南方医科大学血清分离和提纯级临床医学二第7实验室.docx

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南方医科大学血清分离和提纯级临床医学二第7实验室

南方医科大学

生物化学实验报告

姓名：

学号

专业年级

生物化学及分子生物学实验教学中心

实验名称

血清清蛋白、γ-球蛋白的分离纯化及定量

实验日期

2016年11月17日

实验地点

第7实验室

指导老师

尹红

评分

教师签名

批改日期

一、实验目的

1.掌握凝胶层析法、盐析法、离子交换层析法分离蛋白质的原理和基本方法； 

 掌握醋酸纤维素薄膜电泳法的原理和基础方法；

3. 了解柱层析技术的原理和相应操作

二、实验原理

血清蛋白主要由清蛋白和球蛋白组成，各行使其重要的功能。

 本实验利用盐析方法将血清中的清蛋白和球蛋白分离，并用电泳技术观察蛋白质分离

1．盐析 

蛋白质分子能稳定存在于水溶液中是因为有两个稳定因素即表面的电荷和水化膜。

当维持蛋白质的稳定因素破坏时，蛋白质分子可相互聚集沉淀而析出，蛋白质分子沉淀析出的方法很多，根据对蛋白质稳定因素破坏的不同有中性盐析法、有机溶溶剂法、重金属盐法以及生物碱试剂法等。

盐析法的原理是：

中性盐如硫酸铵[（NH４）２SO4]等对蛋白质作用破坏了蛋白质表面水化膜，并且中和了部分电荷，从而使蛋白质相互聚集而析出。

由于血清中各种蛋白质分子的颗粒大小、所带电荷的多少和亲水程度不同，故盐析所需的盐浓度也不同，因此调节盐的浓度可使不同的蛋白质沉淀从而达到分离的目的。

血清球蛋白在半饱和状态下发生沉淀，而血清清蛋白在完全饱和状态下沉淀，利用此特性可把蛋白质分段沉淀下来，即在半饱和的中，血清蛋白不沉淀，而血球蛋白沉淀，离心后清蛋白主要在上清液中，沉淀蛋白加少量蒸馏水即可溶解，由此达到分离清蛋白和白蛋白的目的。

2．脱盐 

 盐析得到的蛋白质含有高浓度中性盐，需要有脱盐过程去除蛋白质遗留的中性盐

常用方法有：

透析法脱盐和凝胶层析法脱盐。

本实验采用凝胶层析法脱盐，在葡聚糖凝胶柱中，蛋白质及盐的分子量不同，当样品通过层析柱时，分子量较大的蛋白质因为不能通过网孔而进入凝胶颗粒，沿着凝胶颗粒间的间隙流动，所以流程较短，向前移动速度较快，最先流出层析柱；反之，盐的分子量较小，可通过网孔而进入凝胶颗粒，所以流程长，向前移动速度较慢，流出层析柱的时间较后。

分段收集蛋白质洗脱液，即可得到脱盐的蛋白质。

3.纯化（离子交换层析） 

  离子交换是溶液中的离子和交换剂上的离子进行可逆的的交换过程。

带正电荷的交换剂称为阴离子交换剂；带负电荷的交换剂称为阳离子交换剂。

  本实验采用的DEAE纤维素是一种阴离子交换剂，溶液中带负电荷的离子可及其进行交换结合，带正电荷的点正电荷的离子则不能，这样便可达到分离纯化的目的。

脱盐后的蛋白质溶液尚含有各种球蛋白，利用它们的等电点的不同可进行分离。

血清中各种蛋白质的pI各不相同，因此，在同一醋酸铵缓冲液中，各蛋白质所带的电荷不同，可以通过DEAE离子交换层析将血清清蛋白和伽马球蛋白分离出来。

4.纯度鉴定（电泳） 

  血清中各种蛋白质的等电点不同，一般都低于pH7.4。

它们在pH8.6的缓冲液中均解离带负电荷，在电场中向正极移动。

由于血浆中各种蛋白质分子大小、形状及所带的电荷量不同，因而在醋酸纤维素薄膜上电泳的速度也不同。

因此可以将它们分离为清蛋白（Albumin）、α1-球蛋白、α2-球蛋白、β-球蛋白、γ-球蛋白5条区带。

三、材料及方法：

（一）材料

人血清

试剂

饱和硫酸铵溶液

0.02mol/lpH值为6.5的醋酸铵缓冲液

0.06mol/l的PH值为6.5醋酸铵缓冲液

0.3mol/l的PH值为6.5醋酸铵缓冲液

1.5mol/l的NaCl-0.3mol/NH4Ac溶液

20%磺基水杨酸

1%BaCl2溶液

仪器和器材

二乙基氨基乙基（DEAE）纤维素离子交换层析柱和葡聚糖凝胶G-25（Sephadex G-25）层析柱烧杯、1ml和10ml的吸管、滴管、试管、黑色反应板、铁固定架、螺旋夹

