木薯粉酒精发酵实验报告详细篇.docx

木薯粉酒精发酵实验报告详细篇.docx

《木薯粉酒精发酵实验报告详细篇.docx》由会员分享，可在线阅读，更多相关《木薯粉酒精发酵实验报告详细篇.docx（13页珍藏版）》请在冰豆网上搜索。

木薯粉酒精发酵实验报告详细篇

实验报告

一、实验目的

掌握木薯分酒精发酵的基本过程与主要参数的测定方法。

熟悉基本仪器的工作原理和使用方法

二、实验原理

酒精发酵是在厌氧条件下，己糖分解为乙醇并释放出二氧化碳。

酒精发酵的类型有3种：

即通过EMP途径的酵母菌酒精发酵、通过HMP途径的细菌酒精发酵和通过ED途径的细菌酒精发酵酵母菌通过EMP途径分解己糖生成丙酮酸，在厌氧条件和微酸性下，丙酮酸则继续分解为乙醇。

淀粉类原料的酒精发酵主要有先糖化后发酵工艺和边糖化变发酵工艺（即同步糖化发酵工艺）2种，前者发酵时间长、酒精浓度低；后者发酵时间短，酒精浓度高，而且由于没有终产物抑制，糖化酶用量也较少，因此该工艺是酒精发酵研究的重要方向之一。

本实验即采用的是同步糖化发酵工艺。

液化酶即ɑ-淀粉酶，可将淀粉液化成糊精及少量麦芽糖和葡萄糖。

糖化酶是一种淀粉外切酶，能把淀粉从非还原性未端水解a-1.4葡萄糖苷键产生葡萄糖，也能缓慢水解a-1.6葡萄糖苷键，转化为葡萄糖。

同时也能水解糊精，糖原的非还原末端释放β-D-葡萄糖。

三、实验材料

1、菌种

酿酒酵母（Saccharomycescerevisiae）GGSF16

2、培养基

斜面菌种保藏培养基：

葡萄糖20g/L,酵母浸膏10g/L，蛋白胨20g/L，琼脂20g/L，加水溶解，自然pH，于121℃下蒸汽灭菌30min。

一级种子培养基：

葡萄糖20g/L,酵母浸膏10g/L，蛋白胨20g/L，自然pH，于121℃下蒸汽灭菌30min。

二级种子培养基：

葡萄糖20g/L,酵母浸膏10g/L，蛋白胨20g/L，pH值自然，于121℃下蒸汽灭菌30min。

发酵培养基：

量取初始全渣总糖浓度291.48g/L和滤液总糖浓度295.57g/L的木薯粉浆液ml，接种前加入用过滤膜过滤的尿素溶液，添加量为3.0g/L。

3、主要仪器

标准筛40目、立式压力蒸汽灭菌器、低速台式大容量离心机、全温度恒温调速摇瓶柜、台式冷冻离心机、生物传感分析仪SBA-40C、分光光度计、酸度计、漩涡混合器、Motic数码生物镜、灭菌锅、3000ml三角瓶2个、500ml三角瓶11个、万用电炉、0.5-10ul移液枪、100-1000ul移液枪、1000-5000ul移液枪、酸式滴定管25ml。

