质粒DNA的分离纯化和电泳检测.docx
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质粒DNA的分离纯化和电泳检测
分子生物学实验报告
质粒DNA的分离、纯化和电泳检测
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摘要
提取和纯化质粒DNA的方法很多,其中碱变性提取法最为经典和常用,适于不同量质粒DNA的提取。
该方法操作简单,易于操作,且提取质粒DNA纯度高,一般实验室均可进行。
该方法利用染色体DNA与质粒DNA变性与复性所依赖的溶液pH值不同来将染色体DNA沉淀,再经过一系列除杂的方法除去RNA及其它蛋白质杂质从而得到质粒DNA。
而琼脂糖凝胶电泳是一种常用的纯化和检测DNA的方法。
在溶液中,由于核酸有磷酸基而带有负电荷,在电场中向正极移动。
样品DNA分子的大小、DNA分子的构象影响DNA的移动速度从而将不同分子大小与构象的DNA分子分离开来。
关键词:
碱变性法;质粒DNA;凝胶电泳
1.原理与方法
1.1质粒载体
质粒是存在于细菌染色体外的一个或多个双链闭合环状小分子DNA,其大小从1kb至200kb以上不等。
作为一个具有自身复制起点的复制单位独立于细胞的染色体之外,质粒DNA上携带了部分的遗传信息,控制细菌某些特定的遗传性状,如性菌毛形成、形成耐药性、产生细菌素、抗生素等。
通常情况下可持续稳定地复制,但在一定条件下也可可逆地整合到寄主染色体上,随着染色体的复制而复制,并通过细胞分裂传递到后代。
质粒还可通过接合或转导的方式在细菌间传递。
质粒由于分子小、便于分离和提取,在DNA重组中,质粒或经过改造后的质粒可通过连接外源基因构成重组体,携带目的基因进入细菌、动物细胞或植物体内进行扩增与表达,因此是基因工程中一种非常重要的载体,质粒特征的分析已被广泛用于细菌种属鉴定、耐药性、毒力及同源性分析。
近年来由于基因芯片技术的出现,质粒基因探针的开发和应用也得到了飞速的发展,所以这就要求我们从宿主细胞中提取高质量的质粒DNA,质粒提取成为分子生物学实验室一项最基本的工作。
1.2碱变性提取法提取质粒
提取和纯化质粒DNA的方法很多,目前常用的有:
碱变性提取法、煮沸法、羟基磷灰石柱层析法、EB-氯化铯密度梯度离心法和Wizard法等。
其中,碱变性提取法最为经典和常用,适于不同量质粒DNA的提取。
该方法操作简单,易于操作,一般实验室均可进行。
提取质粒DNA纯度高,可直接用于酶切、序列测定及分析。
EB-氯化铯密度梯度离心法,主要适合于相对分子质量与染色体DNA相近的质粒,具有纯度高、步骤少、方法稳定,且得到的质粒DNA多为超螺旋构型等优点,但提取成本高,需要超速离心设备。
少量提取质粒DNA还可用沸水浴法、Wizard法等,沸水浴法提取的质粒DNA中常含有RNA,但不影响限制性核酸内切酶的消化、亚克隆及连接反应等。
碱变性提取质粒DNA一般包括三个基本步骤:
培养细菌细胞以扩增质粒;收集和裂解细胞;分离和纯化质粒DNA。
在细菌细胞中,染色体DNA和质粒DNA均被释放出来,但是两者变性与复性所依赖的溶pH值不同。
在pH值高达12.0的碱性溶液中,染色体DNA的氢键断裂,双螺旋结构解开而变性;共价闭合环状质粒DNA的大部分氢键断裂,但两条互补链不完全分离。
因为它们在拓扑学上是相互缠绕的。
当用pH值4.6的KAc(NaAc)高盐溶液调节碱性溶液至中性时,变性的质粒DNA可恢复原来的共价闭合环状超螺旋结构而溶解于溶液中;但染色体DNA不能复性,而是与不稳定的大分子RNA、蛋白质-SDS复合物等一起形成缠连的、可见的白色絮状沉淀。
