＞E’P68表4-4

3.灭菌反应营养物破坏反应

T1LnK1=LnA-E/RT1LnK1’=LnA’-E’/RT1

T2LnK2=LnA-E/RT2LnK2’=LnA’-E’/RT2

Ln（K2/K1）=E/R（1/T1-1/T2）Ln（K2’/K1’）=E’/R（1/T1-1/T2）

Ln（K2/K1）=E

Ln（K2’/K1’）E’

Ln（K2/K1）＞Ln（K2’/K1’）K2/K1＞K2’/K1’

当温度升高时微生物死亡速度常数比营养物质降解速度常数变化得大

4．达到相同灭菌效果，T越高，K越大，所需t越短，采用高温短时（HTST）灭菌效果好

}三、影响灭菌效果的因素

}微生物种类：

不同的微生物k值不同。

}初始菌量：

在保持N值不变的前提下，t与初始菌量N0的对数成正比。

}培养基成份：

油脂、蛋白质增加微生物的耐热性。

}液体：

传热与混合状况，影响受热均匀度。

}固体：

培养基中固体颗粒的存在影响热穿透。

}泡沫：

蒸汽中空气的存在降低蒸汽分压和灭菌温度。

}pH：

酸性pH下可加快微生物热死速率

四、培养基和发酵设备的灭菌方法

（一）实验室种子培养基灭菌方法

使用高压蒸汽灭菌锅  

手提式灭菌锅。

容量小。

立式或卧式灭菌锅。

容量较大，

一般能装几十瓶或几百瓶。

灭菌柜。

要和蒸汽锅炉配套，

用于大量种瓶培养基的灭菌，

一次能装几百至几千瓶（袋）。

}

（二）分批灭菌（batchsterilization）

}1．定义：

将配制好的培养基输入发酵罐中，用蒸汽加热，使培养基和设备同时灭菌的一种灭菌方式。

也称实罐灭菌。

}2．操作过程：

空罐准备：

清洗、检修和检测。

升温：

把培养基加热到灭菌所需的温度。

保温维持：

在灭菌温度下保持灭菌所需时间。

冷却保压：

把培养基的温度降低到接种的温度，并通入无菌空气保压。

分批灭菌设备示意图

三路进汽：

直接蒸汽从通风、取样和出料口进入罐内直接加热，直到所规定的温度，并维持一定的时间。

这就是所谓的“三路进气”。

四路出汽：

直接蒸汽从排气、接种、进料和消沫剂管排气

温度随灭菌时间的变化

}（三）连续灭菌（continuoussterilization）

1．定义：

将培养基通过专门设计的灭菌器，进行连续流动灭菌后，进入预先灭过菌的发酵罐中的灭菌方式。

2．流程：

1）由热交换器组成的灭菌系统

2）蒸汽直接喷射型的连续灭菌系统

3）由连消塔、维持罐和喷淋冷却组成的灭菌系统

四）连续灭菌与分批灭菌的比较与选择

分批灭菌

优点：

1．不需附加设备

2． 蒸汽利用率高

3． 节约劳动力

 缺点

1． 培养基质量比较差

2．  罐的利用率低

3.冷却水用量大

连续灭菌

优点：

1采用高温快速灭菌法

2．可以把培养基按其性质分开灭菌

3．有利于自动控制

4．节省冷却水

缺点

1．     投资费用高

2．      对物料要求高

3．      蒸汽用量大

选择原则：

1． 培养基成份（易降解成分、液化情况等）

2． 设备状况（冷却面积、传动装置等）

3.动力条件

五、高温对培养基成分的有害影响及其防止

消除高温有害影响的措施

}

（1）采用特殊加热灭菌法（连续灭菌方法）

}

（2）对易破坏的含糖培养基进行灭菌时，应先将糖液与其他成分分别灭菌后再合并；

}（3）对含Ca2+或Fe3+的培养基与磷酸盐先作分别灭菌，然后再混合，就不易形成磷酸盐沉淀；

}（4）对含有在高温下易破坏成分的培养基（如含糖组合培养基）可进行低压灭菌

第三节空气除菌

一、无菌空气的要求

1.空气中的微生物

•空气中的微生物种类以细菌和细菌芽孢较多，也有酵母，霉菌孢子和病毒。

•这些微生物大小不一，一般附着在空气中的灰尘上或雾滴上，空气中微生物的含量一般为103~104个／米3。

•灰尘粒子的平均大小约0.6μm左右，所以空气除菌主要是去除空气中的微粒（0.6-1μm）

•无菌空气的标准

百分数：

99.99％

美国联邦宇航局等级标准：

100级（直径大于0.5微米粒子数少于3.5个/L）

温度：

25℃—40℃湿度：

30%—45%

⏹二、介质除菌：

⏹原理：

过滤介质填充到过滤器中，空气流过时借助惯性碰撞、阻截、扩散、静电吸附、沉降等作用将尘埃微生物截留在介质中，达到除菌的目的。

⏹主要设备：

填充床过滤器

⏹1. 纤维或颗粒介质填充床过滤器：

棉花、玻璃纤维、腈纶、涤纶、维尼纶或活性炭等

⏹ 2.折叠式硼硅酸超细纤维过滤器：

超细玻璃纤维

⏹  3.烧结金属、陶瓷过滤器

发酵生产中制备无菌空气的大致过程

空气介质除菌流程

•高空取气管是远离地面几十米的管子。