4、溶液及试剂

菲林甲液（CuSO4·5H2O）：

称取69.3gCuSO4·5H2O，加入蒸馏水定容至1000ml；

菲林乙液：

（C4O6H4KNa）：

称取346.0gC4O6H4KNa和100.0gNaOH，加入蒸馏水定容至1000ml；

2.5g/L的标准葡萄糖溶液：

称取在102℃左右条件下，烘烤4h的葡萄糖2.5g（精确至0.0002g）加入蒸馏水定容至1000ml，12h之后可以使用；

2mol/LHCl溶液：

浓盐酸5.6mL，定容至100mL容量瓶中；

质量分数为20%的HCl溶液：

浓盐酸514mL，加入蒸馏水定容至1000mL容量瓶中；

200g/LNaOH溶液：

称取200g氢氧化钠，加入蒸馏水定容于1000mL容量瓶中；

2mol/LNaOH溶液：

称取8g氢氧化钠，加入蒸馏水定容于100mL容量瓶中；

3g/L尿素：

称取3g尿素，加入蒸馏水定容于1000mL容量瓶中；

2%二水合柠檬酸钠次甲基蓝溶液：

用电子分析天平准确称取次甲基蓝和二水合柠檬酸三钠分别为10mg和2g，用蒸馏水溶解并定容至100ml。

四、实验步骤

称取过40目筛或80目筛干燥的木薯粉1453g，以料水比1：

2的比例加入2906g60℃的蒸馏水，按10U/g木薯粉的量加入40000U/ml液化酶400uL，搅拌混匀后于60℃下保温30min并不停搅拌。

转入灭菌锅中迅速升温到95℃，保温液化1h，期间不停搅拌，尽量不要让木薯粉浓醪中的固体颗粒粘连于容器壁上。

然后降温至50-60℃，取10ml全渣液备用测总糖，将液化后的全渣液过滤，制的滤液测总糖。

根据测得滤液的总糖浓度调滤液的总糖浓度至270g/L，于121℃下灭菌30min，然后冷却至33℃左右。

按250U/g木薯粉的量加入100000U的糖化酶。

按接种量为10％接种酿酒酵母GGSF16至液化糖化后的醪液中，同时加入3g/L尿素，分别取样10mL置于两个三角瓶中用于测定初总糖和初还原糖。

余下的分装到10三角瓶，每瓶约300ml，分别接上发酵栓，并于33℃发酵，转速为160r/min，摇床培养72h，期间每隔6h取样分析。

发酵结束后，测定细胞数、OD值、总糖含量、还原糖含量、酒精度、葡萄糖含量。

木薯粉酒精发酵工艺流程图如下

图4-1木薯粉酒精发酵工艺流程图

Fig.4-1theprocessflowdiagramofcassawastarchethanolfermentation

五、实验检测方法

1、测总糖

（1）原理

本次试验采用的测总糖的方法是斐林试剂法，因此直接滴定前需要在试样加入盐酸并在加热条件下使试样中非还原糖部分酸解为还原性糖。

菲林试剂是由甲、乙两种溶液组成。

甲液含质量分数为0.05g/mL的硫酸铜和次甲基蓝（氧化还原指示剂）；乙液含质量分数为0.1g/mL的氢氧化钠，酒石酸钠。

将一定量的碱性酒石酸铜甲液和乙液等体积混合时，硫酸铜与氢氧化钠反应，生成氢氧化铜沉淀所生成的氢氧化铜沉淀与酒石酸钠反应，生成可溶性的酒石酸钾钠铜。

在加热条件下，用样液滴定，样液中的还原糖与酒石酸钾钠铜反应，酒石酸钾钠铜被还原糖还原，产生红色氧化亚铜沉淀，还原糖则被氧化和降解。

反应生成的氧化亚铜沉淀。

滴定时以亚甲基蓝为氧化－还原指示剂。

因为亚甲基蓝氧化能力比二价铜弱，待二价铜离子全部被还原后，稍过量的还原糖可使蓝色的氧化型亚甲基蓝还原为无色的还原型的亚甲基蓝，即达滴定终点。

根据样液量可计算出还原糖含量。

（2）步骤

试样制备

称取10mL过滤液试样于250mL三角瓶中，加70mL蒸馏水和20mL质量分数为20%的HCl溶液，沸水浴中水解60min，冰水迅速冷却，以200g/L的NaOH溶液中和到微酸性pH为5-6之间，加入蒸馏水定容到250mL，振荡摇匀，倒入离心管中，以4000r/min的转速离心10min，取滤液备用。

斐林试剂所消耗葡萄糖标准溶液的体积标定

A.预备试验：

吸取斐林甲液、乙液及标准葡萄糖液各5mL于250mL三角瓶，加20mL蒸馏水，摇匀，在电炉上加热，从沸腾开始计时约2min，加入亚甲基蓝溶液2滴，在沸腾状态下1min用标准葡萄糖液滴定至蓝色消失为止。

