一步一步教你使用NCBI查找DNAmRNAcDNAProteinpromoter引物设.docx
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一步一步教你使用NCBI查找DNAmRNAcDNAProteinpromoter引物设
一步一步教你使用NCBI查找DNA、mRNA、cDNA、Protein、promoter、引物设计、BLAST序列比对等
最近看到很多战友在论坛上询问如何查询基因序列、如何进行引物设计、如何使用
BLAST进行序列比对……,这些问题在NCBI上都可以方便的找到答案。
现在我就结合我自
己使用NCBI的一些经历(经验)跟大家交流一下BCBI的使用。
希望大家都能发表自己的使
用心得,让我们共同进步!
我分以下几个部分说一下NCBI的使用:
Partone如何查找基因序列、mRNA、Promoter
Parttwo如何查找连续的mRNA、cDNA、蛋白序列
Partthree运用STS查找已经公布的引物序列
Partfour如何运用BLAST进行序列比对、检验引物特异性
特别感谢本版版主,将这个帖子置顶!
从发帖到现在,很多战友对该帖给与了积极的关注,在此向给我投票的(以与想给我
投票却暂时不能投票的)各位战友表示真诚的感谢,谢谢各位战友!
请大家对以下我发表的内容提出自己的意见。
关于NCBI其他方面的使用也请水平较高
的战友给予补充
Firstofall,还是让我们从查找基因序列开始。
第一部分利用Mapviewer查找基因序列、mRNA序列、
启动子(Promoter)
下面以人的IL6(白细胞介素6)为例讲述一下具体的操作步骤
1.打开Mapviewer页面,网址为:
在search的下拉菜单里选择物种,for后面填写你的目的基因。
操作完毕如图所示:
2.点击“GO”出现如下页面:
3.在步骤二图示的右下角有一个QuickFilter,下面是让你选择的几个复选框,在Gene
前面的小方框里打勾,然后点击Filter.出现下图:
说明一下:
1、染色体的红色区域即为你的目的基因所处位置。
2、下面参考序列给出了
三个,是不同的部门做出来的,经我验证,序列有微小的差异,但总体来说基本相同。
尽管
你分别点击后,序列代码、序列代码等有所差异,但碱基基本一致,不影响大家研究分析序
列。
现在普遍采用的是最上面的那个序列,这一条是世界范围的生物科学家用计算机合成的
一个序列。
我也推荐大家使用这个序列。
4.点击上述三条序列第一条序列(即reference)对应的"Genesseq",出现新的页面,
页面下方为:
5.点击上图出现的“Download/ViewSequence/Evidence”,即下载查看序列等功能,
结果如图所示:
先对上面这张图做点简要的说明,在SequenceFormat(序列输出格式)后面是一个下
拉式选择菜单,默认的为FASTA格式,还有一个是GenBank格式。
我推荐大家选择GenBnak
格式,因为这个格式提供了很多该基因的信息,而FASTA格式只有基因序列。
6.在SequenceFormat后选择GenBank,然后点击下面的Display,目的基因的相关
信息和序列就出现在眼前了。
点击后如图所示(网页较大,只抓取一小部分以作示范):
在上述打开的网页中,你可以看到基因长度,基因序列,以与这个基因是如何被报道出
来的等各种信息。
你会看到:
mRNAjoin(3598..3678,3841..4031,5090..5203,5911..6057,7803..8394)
这代表了从基因的3598位开始就是转录区了,即我们常说的mRNA片断,由于内含子的存在,
所以mRNA在DNA序列上分成了几段。
CDSjoin(3660..3678,3841..4031,5090..5203,5911..6057,7803..7970)
CDS代表编码序列,即蛋白编码区是从3660开始的(ATG),由于剪接作用所以CDS区
也是不连续的。
说到这里,可能很多朋友都已经明白了promoter即启动子区域在哪里了。
但我还是再
唠叨几句:
转录起始位点前面是基因的调控区,启动子区没有明显的位置定义,大家也只是
猜测它的大体位置,如果你要研究promoter区的话,建议你选择转录起始位点前的2000
个碱基进行研究,一般默认的是这样。
当然你如果觉得长度太长不好研究的话,也可以只研
究-1000到0这一千个碱基,因为一般情况下,启动子区的变异都在这个区域内。
这样大家就可以找到自己的目的基因序列和启动子了,这种方法可能使用的人不是很
多,但我个人比较喜欢,因为它最大的优点是可以找到启动子区域和其他调控区域。
希望大
家可以发帖交流,让我们把NCBI用的更好!