这种沉淀通过离心,与复性的溶于溶液的质粒DNA分离。
溶于上清液的质粒DNA,可用无水乙醇和盐溶液,使之凝聚而形成沉淀。
由于DNA和RNA性质类似,乙醇沉淀DNA的同时,也伴随着RNA沉淀,可利用RNaseA将RNA降解。
质粒DNA溶液中的RNaseA以及一些可溶性蛋白,可通过酚/氯仿抽提除去,最后获得纯度较高的质粒DNA。
1.3凝胶电泳法进行DNA的分离纯化
电泳(electrophoresis)是带电物质在电场中向着与其电荷相反的电极方向移动的现象。
各种生物大分子在一定pH条件下,可以解离成带电荷的离子,在电场中会向相反的电极移动。
凝胶是支持电泳介质,它具有分子筛效应。
含有电解液的凝胶在电场中,其中的电离子会发生移动,移动的速度可因电离子的大小形态及电荷量的不同而有差异。
利用移动速度差异,就可以区别各种大小不同的分子。
因而,凝胶电泳可用于分离、鉴定和纯化DNA片段,是分子生物学的核心技术之一。
凝胶电泳技术操作简单而迅速,分辨率高,分辨范围广。
此外,凝胶中DNA的位置可以用低浓度荧光插入染料如溴化乙锭(ethidiumbromide,EB)或SYBRGold染色直接观察到,甚至含量少至20pg的双链DNA在紫外激发下也能直接检测到。
需要的话,这些分离的DNA条带可以从凝胶中回收,用于各种各样目的的实验。
分子生物学中,常用的两种凝胶为琼脂糖(agarose)和聚丙烯酰胺凝胶。
这两种凝胶能灌制成各种形状、大小和孔径,也能以许多不同的构型和方位进行电泳。
聚丙烯酰胺凝胶分辨率高,使用于较小分子核酸(5—500bp)的分离和蛋白质电泳。
它的分辨率非常高,长度上相差1bp或质量上相差0.1%的DNA都可以彼此分离,这也是采用聚丙烯酰胺凝胶电泳进行DNA序列分析的分子基础。
虽然它能很快地进行电泳,并能容纳较大的DNA上样量,但是与琼脂糖凝胶相比,在制备和操作上繁琐。
琼脂糖是从海藻中提取的长链状多聚物,由β-D-吡喃半乳糖与3,6-脱水-L-吡喃半乳糖组成,相对分子质量为104-105。
琼脂糖加热至90℃左右,即可溶化形成清亮、透明的液体,浇在模版上冷却后形成凝胶,其凝固点为40-45℃。
琼脂糖凝胶相对于聚丙烯酰胺凝胶分辨率低,但它的分离范围更大(50至百万bp),小片段DNA(50-20000bp)最适合在恒定轻度和方向的电场中水平方向的琼脂糖凝胶内电泳分离。
琼脂糖凝胶电泳易于操作,适用于核酸电泳,测定DNA的相对分子质量,分离经限制酶水解的DNA片段,进一步纯化DNA等。
琼脂糖凝胶电泳是一种常用的方法。
在溶液中,由于核酸有磷酸基而带有负电荷,在电场中向正极移动。
DNA在琼脂糖凝胶中的电泳迁移率主要取决于6个因素:
样品DNA分子的大小、DNA分子的构象、琼脂糖浓度、电泳所用电场、缓冲液和温度。
本实验中影响DNA在琼脂糖凝胶中电泳迁移率的主要是所提取样品DNA分子的大小和分子构象。
其中线性双螺旋DNA分子是以头尾位向前迁移的,其迁移速率与片段碱基数的对数值成反比;相对分子质量相同而构象不同的DNA分子其迁移速率也不同,一般情况下,超螺旋型迁移速率最快,其次为线状分子,最慢的是开环状分子与复制中间体。
2.仪器、材料及试剂
2.1仪器
恒温振荡培养箱、高速冷冻离心机、漩涡振荡器、50ml离心管、恒温水浴锅、Eppendorf管、微量移液器、不同型号枪头、微波炉、电泳仪、制胶槽、梳子、分析天平、一次性手套、刀片、塑料薄膜、紫外灯、培养皿、接种环、三角瓶(100ml、300ml)、移液管、酒精灯、灭菌锅、吸水纸和记号笔等;
2.2材料
菌体:
Escherichiacoli(E.coli)DH5α受体菌,具有Amp
标记的质粒pUC19;
2.3试剂
