流式细胞仪检测细胞周期操作步骤.docx
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流式细胞仪检测细胞周期操作步骤
流式细胞仪检测细胞周期操作步骤
取对数生长期得A549细胞,按1×106cells/mL以1mL接种于100mm培养皿内
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24h后,进行所需得处理(比如加药,照射)
↓
特定时间后终止培养,进行下一步得实验
↓
收集原培养液,洗后得PBS与消化后得细胞,将三者混匀放入15ml离心管中
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1000rpm离心5min(短时低速离心)
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弃上清,用1。
5ml预冷PBS,1000rpm离心5min后去除PBS与细胞悬液内得细胞碎片
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加入1、5ml预冷PBS,在涡旋状态下加入3。
5ml无水乙醇,混匀后,于4℃固定30min,或—20℃长期保存。
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1000r/min,离心5min
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将乙醇吸除,加PBS清洗混匀
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1000r/min,5min再离心一遍,将残留在细胞上得乙醇除去
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吸除离心管内PBS,加入200ulPBS与2ul得RNA酶(0。
25mg/ml)(37℃下孵育30min)
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加入0、5ml得50ug/ml得PI溶液室温下避光染色30min
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将离心管内得细胞过滤(300um尼龙网膜)至含有PBS得EP管中(PI具有很强得粘附性,容易使细胞聚团),标记EP管
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开机(先开仪器后开软件)
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流式细胞仪得结构一般分为5部分:
①流动室及液流驱动系统;② 激光光源及光束成形系统;③ 光学系统;④信号检测、存贮、显示、分析系统;⑤细胞分选系统。
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检测前先涡旋使细胞混匀悬浮呈单个细胞,然后插入流式细胞仪上
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流动室内充满鞘液,细胞排成单列由喷嘴中心喷出,形成细胞液柱
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液柱与激光束相交,细胞上得荧光染料被激发产生荧光(488nm激发光源)
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荧光信号变成电信号输出到计算机,软件分析(荧光染料与细胞DNA分子特异性结合,可以检测出细胞周期各时相细胞比例)
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在用第三方软件分析之前,将流式结果按如下所示导出
结果分析-—Modfit软件分析
——Flowjo软件分析
FCM-DNA 量分析1个细胞增殖群时,可将DNA含量分布组方图分为三部分,即 G0/1、S、G2M。
G0/1与G2M细胞峰得 DNA分布均为正态分布,S期可以认为就是一个加宽得正态分布
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检测结果刻录光盘保存
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关机(先关软件后关仪器,关机前需清洗)
正常细胞DNA含量:
2n—4n
凋亡细胞:
核内DNA断裂,乙醇固定后膜通透性增加,小片段DNA穿膜丢失,胞内DNA含量减少、PI染色后,荧光强度减小而形成一个DNA含量小于2n得分布区(亚G1峰)。
1、纵坐标CellNumber:
即计数得有效细胞数;
2、横坐标DNA Content:
即DNA含量;
3、G1、G2、S三期在图中已经标示;
4、右侧数字含义:
DipG1-53。
84%at55、56,即G1期DNA含量平均值为55、56;53、84%即G1期细胞数占总数得53。
84%;DipG2-5。
64%at107。
72,即G2期DNA含量平均值为107、72,5.64%即G2期细胞数占总数得5、64%;
AnnexinV-EGFP/PI双染法检测细胞凋亡
基本原理:
磷脂酰丝氨酸(PS)能与连接素Ⅴ(AnnexinⅤ)发生特异结合;PI就是核酸荧光染料,不能透过正常细胞膜,只能进入已经破损得细胞膜,在嵌入双链DNA后释放红色荧光,荧光强度与PI结合量呈良好得线性关系。
正常细胞:
膜完整,PS不外翻-—PI-/AnnexinⅤ—
凋亡早期:
膜完整,PS翻转-—PI-/AnnexinⅤ+
凋亡晚期:
PS外翻,膜通透性增加——PI+/AnnexinⅤ+
坏死细胞:
膜严重破损,PS不外翻——PI+/AnnexinⅤ+
几乎不存在膜结构——PI+/AnnexinⅤ-
实验步骤:
取对数生长期得细胞,按1×106 cells/mL以1mL接种于培养皿内
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24h后,进行所需得处理(比如加入药物)
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特定时间后终止培养,进行下一步得实验
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细胞用0.25%胰酶37℃消化5min(胰酶消化时间不易过长,以防引起假阳性)
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加入PBS制成细胞悬液(移液枪吹打6-8次)
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倒置显微镜下观察细胞状态(单个分离悬浮)
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将细胞悬液移入15ml离心管中
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2000rpm离心5min,PBS吸除
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用PBS清洗细胞2次(2000rpm,离心5min收集细胞)
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用400ul 1×BindingBuffer悬浮细胞(浓度大约为1×106cells/ml)
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在细胞悬液中加入5ul AnnexinV—EGFP,轻轻混匀后于2-8℃避光条件下孵育15 min
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加入10ulPI后轻轻混匀,于2-8℃避光条件下孵育5 min
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在1 h内用流式细胞仪检测
流式细胞仪激发光波长采用Ex。
=488nm双波长激发,Em、=510nm检测EGFP荧光(FL1channel)与>575nm得发射波长检测PI。
细胞应可分成三个亚群:
活细胞仅有很低得荧光强度,凋亡细胞有较强得绿色荧光,坏死细胞(包括极晚期凋亡细胞)有绿色与红色荧光双重染色。
在流式细胞术双参数散点图上左下象限显示活细胞,为(Annexin V—/PI-);右上象限就是非活细胞,即坏死细胞,为AnnexinV+/PI+;而右下象限为凋亡细胞,显现AnnexinV+/PI-。
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