6
第二部分如何查找连续的mRNA、cDNA、蛋白序列(依
然以人类的IL6为例)
1.进入NCBI主页:
在search后面选择Gene,在for后面填写需要查找的基因的名字。
如图所示:
出现了很多基因序列,在每个序列的右边还有“OrdercDNAclone”的,这些序
列中有些序列是跟你的目的基因同名的,有些是别名(OtherAliases)与你的目的基因一
致,根据每个序列的介绍认真选择你的目的基因。
上图中我需要的IL6是标号为2的序列。
2.1查找cDNA序列
2.1.1点击OrdercDNAclone,出现目的页面如图所示:
2.1.2点击CloneSequence后面的即可得到cDNA序列。
点击后如图所示(只抓
取其中一部分)
2.2查找mRNA、蛋白序列
回到步骤1点击“Go”之后出现的页面,点击目的基因的名字,出现以下页面(只抓取相关部分):
页面的下半部分,即可以获取mRNA和蛋白序列的部分:
找到“NCBIReferenceSequences(RefSeq)”,它分为几个板块,第一个“mRNAand
Protein”区可以让我们找到连续的编码mRNA序列和蛋白序列。
在mRNAandProtein下面有两个序列代码(中间划有一个箭头),这代表了mRNA序列和蛋白序列。
分别点击就可
以得到相应的序列页面。
点击后如图所示,mRNA序列:
NCBIReferenceSequences(RefSeq)的第二个板块是Referenceassembly,它下面显示的是Genomic,点击Genomic下面Referenceassembly对应的Genbank或FASTA即可出现编码的DNA序列(注意:
只是编码序列,其中包括内含子,但一般没有5‘非编码区)。
一步就不做贴图演示了吧,
呵呵。
这样我们就可以找到基因的cDNA序列、连续的编码mRNA序列、蛋白序列以与含有内
含子的编码DNA序列了。
相信这些操作对很多战友还是有用的。
如果大家有更好的方法,欢迎发帖交流!
友情提示:
在NCBI里打开的每一个页面都会给我们提供大量的信息,大家不妨好好看
看,可能会有令我们惊喜的收获!
最后唠叨一句:
最近我实验比较忙,只能在深夜发帖,可能要过几天再发第三部分[Part
three运用STS查找已经公布的引物序列],希望“期待下集”的朋友可以理解。
第三部分运用STS查找已经公布的引物序列
STS,序列标签位点(SequenceTaggedSite):
一段短的DNA序列(200-500个碱基
对),这种序列在染色体上只出现一次,其位置和碱基顺序都是已知的。
在PCR反应中可以
检测处STS来,STS适宜于作为人类基因组的一种地标,据此可以判定DNA的方向和特定序
列的相对位置。
以上内容基本是STS的定义,我主张活学活用,下面就介绍一下我个人用STS数据库查
找引物的一点经验。
还是使用人的IL6基因为例,呵呵
1.打开NCBI主页,在Search后面的下拉菜单选择UniSTS,在FOR后面填写目的基
因。
操作完毕如图所示
这是你会发现NCBI又提供了很多序列,下面我们还是要初步筛选我们需要的序列。
2.根据物种、目的引物所在染色体的位置等选择相应序列(可能不只一个),点击。
下面以点击第一个进入的画面为例。
你会发现这个页面直接就给出了引物序列,PCR之后的片段长度也是给了的(247bp)。
下面还有很多相关的信息……
3.点击GeneBankAccession后面的代码,进入下一个页面。
啊!
前后引物都呈现在眼前了,还有反应体系和反应条件!
其中PrimerA是前引物序
列,PrimerB则是后引物序列,并且给出了他们在DNA序列中的位置。
有兴趣的朋友可以
在序列中找一下,是可以找到的,不过要注意,PCR是双链扩增,在序列中可以直接找到
的是PrimerA的原序列和PrimerB的互补序列。
在步骤二里面我只点开了一个序列,继续打开其他的可能还会有对自己有用的引物,不
过这要你自己慢慢发掘了。
这种寻找引物的方法有点投机取巧的味道,实用程度不是很高,但如果这里面恰好有你
想P的片段的话,恭喜你,这些引物都是很成熟的引物,可以直接拿过来使用了。
如果想寻找引物,大家可以查阅相关论文,已经报道的引物我们为什么不用呢?
!
既省
时间,可靠性又强。
如果这两种方法都不能找到你需要的引物的话,那就自己设计吧,建议使用Primer5和
Oligo。
引物设计的详细内容我在这里就不多说了,推荐两个帖子给大家看一下,第一个是
本版版主liuzeyi2002发起的,内容很丰富,很值得学习,另一个则是我发的。
第四部分如何运用BLAST进行序列比对、检验引物特异性
提到序列比对,绝大多数战友都会想到BLAST,但BLAST的使用确实又是一个很大的难
题,因为他的功能比较强悍,里面涉与到的知识比较多,而且比对结束后输出的结果参数(指
标)又很多。
如果把BLAST的使用详细的都讲出来,我想我发帖发到明天也发不完,更何况
我自己也不是完全懂得BLAST的使用。
所以我在这里也就“画龙点睛”——以比对核酸序列
为例来给大家介绍一下BLAST的使用,也算是BLAST的入门课程吧。
请看帖的战友好好体会,
如果你用心看,在看帖完毕之后BLAST的基本使用(包括其他序列的比对)应该没有问题
了。
1.打开BLAST页面,打开后如图所示:
对上面这个页面进行一下必要的介绍:
BLAST的这个页面主体部分(左面)包括了三部分:
BLASTAssembledGenomes、Basic
BLAST、SpecializedBLAST。
相信大家可以看懂这三个短语的意思,我就不多说了;我要说
的是,可以认为这是三种序列比对的方法,或者说是BLAST的三条途径。
第一部分BLASTAssembledGenomes就是让你选择你要比对的物种,点击相应物种之后即可进入比对页面。
第
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