1)LB(LuriaBroth)液体培养基:
1%蛋白胨(tryptone),0.5%酵母粉(yeastextract),1%NaCl,用NaOH调pH至7.2,121℃高压蒸气灭菌20min;
2)抗生素(氨苄青霉素:
母液浓度为100mg/mL,工作浓度为50~100μg/mL);
3)溶液Ⅰ(SolⅠ):
50mmol/L葡萄糖,25mmol/LTris-HCl(pH8.0),10mmol/LEDTA;
溶液Ⅱ(SolⅡ):
0.2mol/LNaOH,1%SDS。
(临用前用10mol/L的NaOH和10%的SDS母液配置,防止NaOH吸收空气中的CO2而变质);
溶液Ⅲ(SolⅢ):
5mol/LKAc缓冲液60ml,冰醋酸11.5mL,重蒸水28.5mL,溶液中浓度K
3mol/L,Ac
5mol/L;
4)RNaseA母液:
将RNaseA溶于10mmol/LTris-Cl(pH7.5),15mmol/LNaCl的溶液中,配成10mg/ml的溶液,于100℃加热15min,使污染的DNase失活。
冷却后用1.5mL无菌eppendorf管分装成小份保存于-20℃;
5)TE缓冲液:
10mmol/LTris-HCl(pH8.0),1mmol/LEDTA;
6)饱和酚,氯仿/异戊醇混合液,酚/氯仿/异戊醇(PCI)混合液;
7)预冷无水乙醇,70%乙醇;
8)上样缓冲液(6×loadingbuffer);
9)琼脂糖,TAE电泳缓冲液(10×);
10)溴化乙锭(EB)。
3.实验步骤
3.1含质粒pUC19菌株的培养及收获
1)挑取E.coliDH5
单菌落,接种于40mLLB液体培养基(含Amp80ug/mL)中,37℃,150~180rpm振荡培养过夜12~16hr;之后再将过夜培养物按照2%接种量接种到40mLLB液体培养基(含Amp80ug/mL),37℃,150~180rpm振荡培养4~6hr;
2)称取一个50mL的灭菌离心管(15.948g),取约30mL培养物配平后6000rpm离心5min,弃上清,加5mLSolⅠ,混匀,然后6000rpm离心5min,弃上清并将残留液体吸干,称重(16.016g),计算菌体重W=0.068g;
3.2细胞裂解提取质粒DNA
1)加1mLSolⅠ,涡旋混匀后冰浴5min;
2)加2mLSolⅡ,轻柔颠倒混匀,冰浴5min,此时溶液变清亮透明且粘稠如蛋清状;
3)加1.5mLSolⅢ,轻柔颠倒混匀,冰浴5min,此时溶液出现白色絮状沉淀;
4)平衡后12000rpm离心15min,转上清至另一50mL离心管,弃沉淀(得液体4mL);
5)加两倍体积的冰乙醇(8mL),颠倒混匀,-20℃放置30min;
6)12000rpm离心15min,弃上清,加70%乙醇5mL洗涤,12000rpm离心2min,弃上清,重复洗涤一次,弃上清;
7)将离心管于37℃下烘干一定时间,至离心管底部大部分呈透明状。
8)加1mLTE溶液反复吹打使质粒DNA充分溶解,得粗提物。
3.3质粒DNA的纯化
1)在1mL粗提物中加入10μL(100μg)RNaseA,于37℃下保温1~2hr;
2)将1mL粗提物等分成两份,加等体积饱和酚,混匀,12000rpm离心5min,转上清至新管,记录所得上清体积;
3)加等体积苯酚:
氯仿:
异戊醇,混匀,12000rpm离心5min,转上清至新管,记录所得上清体积;
4)加等体积氯仿:
异戊醇,混匀,12000rpm离心5min,转上清至新管,记录所得上清体积。
5)加1/10体积3mol/LNaAc,混匀,再加2倍体积冰乙醇,混匀,-20℃放置30min,12000rpm离心15min.,弃上清.