记录标准葡萄糖液消耗的总体积。

B.正式试验：

吸取斐林甲液、乙液及标准葡萄糖液各5mL于250mL三角瓶，加蒸馏水20mL，滴入少于预备试验1毫升的2.5g/L的标准葡萄糖溶液，置电炉上沸腾2min，滴入亚甲基蓝2滴，沸腾状态下1min以标准葡萄糖溶液滴定，至溶液蓝色刚好消失。

记录标准葡萄糖液消耗的总体积，并做平行试验，使两次滴定结果之差在0.1mL之。

试样总糖的测定

A.预备试验：

吸取斐林甲液、乙液及待测液各5mL于250mL三角瓶，加20mL蒸馏水，摇匀，在电炉上加热沸腾，2min后加入亚甲基蓝溶液2滴，在沸腾状态下1min用标准葡萄糖液滴定至蓝色消失为止。

记录标准葡萄糖液消耗的总体积。

B.正式试验：

吸取斐林甲液、乙液及待测液各5mL于250mL三角瓶，加蒸馏水20mL，加入少于预备试验1毫升的2.5g/L标准葡萄糖溶液，置电炉上沸腾2min，滴入亚甲基兰2滴，沸腾状态下1min以标准葡萄糖溶液滴定，至溶液蓝色刚好消失为止。

记录标准葡萄糖液消耗的总体积，并做平行试验，使两次滴定结果之差在0.1mL之。

（3）计算公式

总糖含量（以葡萄糖计，g/L）=（A-B）×0.0025×250×

×

式中：

A—标定10ml菲林试剂所消耗的标准葡萄糖溶液的体积，mL；

B—往10ml菲林试剂中加入5ml水解后试样消耗标准葡萄糖溶液的体积，mL；

5—定糖时，用移液管吸取5ml试样水解液的体积，mL；

2.5—实验前配制好的标准葡萄糖溶液的浓度，g/L；

250—试样水解液的定容体积，mL；

10—取木薯粉浆液化滤液的体积，mL

2、测还原糖

本实验仍然采用斐林试剂法测定过滤液中的还原糖，因此不需要对过滤液进行酸解，原理与计算方法如上

（1）试样的制备

称取糖化醪试样10mL加蒸馏水定容至250mL，振荡摇匀，倒入离心管中，以4000r/min的转速离心10min，取滤液备用。

（2）试样还原糖的测定

预备试验：

同总糖的测定。

正式试验：

同总糖的测定。

3、细胞数

（1）原理：

用血球计数板在在显微镜下直接技术是一种常用的微生物技术方法，本次试验采用的是三目生物显微镜，可以将显微镜观测到的细胞成像在电脑上，方便计数，提高效率。

血球计数板是一块特质的厚玻璃，其上由四条槽构成三个平台，中间较宽的平台又被一短横槽隔成两半，每一边的平台上各刻有一个方格网，每个方格网分有九个大方格，中间的大方格是计数室，计数室的规格有两种，本次试验采用的是25个中方格，每个中方格有16个小方格，其中位于正中及四个角的中方格是细胞计数区域，计数室由400个方格组成，面积为1mm2,每个小方格的面积为1/400mm2。

盖上盖玻片后，计数区的高度为0.1mm，所以每个计数区的体积为0.1mm3，每个小方格的体积为1/4000mm3。

（2）步骤:

1.将离心管的过滤液稀释至容易计数的浓度，一般一个小方格5～10个细胞为宜。

如将12h的过滤液试样稀释10倍是用移液枪取100ul试样放入装有900ul蒸馏水的离心管中，然后将离心管放在振荡器振荡1min。

混合均匀后取100ul稀释后试样与100ul美兰再次混合即稀释至20倍。

2.取洁净的血球计数板一块，在计数区上盖上一块盖玻片。

将稀释好的过滤液摇匀，用移液枪吸取少许，从计数板中间平台两侧的沟槽沿盖玻片的下边缘摘入一小滴（不宜过多），让稀释液利用液体的表面力充满计数区，并用吸水纸吸去沟槽中流出的多余液体，注意不能有气泡产生。

