细菌及细胞电镜观察样品制备方法_精品文档.doc
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细菌样品冷冻干燥制样方法
1)取样:
取大量样品离心(转速3000r~4000r),去除上清液,加入适当PH(7.2~7.4)的0.1MPBS清洗三遍;清洗时菌体温柔悬浮。
2)固定:
2.5%戊二醛固定3h(此步时间非绝对,1~12h都可),用PBS清洗两遍,每遍10min。
再用纯水清洗两遍。
3)梯度脱水:
用乙醇的水溶液按30%、50%、70%、80%、90%的浓度梯度对样品进行脱水,每步15min,之后在100%乙醇的水溶液中脱水15min×2次;再将样品置于乙醇和叔丁醇1:
1混合液中15min;最后置样品于叔丁醇中15min×2次。
(此步也可以尝试不做)
4)冷冻干燥:
滴加处理好的样品于5*5mm的盖玻片上,置-80度冰箱冷冻后放入冷冻干燥机中进行冷冻干燥。
5)电镜观察:
样品充分干燥后,进行扫描电镜观察。
2.5%戊二醛:
Step1:
0.2M磷酸缓冲液的配制:
(0.1M的就是稀释2倍)取50mL定容100mL
---------------------
磷酸二氢钠(NaH2PO4.H2O) 2.6克
磷酸氢二钠(Na2HPO4.12H2O) 29克
双蒸馏水 加至500毫升
pH调至7.4
Step2:
戊二醛固定液的配制:
---------------------
25%戊二醛 1ml
双蒸馏水 4ml
0.2mol/L磷酸缓冲液 5ml
戊二醛最终浓度 2.5%
pH值7.3-7.4
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