电泳槽和电泳仪

步骤

操作

现象

（1）盐析

取离心管一个，加入0.8mol人或动物血清，边摇边缓慢滴入饱和硫酸铵溶液0.8ml，混匀后室温下放置10min，离心10min（4000r/min）。

用滴管小心吸出上清液置于试管中，作为纯化清蛋白之用

溶液由淡黄色透明状转变为白色浊液，离心后溶液分层，上层澄清，下层为白色沉淀

（2）溶解沉淀

向离心管的沉淀加入0.6mol蒸馏水，振摇使之溶解，作为纯化γ球蛋白用

白色沉淀完全溶解，液面有泡沫产生

步骤

操作

现象

（1）调节层析柱液面

葡萄糖凝胶G-25层析柱经0.02mol/L、pH6.5 NH4AC缓冲液流洗平衡后，取下恒压储液瓶管塞，小心控制柱下端螺旋夹，使层析柱上的缓冲液面刚好下降到凝胶床液面 

液体缓慢低落，约每三秒钟两滴

（2）加样品

用细长滴管吸取上述经盐析所得的粗制蛋白质溶液，小心而缓慢的加入凝胶床上面，柱下端用10ml刻度离心管接液，拧松柱下螺旋夹，调节适当流速，使样品进入凝胶床，至液面降到凝胶床表面为止

3）洗层析柱

 小心用0.02mol/L、pH6.5 NH4AC缓冲液洗涤层析柱内壁，以洗涤粘在柱壁上的蛋白质样品液 

（4）洗脱

待样品液进入凝胶床内，继续用0.02mol/L、pH6.5 NH4AC缓冲液流洗，同时注意流出液量

（5）检测及收集蛋白质

 在黑色反应板凹孔内加2滴0.92mol/L磺基水杨酸，随时检查流出液是否含有蛋白质，①滴流出液1滴黑色反应板凹孔内接触到磺基水杨酸溶液，若出先白色混浊或沉淀，表示已有蛋白质流出（当凝胶床体积为5.5ml时，流出的液体量约为2ml就可能有蛋白质流出），立即收集流出的蛋白质溶液。

②收集约12滴后，滴流出液1滴于预先加有1滴0.05mol/L（1%）BaCl2的黑色反应板凹孔内，一旦见出现白色沉淀（表示有SO42-），立即停止收集 收集的蛋白质溶液即可分别过DEAE纤维素柱，进行离子交换层析 

磺基水杨酸在接受层析柱低落液前两次显现澄清，第三次产生白色沉淀，黑色板孔氯化钡部分第一次即出现白色沉淀

（6）层析柱再生平

衡

收集蛋白质溶液后的凝胶层析柱继续用0.02mol/L pH6.5 NH4AC缓冲液流洗，用BaCl2液检测层析柱流出液，当流出液用BaCl2检查SO42-为阴性后，继续洗涤2~3ml。

凝胶层析柱即可再生平衡，可再次使用

氯化钡部分在连续接受几次滴入后沉淀颜色变淡，直至完全无沉淀

③ 球蛋白的纯化：

过DEAE纤维素阴离子交换层析柱

步骤 

操作

现象

（1）调节层析柱换冲液面

经处理再生好的DEAE纤维素层析柱，取下其恒压储液瓶管塞。

小心控制柱下端螺旋夹，使柱上缓冲液面刚好下降到纤维素床表面。

柱下端用10ml刻度离心管收集液体，以便了解加样后液体的流出量。

2）加样品

 将除除盐后收集的球蛋白溶液缓慢加到纤维素柱上，调节层析柱下端的螺旋夹使样品进入纤维素柱床，至液面降到纤维素柱床表面为止。

（3）洗层析柱

 小心用1ml 0.02mol/L PH 6.5的醋酸铵缓冲液洗涤沾在柱壁上的蛋白质样品液。

（4）洗脱

 待样品进入纤维素柱床内，继续用0.02mol/L PH 6.5的醋酸铵缓冲液流洗，同时注意流出液量 

（5）检测及收集蛋白质

 流洗时，随时用0.92mol/L磺基水杨酸检查流出液中是否含蛋白质（方法同前）当有蛋白质出现时，立即连续收集三管，每管10滴，此不被DEAE纤维素吸附的蛋白质即为纯化的γ-球蛋白，取其中蛋白质浓度最高的一管留作鉴定用。