6)加500ul70%乙醇洗涤,12000rpm离心5min,弃上清,重复洗涤一次,弃上清,并将离心管倒置于吸水纸上将水分吸干,管底残留的水分用移液枪吸干。
7)于37℃恒温箱中干燥,使乙醇挥发完全。
8)每管加入25uLTE溶解,将两管合并,最终得到50ul纯化质粒DNA。
3.4琼脂糖凝胶电泳检测质粒DNA
1)1%琼脂糖凝胶制备:
称取0.4g琼脂糖于100ml三角烧瓶中,加40ml1×TAE,微波炉加热2~3次使溶液完全呈透明状,冷却至60℃左右,缓缓倒入架有梳子的电泳胶板中,勿使有气泡,静置冷却30min以上,轻轻拔出梳子,放入电泳槽中(电泳缓冲液1×TAE),即可上样。
2)取3ulDNA和2ul6×loadingbuffer混匀,点样,100V电泳40min。
3)EB染色10min,水洗10min,紫外灯下观察电泳结果,摄片,保存,分析。
4.现象分析
1)在接菌时,为保证菌体接种成功,应将挑有菌体的接种环在三角瓶壁上轻轻接触,然后轻轻倾斜三角瓶,让液体的LB培养基与菌体接触,用接种针在瓶壁上反复研磨,当观察到附近的LB培养基有轻微浑浊现象时,接菌成功,再轻轻震荡三角瓶,使全部菌体进入培养基中;
2)第一次离心,是为了分离出E.coli,离心后,菌体聚集在离心管底部,成白色固体状。
3)加入SolⅠ后,盖好离心管盖,至于旋涡震荡器上将菌体打散,当观察到无白色菌块悬浮在液体中时,说明已充分打散。
加SolⅠ是为了洗涤菌表面的培养液,其中,葡萄糖使溶液密度增加,悬浮后的大肠杆菌不会快速沉积到管子的底部;维持渗透压,防止细胞提前破裂,防止DNA受机械剪切力作用而降解。
EDTA是Ca2+和Mg2+等二价金属离子的螯合剂,可抑制DNase的活性,抑制微生物的生长。
Tris-HCl作为缓冲液提供适当的pH;
4)SolⅡ为强碱性溶液,目的是使细胞破裂,染色体DNA的氢键断裂,双螺旋结构解开而变性;共价闭合环状质粒DNA的大部分氢键断裂,但不完全分离。
当用pH值4.6的NaAc高盐溶液调节碱性溶液至中性时,变性的质粒DNA可恢复原来的共价闭合环状超螺旋结构而溶解于溶液中;但染色体DNA不能复性,而是与不稳定的大分子RNA、蛋白质-SDS复合物等一起形成缠连的、可见的白色絮状沉淀。
在加溶液Ⅱ时,要逐滴缓慢加入,边加边轻轻摇动离心管,以免将染色体DNA打散成小片段,难以分离。
此时,可观察到离心管中液体呈粘稠的蛋清状。
在SolⅡ中NaOH使细胞膜发生了从双层膜结构向微囊结构的相变化导致细胞溶解。
同时,强碱性使染色体DNA、质粒DNA和蛋白质变性;SDS为下一步沉淀做铺垫;
5)SolⅢ为高盐溶液,调节碱性溶液至中性,使变性的质粒DNA可恢复原来的共价闭合环状超螺旋结构而溶解于溶液中。
染色体DNA不能复性,形成白色絮状沉淀。
在SolⅢ中十二烷基硫酸钠(SDSsodiumdodecylsulfate)遇到KAc后变成了十二烷基硫酸钾(potassiumdodecylsulfate,PDS),而PDS是水不溶的,因此发生了沉淀。
