实验室指标测定方法.docx
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实验室指标测定方法
实验常规指标测定及实验仪器的使用
采后生理实验室
1、Vc(mg/100g)采用碘量法测定1
2、可滴定酸(%)参考国标(GB/T12456—90)——NaOH滴定法3
3、可溶性固形物(%)5
4、呼吸强度(mgCO2·Kg-1·FW·h-1)的测定6
5、乙烯生成速率(µL·Kg-1·h-1)7
6、氧气生成速率测定8
7、叶绿素含量测定10
8、果实硬度(kg·cm-2)11
9、细胞膜相对透性:
电导仪法测定12
10、乙醇、乙醛含量测定13
11、丙二醛(MDA)硫代巴比妥酸比色法14
12、多酚氧化酶(PPO)15
13、苯丙氨酸解氨酶(PAL)活性测定16
14、过氧化物酶活性(POD)测定17
15、多酚类物质18
16、总酚含量的测定19
17、超氧化物歧化酶(SOD)测定20
18、聚半乳糖醛酸梅活性的测定22
19、果胶甲酯酶(PE)活性:
酸碱滴定法-朱广廉24
20、过氧化氢酶(CAT)活性的测定25
21、GSH的测定26
22、PAL活性测定27
23、1-氨基环丙烷—1-羧酸含量(ACCcontent)的测定:
28
24、ACC合成酶活性(ACCsynthaseactivity)测定:
29
25、ACC氧化酶活性(ACCoxidaseactivity)的测定:
30
26、游离脯氨酸含量的测定-----磺基水杨酸法书180页31
27、脂氧合酶活性(△OD234/gFW·min):
33
28、乙醇酸氧化酶活性的测定34
29、果胶含量(中国农牧渔业部部标准果胶的测定NY82.11-1988)36
30、PE38
31、PG(植物生理学实验手册-144)39
32、纤维素测定方法—————酸性洗涤法40
33、霉变指数41
34、带菌率42
35、褐变度43
36、病害体积(PVD):
44
37、果皮颜色的测定45
38、显微镜操作46
39、色差计使用方法47
1、Vc(mg/100g)采用碘量法测定
仪器:
三角瓶;容量瓶;滴定管;移液管;脱脂棉;漏斗
试剂:
1%淀粉:
取1g可湿性淀粉,先用10ml蒸馏水调匀,然后加90ml蒸馏水煮沸,边煮边搅拌,使其透明为止。
1%草酸:
取草酸10g,用蒸馏水定容至1000ml备用。
0.01mol/L碘液的配制与标定:
配制:
取碘化钾(化学纯)3g,置于1000ml容量瓶中,少量蒸馏水溶解后,加入碘(化学纯)2.5g,振荡溶解后用蒸馏水定容至1000ml。
(注:
用时需适当稀释,以便于读数。
)
标定:
取抗坏血酸(化学纯)0.02g(20mg)置于250ml容量瓶,用1%草酸溶液定容,吸取10ml抗坏血酸标准液,置于100ml三角瓶中,加1%淀粉1ml,再加1%草酸20ml,用标准碘液滴定至蓝色,同时吸取10ml蒸馏水按同样方法做空白滴定,15s不褪色为止。
按公式计算碘液的滴定度:
H(mg/ml)=(W×P/Q)/(V1-V2)
式中:
H—每毫升碘液相当于抗坏血酸的毫克数mg/ml;
W—抗坏血酸的重量mg;
P—用来滴定得抗坏血酸得毫升数ml;
Q—抗坏血酸用草酸定容的毫升数ml;
V1—滴定时消耗碘液的毫升数ml;
V2—空白滴定时消耗碘液的毫升数ml。
方法:
称取匀浆15g,移入100ml容量瓶中,用1%草酸定容至刻度,用脱脂棉过滤。
吸取10ml滤液,置于100ml三角瓶中,加1%淀粉1ml,再加1%草酸20ml,用标准碘液滴定至蓝色,15s不褪色为止,记下消耗碘液的毫升数。
每个样品重复滴定3次,取其平均值,并做空白实验。
X=
H×(V1-V2)×F
×100
m
式中:
X—每100g样品中Vc的mg数,mg/100g;
H—碘液的滴定度,mg/mL;
V1—滴定时消耗碘液的毫升数mL;
V2—空白滴定时消耗碘液的毫升数mL;
F—试液的稀释倍数;
m—试样质量,g。
注明:
芦笋试验中:
称5g匀浆,用草酸定容到50mL,吸取10mL滤液,加淀粉1mL,20mL草酸。
黄瓜(油菜、西芹等):
取匀浆20g,用草酸定容到100mL,吸取30mL滤液,加淀粉指示剂1mL,20mL草酸。
樱桃:
取15g,用草酸定容到100mL,吸取20mL滤液,加淀粉1mL,20mL草酸。
葡萄:
枣:
2、可滴定酸(%)参考国标(GB/T12456—90)——NaOH滴定法
试剂:
0.1mol/LNaOH溶液:
称取NaOH4g,溶于1000ml煮沸并冷却的蒸馏水(用时适当稀释)
1%酚酞指示剂:
称取1g酚酞,溶于100ml95%的乙醇中
仪器:
碱式滴定管(25ml);容量瓶(250ml);移液管(20ml);三角瓶(100ml);漏斗;纱布
组织捣碎机;分析天平
操作步骤:
称取打成匀浆的均匀样品20g,用漏斗转入250ml容量瓶,加蒸馏水至刻度,放置30min(摇动2-3次),混合均匀后,用六层纱布过滤。
吸取20ml滤液与三角瓶中,加酚酞指示剂2滴,用0.005mol/LNaOH溶液滴至粉红色,持续1分钟不褪色,记下NaOH溶液用量。
每个样品重复滴定3次,取其平均值。
结果处理:
含酸量X(%)=
V×N×K×(250÷20)
×100
=
83.75×V×N
W
W
式中:
X—以苹果酸计的总算百分含量(%);
V—滴定时消耗NaOH溶液的毫升数;
N—NaOH溶液浓度(mol/L);
W—样品鲜重(g);
K—换算系数,取0.067(以苹果酸计)
注意:
1、有些果蔬容易榨汁,而其汁液含酸量能代表果蔬含酸量,可以榨汁取定量汁液(10ml)稀释后(加蒸馏水20ml),直接用0.1mol氢氧化钠溶液滴定。
2、本实验配制溶液用水及稀释定容用水均为去二氧化碳的蒸馏水
3、各种有机酸当量值:
苹果酸0.067;柠檬酸0.064;酒石酸0.065。
因食品中含有多种有机酸,总酸度测定结果通常以样品中含量最多的那种酸表示。
一般分析葡萄及其制品时,用酒石酸表示,其K=0.075;分析柑橘类果实及其制品时,用柠檬酸表示,K=0.064或0.070(带一分子水),分析苹果,核果类果实及其制品时,用苹果酸表示,K=0.067,分析乳品,肉类,水产品及其制品时,用乳酸表示,K=0.090,分析酒类,调味品时,用乙酸表示,K=0.060。
4、0.1mol/LNaOH标准溶液:
称取氢氧化钠(AR)120g于250ml烧杯中,加入蒸馏水100ml,振摇使其溶解,冷却后置于聚乙塑料瓶中,密封,放置数日澄清后,取上清液5.6ml加新煮沸过并已冷却的蒸馏水至1000ml,摇匀。
标定:
精密称取0.6g(准确至0.0001g)在105~110℃干燥至恒重的基准邻苯二甲酸氢钾,加50ml新煮沸过的冷蒸馏水,振摇使其溶解,加二滴酚酞指示剂,用配制的NaOH标准溶液滴定至溶液呈微红色30秒不褪.同时做空白实验.计算:
c=
m×1000
(V1-V2)×204.2
式中:
c—氢氧化钠标准溶液的摩尔浓度,mol/L;
m—基准邻苯二甲酸氢钾的质量,g;
V1—标定时所耗用氢氧化钠标准溶液的体积,,mL;
V2—空白实验中所耗用氢氧化钠标准溶液的体积,mL;
204.2—邻苯二甲酸氢钾的摩尔含量,g/mol。
5、原理:
食品中的有机弱酸在用标准碱液滴定时,被中和生成盐类。
用酚酞作指示剂,当滴定至终点(PH=8.2,指示剂显红色)时,根据耗用标准碱液的体积,可计算出样品中总酸含量。
注明:
芦笋试验中:
取10g匀浆,加50mL蒸馏水,滤纸过滤,取20mL滤液,加入2滴酚酞指示剂,用0.05mol/LnaOH滴定至粉红色。
黄瓜(油菜、西芹等):
樱桃:
取10g匀浆,用蒸馏水定容到100mL的容量瓶,脱脂棉过滤,吸取滤液20mL,加3滴石蕊,每个样品重复3次(NaOH浓度0.05mol/L)
葡萄:
枣:
3、可溶性固形物(%)
仪器:
洗瓶;大烧杯;脱脂棉;镊子
方法:
采用pocketrefractometerPAL-1测定,每次取4个果,单果重复4次用镊子取汁测定。
4、呼吸强度(mgCO2·Kg-1·FW·h-1)的测定
方法1:
呼吸强度采用GXH-3051型便携式红外线分析测定仪测定;
方法2:
用气相色谱法测定。
取大小一致鸭梨果实9个,分别称重后,分三组置于经空气平衡的8L玻璃真空干燥器中,密闭30min,用10ml注射器从干燥器顶部取出部分气体,再从注射器中取1ml气体,用气相色谱测定,根据制作的CO2标准曲线计算果实呼吸释放出的CO2含量,果实呼吸强度以mLCO2·kg-1·h-1表示,重复3次。
气相色谱(GC7890F,上海天美公司)配置有CO2转化炉、氢火焰检测器(FID)和不锈钢填充柱(Porapak80-100),柱长2m,载气N2,进样温度120oC,柱温60℃,检测温度360℃。
呼吸强度(mlCO2·Kg-1·h-1)=
测得的CO2含量×(玻璃罐体积-果实体积)
果实总重量×密闭时间
5、乙烯生成速率(µL·Kg-1·h-1)
采用岛津2010型气相色谱仪法测定;
每次将5个葡萄果实置于350ml干燥瓶内,密闭4h后取样20ml,用岛津2010气相色谱仪程序升温法测定乙烯含量。
采用外标法计算,标样的体积分数为50μL·L-1
色谱柱与条件:
Agilent,DB-5(长30m,内径0.25mm,膜厚0.25μm);检测器:
FID,温度230℃;进样口:
温度120oC;升温程序:
80℃保持2min,6℃/min升温至230℃,保持1min。
载气:
N2,流速24ml/min;尾吹气:
N2,流速30ml/min。
尾吹:
30ml/min。
乙烯的体积分数(μL·L-1)=
样品峰面积×标样的体积分数
标样峰面积
乙烯的生成速率(µL·Kg-1·h-1)=
乙烯的体积分数×(玻璃罐体积-果实体积)
(密封时间×样品质量)
6、氧气生成速率测定
仪器:
①分光光度计;②离心机;③恒温水浴或恒温箱;④真空泵。
药品:
150nmol/L磷酸缓冲液pH7.8:
取A液(3.12gNaH2PO4·2H2O配成100ml)8.5ml,B液(7.17gNa2HPO4·12H2O配成100ml)91.5ml混合后定容至400ml即可;
2②10mmol/L盐酸羟胺:
称取6.9mgNH2OH·HCL用磷酸缓冲液pH7.8配成100ml(现用现配);
3③17mmol·L-1对氨基苯磺酸:
称取0.2944g对氨基苯磺酸,用30%乙酸微加热溶解后定容成100ml;
4④100μmol·L-1亚硝酸钠:
取6.9mg亚硝酸钠用蒸馏水配制成100ml。
(1)NO2-标准曲线的制作:
取7支试管,按表1加入各试剂用量,加完试剂摇匀,10分钟后测A530,以1号试管溶液调零。
以NO2-浓度能够为横坐标,A530值为纵坐标绘制标准曲线。
见表:
试管号
1
2
3
4
5
6
7
亚硝酸钠
0
0.1
0.2
0.4
0.6
0.8
1.0
磷酸缓冲液
2
1.9
1.8
1.6
1.4
1.2
1.0
对氨基苯磺酸
1
1
1
1
1
1
1
α—萘胺
1
1
1
1
1
1
1
NO2浓度(nmol/ml)
0
2-5
5
10
15
20
25
(2)样品测定:
①NO2-培育:
取试材样1g,放入10ml试管中并加入5ml10mmol·L-1盐酸羟胺,真空渗入后,将试管置于30℃温箱中温育45分钟,以使样品体内产生的O2·-与NH2OH·HCL充分反应,生成NO2-。
②显色测定:
样品温育结束后,从样品试管中吸取2ml溶液,与1ml对氨基苯磺酸和1mlα-萘胺充分混合,约10分钟完成显色反应,显色后的混合液,如有混浊可在2500×g条件下离心10分钟,取上清液测A530。
以50mmol·L-1磷酸缓冲液2mlPH7.7,对氨基苯磺酸1ml,α-萘胺1ml混合后调零。
(3)结果计算:
测得样品A530值后,在标准曲线上查出相应的NO2浓度,然后进行O2计算。
O2·-产生速率(O2·-nmol/min·gFw)=
O2·-产生量
NH2OH育温时间(min)×样品重(g)
=
[NO2-]×2×4×V/a
min×gFw
式中:
4为反应体系毫升数
V:
为样品提取液总量(ml)
a:
为测定用样品提取液量(ml)
7、叶绿素含量测定
(1)材料:
新鲜(或烘干)的植物叶片
(2)仪器设备:
分光光度计;研钵2套;剪刀;玻棒;25ml棕色容量瓶3个;小漏斗3个;直径7cm定量滤纸;吸水纸;擦境纸;滴管;电子顶载天平(1/100g感量)。
(3)试剂:
95%乙醇(或80%丙酮);石英砂;碳酸钙粉
(4)实验步骤:
1).取新鲜植物叶片(或其他绿色组织)或干材料,擦净组织表面污物,剪碎(去掉中脉),混匀。
2).称取剪碎的新鲜样品0.2g,共3份,分别放入研钵中,加少量石英砂和碳酸钙粉及2~3ml95%乙醇(或80%丙酮)研成匀浆,再加乙醇10ml,继续研磨至组织变白,静置3~5min。
3).取滤纸1张,置漏斗中,用乙醇湿润,沿玻棒把提取液倒入漏斗中,过滤到25ml棕色容量瓶中,用少量乙醇冲洗研钵、研棒及残渣数次,最后连同残渣一起倒入漏斗中。
4).用滴管吸取乙醇,将滤纸上的叶绿体色素全部洗入容量瓶中。
直至滤纸和残渣中无绿色为止。
最后用乙醇定容至25ml,摇匀。
5).把叶绿体色素提取液倒入比色杯内。
以96%乙醇为空白,在波长665nm、649nm和470nm下测定光密度。
6)、如用95%乙醇计算公式:
Ca=13.95D665–6.88D649
Cb=24.96D649–7.32D665
Cx·c=(1000D470–2.05Ca–114.8Cb)/245
如用80%丙酮计算公式:
Ca=12.21D663–2.81D646
Cb=20.13D646–5.03D663
Cx·c=(1000D470–3.27Ca–104Cb)/229
式中:
Ca、Cb分别为叶绿素a和b的浓度;Cx·C为类胡萝卜素的总浓度;D663、D646和D470分别为叶绿体色素提取液在波长663nm、646nm和470nm下的光密度,叶绿素a、b在95%乙醇中最大吸收峰的波长分别为665nm和649nm,类胡萝卜素为470nm。
7).求得色素的浓度后再按下式计算组织中各色素的含量(用mg/g鲜重或干重表示):
色素的浓度X提取液体积X稀释倍数
叶绿体色素含量=-------------------------------------------------------------(mg/g)
样品鲜重(或干重)
注明:
芦笋试验中:
称1g匀浆,加20mL95%乙醇,滤纸过滤在波长665nm,649nm,470nm下测定吸光值。
樱桃:
葡萄:
枣:
8、果实硬度(kg·cm-2)
仪器:
去皮器
方法:
采用英国产TA.XT.Plus物性测定仪测定,每次取4个果在胴部去皮测定,单果重复4次取最大力,最后取其平均值;测试深度为10mm,P/2柱头(2mmØ),测试速度为2mm/sec。
(1)双击TextureExponent32
(2)关闭NotRegosterel
(3)Selectauser点OK