一般而言，地面附近空气中所含的微生物和灰尘等均比高空空气中含的多，据资料介绍，每升高10米，空气中杂菌可降低一个数量级，因此从高空取气要比从低空取气有利得多。

•三、膜过滤（绝对过滤）

•

•原理：

利用微孔滤膜（microporousmembrane）对空气进行过滤，膜的孔径0.2-0.45微米，大于这一孔径的微生物能绝对截留。

•膜过滤器：

聚四氟乙烯、偏聚二氟乙烯、聚丙烯、纤维素脂膜等

第四节

染菌的防治

染菌（contamination）的危害

影响产量

影响质量

使能耗主耗上升

一、杂菌污染的检查

培养基

（1）细菌培养基

营养肉汤：

glucose10g,peptone5g,beefextract5g,NaCl5g,distilledwater1000ml,pH7.2~7.4。

酚红肉汤：

营养肉汤+1%phenolred3ml。

营养琼脂：

glucose5g,peptone10g,beefextract3g,NaCl5g,agar15~20g,distilledwater1000ml,pH7.2~7.4。

（2）酵母培养基

萨氏培养基（Sabouraud’sagar）：

glucose40g,peptone10g,agar15~20g,distilledwater1000ml,pH5.6。

}（3）霉菌培养基

}察氏培养基（Czapek’sagar）：

sucrose30g,NaNO33g,K2HPO41g,MgSO47H2O0.5g,KCl0.5g,agar15~20g,distilledwater1000ml,pH6.6。

}无菌检查的流程：

}取样

接入试管或斜面

培养（细菌32~37℃，1~2天；真菌25~28℃，1~3天）

肉眼检查

镜检

二、通过异常现象判断

溶解氧水平异常变化显示染菌

}排气中CO2异常变化显示染菌

}工艺一定，尾气中CO2量变化有一定规律

}污染杂菌，糖耗加快，尾气中CO2量增加

}污染噬菌体，糖耗减慢，尾气中CO2量减少

三、染菌原因的分析

种子系统

空气带菌

设备渗漏

培养基灭菌不彻底

操作失误

从染菌规模分析

}大规模染菌

空气净化系统

种子染菌、接种管道渗漏

}部分罐批染菌

某一批号种子染菌

某一套连消系统染菌

补料管路渗漏或补料液带菌

}个别罐批连批染菌

设备问题

}个别罐不连批染菌

培养基灭菌不彻底或操作失误

从染菌时间分析

}早期染菌

培养基灭菌不彻底

种子带菌

接种管道灭菌不彻底或接种操作不当

}中期染菌

培养基灭菌不彻底

加消沫剂、补料系统灭菌不彻底或渗漏

发酵设备渗漏

泡沫顶罐

}后期染菌

空气系统有问题

从染菌的菌型分析

}酵母菌：

种子室、摇瓶间、计量罐、进料补料阀门、搅拌轴封、被倒流的空气介质

}霉菌：

种子室、摇瓶间、搅拌轴封、被倒流的空气介质、空气

}普通杆菌：

空气过滤介质、冷水设备渗漏、设备死角渗漏

}芽孢杆菌：

培养基灭菌不彻底、设备有死角

}球菌：

空气系统、无菌间摇瓶间空气中

四、染菌的防治措施

1、一般染菌的防治

预防种子带菌：

     环境清洁，

无菌操作设备完好、可靠，

无菌操作用品灭菌彻底，

操作熟练，

制度严格。

}消灭培养基染菌：

严格物料采购、运输、仓贮

配料（防止块状物料、清洗配料罐）

灭菌（保证蒸汽的压力、稳定及畅通、按操作规程操作）

保压（防治培养基倒流）

}严防空气带菌：

提高空气进口的洁净度

除尽压缩空气中的油和水

空气过滤器灭菌时防止被冲翻

保证空气过滤器介质的填装质量

}杜绝设备污染：

}良好的设计（无死角）

}规范的安装

}彻底的清洗

}严密的维修

有效的灭菌。

染菌罐的处理

}种子罐染菌

灭菌后放下水道

并对种子罐、管道进行检查和灭菌

启用备用罐或倒种

}发酵罐染菌

前期：

危害大的灭菌后放下水道

危害不大，可重新灭菌，重新接种

中后期：

降低培养温度，降低通风

提前放罐

控制补料量

2、噬菌体污染的防治

}噬菌体污染的鉴别

现象鉴别：

发酵液变稀、发粘，OUR，DO，NH4+—N，泡沫。

平板鉴别：

观察噬菌斑。

}污染的预防

选育抗噬菌体菌株；

环境、明沟、下水道定期消毒；

排气过滤，菌体排放前灭菌；

选用孔径为0.01m的微滤膜空气过滤器；

发酵车间远离农田、排污明渠、污水处

培养基中加入适量化学消毒剂：

三聚磷酸钠0.2%~0.3%，植酸0.1%~0.2%，柠檬酸0.2%~0.5%，草酸0.2%~0.5%，

新洁而灭0.02%~0.05。

}污染后的处理

停产大消毒（用漂白粉、次氯酸钠、甲醛等对厂房和设备的所有角落进行大消毒）。

更换菌种或转产其他产品。