现象同前

注意：

a.当层析柱的缓冲液面或样品液面刚好下降到纤维素床表面时，不要使液面低于纤维素膜表面，以免空气进入凝胶床。

b.往层析住加样品或缓冲液洗脱事，要小心缓慢加入，不要将纤维素冲起或破坏纤维素床表面平整。

C.切勿将检测蛋白质的磺基水杨酸及检查硫酸根的氯化钡混淆，因为二者相应生成物的沉淀均为白色。

d.洗脱是应注意及时收集样品，切勿使蛋白质峰溶液流失。

e.葡萄糖凝胶价钱昂贵，要回收再生避免损耗，严禁倒掉。

步骤

操作

准备

电泳槽准备：

将电泳槽置于水平平台上，两侧注入等量的巴比妥缓冲溶液，使其在同一水平a，页面及支架距离2~2.5cm，用三层滤纸或双层纱布搭桥 

薄膜准备

将醋酸纤维薄膜裁成2cm乘以8cm大小共四段，在薄膜一段1.5cm处用铅笔轻轻画上一条横线为点样线，末端用铅笔做记号。

进入巴比妥溶液中直至浸润完全。

用镊子青青取出，粗面朝上，平放在两层干滤纸中间，轻轻拭去多余的缓冲液。

醋酸纤维膜有光面和粗面两面，粗面呈现哑光样，在此面做标记

点样

 薄膜片置于干净的玻璃或滤纸片上，粗面朝上，用玻片或载玻片一段的截面在盛有样品的直接沾取2~3微升待测品，让后将样品及薄膜点样先轻轻接触，均匀分布在点样线上，带样品渗入薄膜后移开，四种样品分别点样。

接触后无明显现象

电泳

将已点好的样品薄膜放在铺有滤纸盐桥的电泳槽上，点样面朝下，点样端至阴极，轻轻拉平薄膜。

平衡约5min，使缓冲液渗透大道平衡。

接好电路，调节电压开始电泳。

待各个样品没有变化停止电泳，并轻轻取出。

染色漂洗和鉴定

将染色液倒入大培养皿中，电泳完毕后用镊子取出薄膜，直接浸入染色约5min。

后将薄膜取出，漂洗至背景无色，观察电泳情况

醋酸纤维膜洗脱后表面呈现出蓝色条带，条带样见下文

实验过程中的现象已于上各表中列出

四、结果及讨论：

实验结果如图所示：

根据相同类型蛋白质有相同电泳距离的规律，本组判定：

图中B组为人血清的电泳结果，A,C,D三组及B组比较判定：

图中从左至右分别为γ-球蛋白、血清样本、清蛋白2和清蛋白1的电泳结果。

对结果的讨论：

1、图中可以看出清蛋白2的电泳调到在最深色条带之前有少不明显的染色区段，该现象的原因可能为该条带的点样为首次分理出的清蛋白还含有少数球蛋白，故在电泳时停留在这些区段而显色。

2、图中清蛋白1及血清样的条带有些许弯曲，该现象可能是由于点样是点样用盖玻片边缘宽度过宽导致边缘效应的产生。

还可能由于点样过多导致点样区不均匀造成。

3、有某些组的显色结果不明显或不显色，这可能是由于点样过少造成。

思考题：

1.硫酸铵盐析一步,为什么是0.8ml血清加0.8ml饱和硫酸铵?

半饱和状态下的血清球蛋白在硫酸铵溶液中将沉淀，血清清蛋白在不饱和的硫酸铵溶液中溶解，将血清和饱和硫酸铵等体积混合后，配出半饱和的硫酸铵溶液，在此状态下，球蛋白沉淀，而清蛋白不沉淀，因而可以将其分开。

2.为什么实验中DEAE纤维素柱分离γ-球蛋白后不用再生,可直接用于纯化清蛋白?

答：

γ-球蛋白为带正电荷蛋白，故不在DEAE中结合而直接从层析柱中洗脱出来，造成两种蛋白的流出速度不同所以分离γ-球蛋白后可直接用于纯化清蛋白。

3.应用醋酸纤维素薄膜电泳鉴定分离纯化后的血清清蛋白和γ-球蛋白的纯度,根据什么来确定它是清蛋白还是γ-球蛋白?

判定它们纯度的依据是什么?

答：

由于在醋酸纤维素薄膜上电泳的速度因血浆中各蛋白分子量、结果及电荷量不同而不同，实验得电泳带位置因此有差异。

血清5种蛋白成分，血清蛋白的等电点最低、分子量最小，γ-球蛋白两者均最大，另外血清蛋白的含量远高于γ-球蛋白，所以在血清的电泳结果中，最后色浅者为γ-球蛋白，最前色深者为血清蛋白（本组实验结果呈现不明显）。

故将对比醋酸纤维素薄膜的电泳带，即知纯化后的液体中蛋白组分。