(4)进入TEE32界面,进入过程中,将其他所有窗都关闭
(5)点File选择New,双击Graph,最大化该窗口
(6)点TA
(7)将所测物品在载物台上放好
(8)点QuickTestRun
(9)点Library选ReturntoStartSeQ
(10)点Updataproject
(11)点File选SAVE
9、细胞膜相对透性:
电导仪法测定
用DDS-A型电导仪上海雷磁仪器厂生产测定,采用1cm直径的打孔器在5个果实赤道线上,去皮后即刻切取1mm厚薄片15个,置小烧杯中,加30mL去离子水,立即测其电导率P0,10min后测其电导率P1,然后煮沸5min,冷却至室温,并加水至刻度,测其电导率P2膜相对透性=P1-P0/P2-P0×100%膜相对透性测定重复3次,取其平均值.硬果率以每次测定时果肉硬度大于3.0Kg·cm-2的果实数目占最初总果实数目的百分比表示.。
(1)果皮相对电导率:
电导仪法测定
仪器:
小烧杯;三角瓶;洗瓶;纱布;电炉
方法:
用DDS-11A型电导仪测定,取大小一致的果皮20片(做2个重复),蒸馏水冲洗2次用干净纱布吸干水分置三角瓶中,加30mL蒸馏水,在振荡器上30℃振荡1h后测其电导率P1,然后倒入烧杯中煮沸10min以杀死植物组织,冷却至室温加水至刻度并在室温下平衡10min,测其电导率P2,重复3次,取其平均值。
膜相对电导率=P1-P0/P2-P0
P0—空白电导率℃(蒸馏水的电导率)
(2)果肉相对电导率:
电导仪法测定
仪器:
小烧杯;三角瓶;洗瓶;纱布;电炉
方法:
用DDS-11A型电导仪测定,取大小一致的果肉20片(做2个重复),蒸馏水冲洗2次用干净纱布吸干水分置三角瓶中,加30mL蒸馏水,在振荡器上30℃振荡1h后测其电导率P1,然后倒入烧杯中煮沸10min以杀死植物组织,冷却至室温加水至刻度并在室温下平衡10min,测其电导率P2,重复3次,取其平均值。
膜相对电导率=P1-P0/P2-P0
P0—空白电导率℃
10、乙醇、乙醛含量测定
取20粒葡萄,去皮去核后打浆后,称取20g匀浆样品,用200ml蒸馏水转入烧瓶中,用电热套加热蒸馏出100ml混合液。
气相色谱条件:
(岛津2010型)配置FID检测器和毛细管玻璃柱(DB-WAX)。
载气N2,流速14ml/min,进样量为1μl。
柱温100℃,气化室温度150℃,检测器温度100℃。
11、丙二醛(MDA)硫代巴比妥酸比色法
作者:
郝再彬等,《植物生理实验》哈尔滨工业大学出版社,哈尔滨,2004,9。
试剂:
0.6%硫代巴比妥酸(TBA):
称0.6g硫代巴比妥酸用100ml10%三氯乙酸溶液定容或用热的蒸馏水溶解后定容(现配现用)。
10%三氯乙酸(TCA):
10gTCA用水定容至100ml。
方法:
称取试样5g,加10ml质量分数为10%三氯乙酸溶液,研磨至匀浆,10000r/min下离心20min;取上清液2ml(对照加3ml10%TCA溶液),加入2ml质量分数为0.6%硫代巴比妥酸(TBA)溶液,混匀后沸水浴上反应30min,迅速冷却后再离心(如澄清可以不离心)。
取上清液测定450、532、600nm波长下的吸光度。
计算:
按下式计算MDA的含量(%):
c1=11.71A450
c2=6.45(A532﹣A600)﹣0.56A450
式中:
c1—可溶性糖的浓度,mmol·L-1
c2—MDA浓度,μmol·L-1
A450、A532、A600分别代表450、532和600nm波长下的吸光度值。
按下式算出MDA的浓度(μmol·g-1):
MDA质量摩尔浓度(μmol·g-1)=c·N·W-1
式中:
c—MDA的浓度,μmol·L-1;
N—提取液体积,ml;
W—植物组织鲜重,g