又SDS专门喜欢和蛋白质结合,平均两个氨基酸上结合一个SDS分子,钾钠离子置换所产生的大量沉淀自然就将绝大部分蛋白质沉淀了,此外大肠杆菌的基因组DNA也一起被共沉淀了。
HAc中和NaOH,因为长时间的碱性条件下会打断基因组DNA,只要是50~100kb大小的片断,就没有办法再被PDS共沉淀了。
同时变性的质粒DNA复性。
该步反应形成的高盐环境进一步加速了这一沉淀。
冰浴使反应更充分,并且防止细胞破裂时细胞内释放出来的各种酶将质粒DNA降解。
6)通过再次离心,可将这种白色沉淀与复性溶于溶液的质粒DNA分离开来。
溶于上清液的质粒DNA,可用无水乙醇和盐溶液,使之凝聚而形成沉淀。
乙醇的优点是可以任意比和水相混溶,乙醇与核酸不会起任何化学反应,对DNA很安全,因此是理想的沉淀剂。
-20℃沉淀后,有白色絮状沉淀分布在管液中。
离心,质粒DNA分布在一侧,弃上清,干燥至管壁无附着的液珠,质粒DNA呈透明为止。
可将未干燥的沉淀位置做好标记,以便下一步的溶解。
7)TE缓冲液是弱碱性,对DNA的碱基有保护性(DNA在它是的稳定性较好,不易破坏其完整性或产生开环及断裂),包括提取好的DNA也要放在TE缓冲液是保存。
8)由于DNA与RNA性质类似,乙醇沉淀DNA的同时,也伴随着RNA沉淀,可利用RNaseA将RNA降解。
质粒DNA溶液中的RNaseA以及一些可溶性蛋白,可通过酚/氯仿抽提除去,最后获得纯度较高的质粒DNA。
9)苯酚是强的蛋白阻断剂,可使蛋白变性;氯仿也是蛋白阻断剂,但强度弱于苯酚,其主要作用是将同水以极小比例互溶的苯酚萃取出来。
如果不加氯仿,残留的苯酚会阻碍酶切反应等,且水饱和酚的密度略轻于水,苯酚相位于上层,不利于获得含质粒的水相,加入氯仿后可以增加比重,使得酚/氯仿始终在下层,方便水相的回收;异戊醇则可起消除抽提过程中出现的泡沫,有利于分层更明显。
10)由于DNA带负电荷,加入NaAc的作用就是是中和DNA所带的负电荷,使DNA之间的排斥力减小,有助于DNA的沉淀。
70%乙醇的作用一方面是继续沉淀DNA,另一方面可以除去上一步骤中溶解在溶液中的盐离子。
5.注意事项
1)扩大培养菌体时,挑了单菌落的接种环要在三角瓶的液避接面处研辗,瞬间可看到菌体进入培养液造成的局部浑浊;
2)加入溶液Ⅰ重悬要充分,如果细胞没有完全散开悬浮,将会影响溶液Ⅱ裂解细胞,最终导致提取产物中含较多的蛋白质,染色体DNA等杂质;
3)用50mL离心管离心前一定要配平两端,以保护离心机,1.5mL离心管在离心时应尽量保证离心管两端装液体积相等;
4)用70%乙醇洗涤质粒DNA时应在离心管底做好标记,下次放置时应将含DNA的区域放置于离心管外侧;
5)在37℃烘箱中烘干质粒DNA时应在含质粒的区域作一定的标记,防止烘干后由于质粒DNA透明而无法找到;
6)加入溶液Ⅱ时摇匀一定要轻柔,剧烈会导致基因组DNA断裂;静置时间也不能过长,因为基因组DNA在碱性条件下会慢慢断裂;