3.静置片刻，使酵母细胞沉降到计数板上，不再随液体漂移。

将血球计数板放置于显微镜的载物台上夹稳，先在低倍镜下找到计数区后，再转换高倍镜观察并计数。

在计数前若发现菌液太浓或太稀，需重新调节稀释度后再计数。

4.找到计数室后按如下图所示数字与箭头顺序用电脑拍下每个中方格图片（尽量拍下完整的中方格）。

图片拍完后，取下盖玻片，用水将血球计数板冲洗干净，切勿用硬物洗刷或抹擦，以免损坏网格刻度。

洗净后自行晾干或用吹风机吹干，放入盒保存。

1

2

5

4

3

5.数图片中的酵母细胞数：

在计数时，对沉降在格线上的细胞的统计应有统一的规定。

如菌体位于大方格的双线上，计数时则数上线不数下线，数左线不数右线，以减少误差。

即位于本格上线和左线上的细胞计入本格，本格的下线和右线上的细胞按规定计入相应的格中。

对于出芽的酵母菌，芽体达到母细胞大小一半时，即可作为两个菌体计算。

每个样品重复计数2-3次（每次数值不应相差过大，否则应重新操作）。

（3）计算公式

25格×16格的血球计数板计算公式：

细胞数/ml=80小格细胞个数/80×400×10000×稀释倍数

（即1:

50000）

4、OD值

本次使用的仪器是分光光度计sh5500

（1）样品的制备

打开仪器电源，将分光光度计预热0.5h，准备好待测样品，打开仪器软件。

（2）蒸馏水在600nm波长下吸光度的测定

用无菌枪头吸取少量蒸馏水，滴一滴（约2ul）在下检镜孔，盖上上臂，保持5s，然后用擦镜纸擦拭上下检镜孔，重复清洗一次。

用10ul移液枪吸取2ul的蒸馏水滴在下检镜孔，盖上臂。

单击计算机的“Black”再按“Measure”键或鼠标左键，读取600nm波长下，蒸馏水的吸光度。

（3）样品在600nm波长下吸光度的测定

先清洗上下检镜孔，用无菌枪头取振荡混合均匀的待测菌悬液2ul，同上述方法，读取改菌悬液在600nm波长下的吸光度；重复此操作并记录实验数据。

测下一个样品前需清洗上下检镜孔，同上。

5、葡萄糖

（1）实验仪器和原理

本次实验测葡萄糖所用的仪器是SBA-40C型生物传感分析仪。

SBA-40C型生物传感分析仪是以固定化酶为关键元件，由微电脑控制双指标智能化仪表。

SBA－40C型系列生物传感双功能分析仪利用酶促反应来定量，样品分析工作原理如下：

固定化酶

底物＋O2＋H2O————————→产物＋H2O2

或葡萄糖葡萄糖氧化酶葡萄糖酸＋H2O2

或乙醇乙醇氧化酶乙酸＋H2O2

样品经稀释后（要求pH在6－8左右），由定量进样针吸取25ul，并注入反应池，含有样品的底物在样品室迅速按照一定比例混合均匀，底物透过酶膜圈的外层与固定化酶层接触并反应，反应放出的H2O2再透过酶膜圈的层与白金－银电极接触，并产生电流信号，该电流信号与底物浓度成线性比例关系，经微机控制的信号，可直接显示并打印结果。

（2）实验基本步骤

取1ml发酵过程样品，9000r/min离心5min，取上清液稀释至适宜浓度，取稀释过的溶液25ul用生物传感仪分析测定葡萄糖浓度（生物传感仪预先用1g/L葡萄糖标准溶液标定），并记录相关数据。

（3）葡萄糖含量计算公式

葡萄糖含量（g/L）=C×0.01×稀释倍数

试中：

C─生物传感仪读数，mg/dL

0.01─单位换算系统

6、酒精度

用100ml量筒准确量取样液100mL，并称取100mL样液的质量，用100ml水洗涤进入500mL蒸馏烧瓶中，再往蒸馏烧瓶中加入5mL1mol/LNaOH溶液，加热蒸馏，馏出液收集于100mL的容量瓶中，带馏出液接近刻度时取下，加水至刻度，摇匀，然后倒入100mL洁净干燥的量筒中，以酒精计和温度计同时测酒精度和温度，根据测出的酒精度和温度，换算为20℃的酒度（%,v/v）。