12、多酚氧化酶(PPO)
方法一:
1)0.05mol/LpH6.5磷酸缓冲液
2)0.1mol/L儿茶酚(邻二甲苯):
称取1.101g溶于100ml蒸馏水中
酶液提取:
5g样品于预冷的研钵中,加入适量0.05mol/LPH6.5的磷酸缓冲液(总用量10ml),冰浴研磨成匀浆,4℃10000g离心20分钟,上清夜即为酶提取液。
活性测定:
(做两组重复实验)3.9ml0.05mol/LPH6.5的磷酸缓冲液+1ml0.1mol/L儿茶酚+2ml酶提取液,以煮过失活的酶液为对照。
37℃水浴保温10分钟,立即在420nm下测定吸光度值,30秒读一次,记录5min内得值。
计算:
酶活力=
△A×D
0.01×t
酶的比活力(0.01△A﹒g-1FW﹒min-1)=
△A×D
0.01×t×W
式中:
△A—反应时间内吸光度的变化
D—稀释倍数即提取的总酶液为反应系统内酶液体积的倍数
t—反应时间(min)
W—果肉重(g)
方法二:
比色法[21,22,23]
酶液提取:
取5g果肉,于10ml的0.05mol/l磷酸缓冲液中(pH=6.5),冰浴研磨,在4℃下10000r/min进行冷冻离心20min,取上清液进行酶活测定。
酶活测定方法:
参照Galeazzi(1981)的方法,并加以改进:
向试管中加入3.9ml0.05mol/lpH=6.5磷酸缓冲液,加2ml粗酶提取液,对照用煮沸5min的酶液,于37℃水浴中平衡10min,取出试管向其中1ml0.1mol/l的儿茶酚,立即计时,记录随后3min内溶液在420nm处的吸光度变化,每30s读数一次。
重复三次。
以每分钟变化0.1吸光度值所需酶量为一个酶活单位,用⊿A420nm·min-1·g-1·FW表示:
13、苯丙氨酸解氨酶(PAL)活性测定
参照薛应龙等人的方法进行,略有改进。
定期取果5个,去皮去核,剪碎混匀后取1g果肉于预冷的研钵中,加入0.1克聚乙烯吡咯烷酮(PVP),加入10ml含5mmol/L巯基乙醇的0.05mmol/L的0.05M硼酸缓冲液(pH8.8),冰浴研磨,10000转/分离心20分钟,上清液用于酶活测定。
取上清液1mL酶液,加入2ml的0.1M硼酸缓冲液(pH8.8),0.02ML-苯丙氨酸1mL,混匀后立即用分光光度计测OD290初始值,38℃水浴30min后测定终止值。
重复三次。
14、过氧化物酶活性(POD)测定
样品提取与PPO同,测定参照蒋跃明[152]的方法(1997)。
反应体系:
2.9mL磷酸缓冲液,1mL愈创木酚和2mL酶液,以煮过失活的酶液为对照,加入酶液后,立即于37℃水浴中保温10min,取出试管向其中1ml2%的H2O2,于470nm波长下比色,30秒读一次,记录5min内得值。
重复三次。
酶比活力(0.01ΔA/gFW•min)=
ΔA
0.01w×t×D
15、多酚类物质
1)酒石酸铁溶液的配制:
取0.1gFeSO4.7H2O,含有4个结晶水的酒石酸钾钠0.5g,加蒸馏水溶解定容到100ml。
2)酶液提取:
取20g果肉,冰浴研磨,假如PH7.8磷酸缓冲液定容至100ml,沸水浴加热10min,过滤,冷却至室温,滤液为供试液。
3)比色测定:
5ml供试液,加5ml磷酸缓冲液,加5ml酒石酸铁溶液,充分摇匀后立即测定OD540nm,空白:
蒸馏水5ml
多酚%(以茶多酚计)=
A×7.826×V1×100
1000×V2×m
式中:
V1---------供试液总量
V2---------供试液吸取量
m-----------样品质量
16、总酚含量的测定
(1)药品:
75%甲醇:
375ml甲醇+125
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