7)制胶时,胶液温度过高,会使模具变性,影响胶孔大小和胶形状,从而间接影响加样量和跑条带。
胶液温度过低,会凝固,所以在胶液冷却至50~60℃左右倒胶;
8)注意加样时枪尖应恰好置于凝胶点样孔中,不可刺穿凝胶,也要防止将样品溢出孔外。
跑多个样时,应依次快速点样,否则时间一久,样品会弥散掉;
9)DNA分子在高于其等电点的pH溶液中带负电荷,在电场中向正极移动,点样孔在负极;
10)在进行分子操作时应戴手套,防止试剂对人身体造成伤害,也防止由于接触而导致试剂的污染;
11)EB是一种强致突变剂,应严格戴手套操作;
6.结果分析
6.1凝胶电泳图示
图1.质粒DNA检测凝胶电泳图(各泳道对应的点样如图所示,其中红框内为本组的电泳检测结果)
6.2电泳图分析
1)在10000>bp>2000的区域中,跑得最快的是超螺旋的质粒DNA,是条带中最亮的那一部分,我们组(JD-6)质粒DNA的含量相对而言较多;跑得最慢的是松弛开环的质粒DNA,我们组的不是很明显;在两者之间的是被核酸内切酶的切割所形成的线性的质粒DNA分子(第二泳道pUC19/HindⅢ)。
由于相同分子量的质粒DNA电泳时的迁移的速率和表面所带的负电荷量的多少,即其构象有很大关系,一般来说超螺旋结构的DNA表面所带的负电荷是最少的,故其向正极跑得最快,其次为线性分子,最慢的是开环分子;
2)在bp<500的区域中隐约可见一小片区带,是少量的RNA,可能是用RNA酶对RNA分解不彻底所残留的;
3)在bp>20000的较明显的区带为完整的染色体DNA(λDNA),但我们组的含量不是很多;
4)点样孔下方有白色条带,说明含少量杂蛋白,纯度不高。
原因是在纯化的过程中未能将蛋白质除尽,吸取上清的时候也可能带进少量的蛋白质,相对而言本组的蛋白质杂质较多,但质粒DNA也较多,因此较为正常;
5)对比JD-5(-)可以很明显的发现不使用RNA酶进行除杂RNA会在bp<500处形成很明显的一大片区域;
6)最后一条泳道的DL2000DNAMarker是用以指示小分子的核酸片段的,图中小分子的RNA在100bp~500bp范围内。
6.3实验思考与讨论
本次实验为期三周,是本学期的第一次分子生物学实验。
实验通过对质粒DNA进行提取、纯化和检测练习了分子生物学实验的很多基本操作,包括碱裂解法提取质粒DNA、各类大分子(蛋白质,染色体DNA、RNA等)的去除、琼脂糖凝胶电泳的检测、电泳结果的分析等。
本次实验我们小组进行的较为成功,最后成功提取了质粒DNA并学习了各类实验操作与原理,但仍存在一定的问题,比如提取的质粒DNA蛋白质去处不彻底、分子的基本操作总是忘戴手套等,希望通过今后的分子实验进一步熟悉分子生物学的基本操作规范,学习分子生物学实验的基本知识,以取得更大的进步。
参考文献
[1]汪天虹,鲍晓明,孔健,刘相梅,吴志红,庞昕.分子生物学实验.北京大学出版社.2008
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