附表酒精度与温度校正表

溶液温度/℃

酒精计示值

5.5

6.0

6.5

7.0

7.5

8.0

8.5

9.0

温度20℃时用容积百分数表示的酒浓度

20

5.5

6.0

6.5

7.0

7.5

8.0

8.5

9.0

21

5.4

5.8

6.3

6.8

7.3

7.8

8.3

8.8

22

5.2

5.7

6.2

6.7

7.2

7.7

8.2

8.6

23

5.0

5.5

6.0

6.5

7.0

7.5

8.0

8.4

24

4.9

5.4

5.8

6.3

6.8

7.3

7.8

8.3

25

4.7

5.2

5.7

6.2

6.6

7.1

7.6

8.1

26

4.5

5.0

5.5

6.0

6.4

6.9

7.4

7.9

27

4.3

4.8

5.3

5.8

6.3

6.7

7.2

7.7

28

4.2

4.6

5.1

5.6

6.1

6.5

7.0

7.5

29

4.0

4.4

4.9

5.4

5.8

6.3

6.8

7.2

30

3.8

4.2

4.7

5.1

5.6

6.1

6.6

7.0

六、实验过程记录

2013.10.4

10:

00——筛粉

10:

30——称重

10:

35——调浆

11:

00——加液化酶，混和均匀并于60℃下保温30min并不停搅拌

1130——液化，灭菌锅中，温度为95℃，时间为60min

12:

30——冷却降温至60℃

13:

30——过滤

14:

00——分装于三角瓶中

15:

00——测初总糖

20:

00——调总糖大于270g/L

20:

30——开始灭菌

种子摇床培养（32℃,24h）——12:

00

2013.10.5

12:

00——接种

13:

30——第1次取样

13:

30——开始摇床培养（33℃、160r/min）

19:

30——第2次取样

2013.10.6

01:

30——第3次取样

07:

30——第4次取样

13:

30——第5次取样

19:

30——第6次取样

2013.10.7

01:

30——第7次取样

07:

30——第8次取样

13:

30——第9次取样

19:

30——第10次取样

2013.10.8

01:

30——第11次取样

07:

30——第12次取样

发酵结束

七、讨论

1.在此次实验中，理论上，1453g木薯粉应与2906mL水混匀，但实际上加入了3000mL水，加水量多了近100mL，这是因为在木薯液化过程中会有部分水分蒸发而流失，为了保证整个实验过程有充足的水分以便液化反应充分，故加水量应比理论的多出100-200mL。

2.对于2.5g/L标准葡萄糖溶液，最好提前1-2天配制，以使其得到充分稳定，减少滴定误差。

加入5mL浓盐酸，可起到防腐作用，延长溶液的保质期。

3.木薯干粉碎度的影响：

原料粉碎有利于淀粉的糊化、液化，也有利于α−淀粉酶和糖化酶的作用。

原料的颗粒越细，淀粉越容易被糖化酶利用，醪液的酒精度越高。

但粉碎的越细，耗电量也增加。

粉碎粒度0.40~0.45mm比较合适，故采用40目筛。

4.滴定必须是在沸腾条件下进行，其原因一是加快还原糖与Cu2＋的反应速度；二是亚甲基蓝的变色反应是可逆的，还原型的亚甲基蓝遇空气中的氧时会再被氧化为氧化型。

此外，氧化亚铜也极不稳定，易被空气中的氧所氧化。

保持反应液沸腾可防止空气进入，避免亚甲基蓝和氧化亚铜被氧化而增加消耗量。

但是沸腾时间和滴定速度对结果影响也较大，一般沸腾时间短，消耗糖液多，反之，消耗糖液少。

滴定速度过快，消耗糖量多，反之，消耗糖量少。

因此，测定时应沸腾开始后应严格控制3min完成滴定，力求一致。

平行试验的样液消耗量相差不应超过0.1ml。

5.木薯粉主要成分是淀粉，淀粉是一种亲水胶体，糊化过程中醪液粘度会大大增加，加入液化酶可切断淀粉的葡萄糖长链，水解释放出一部分水分子，降低醪液粘度。