微生物学综合实验报告格式217.docx
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微生物学综合实验报告格式217
综合实验报告书
(2011~2012学年)
实验题目碱性蛋白酶高产菌株的筛选
学院名称生物与食品工程学院
专业(班级)生物工程09-1班
姓名
(学号)李静20096091
起讫日期2012.02.13-2012.02.18
指导教师李军红
2012年2月19日
摘要:
实验采用土壤为样品,对样品进行分离,纯化,培养,筛选出了产酶能力较高的菌株,复筛确定产酶能力相对较高的菌株。
通过相对酶活力的测定,确定反应最佳温度,最佳pH,菌株在最适条件下的产酶能力。
关键词:
蛋白酶;菌株;筛选;酶活力
Abstract:
Experimentusingsoilasasample,thesampleswereseparated,cultured,purified,screenedbytheenzymeproductioncapacityhigherstrains,rescreeningdetermineenzymeproductioncapacityisrelativelyhigherstrains.Basedonrelativeenzymeactivitydetermination,determinetheoptimaltemperature,reaction,optimalpHstrainsundertheoptimalconditionofenzymeproductioncan.
Keywords:
Protease;Strains;Screening;Enzymeactivity
前言:
蛋白酶是在一定的pH和温度条件下,通过内切和外切作用使蛋白质水解为小肽和氨基酸的生物酶。
它在洗涤剂、制革脱毛、生丝脱胶、有机合成、酒类澄清、明胶及蛋白胨生产、肉质嫩化、医药等方面广为应用。
碱性蛋白酶在pH为碱性的范围内水解蛋白质肽键的酶,最早发现于猪胰脏中。
碱性蛋白酶广泛应用于洗涤剂工业中,尤其是洗衣粉中,目前洗涤剂中加入的碱性蛋白酶在50℃以上具有良好的洗涤效果,需要将水加热,这样对于能源缺乏的国家和地区来说是一种能源负担。
在日本、欧洲与美国,低温蛋白酶已被广泛用于洗涤用品的生产,国内也开始加强低温蛋白酶的研究,并朝应用方向发展。
近年来,科学工作者在蛋白酶方面进行了不懈的探讨,但是目前存在的蛋白酶种类仍过于单一,已开发出的蛋白酶制剂尚不能满足国产饲用蛋白酶的需要,主要是由于菌种酶活力低,生产成本高。
因此,应当加快产蛋白酶产生菌的研究,继续筛选高产蛋白酶的优良菌株,扩大产蛋白酶菌种的来源,开发出常温或低温下就有较高酶活力的蛋白酶是当务之急。
本实验主要进行了土壤中蛋白酶高产菌株的筛选、形态、产酶条件及酶学性质的研究。
1.材料和方法
1.1材料
1.1.1土样
肥沃花坛土、草坪土各一份
1.1.2培养基
平板培养基(%):
酵母粉1.5,蛋白胨0.5,氯化钠0.5,琼脂1.6,pH9。
分离培养基(%):
酵母膏1.5,脱脂奶粉0.5,琼脂1.6,pH9。
发酵培养基(%):
酵母膏1.5,葡萄糖1.0,蛋白胨0.5,pH9。
酶活力测定培养基(%):
脱脂奶粉2.0,琼脂1.6,pH9。
1.1.3仪器
ZHWY-2102C振荡摇床;SHH.W21.600;三用电热恒温水箱;TGL-16台式离心机。
1.2实验方法
1.2.1土样采集
选取采集地点地表植被根系周围的土壤,先除去地表浮土及植被根系,然后挖取深约5cm的土壤样品,装入灭菌牛皮纸袋中,4℃冰箱中保存。
1.2.2样品处理
将土样混合均匀,4℃冰箱保存。
1.2.3菌株分离(平板分离法)
土样稀释:
2份土样分别取10g分别装入90ml无菌生理盐水的三角烧瓶中(最终称取土样一10.054g,土样二10.081g),100r/min旋转摇床培养20min,取出按常规稀释法稀释土样。
保留10-3,10-4,10-5的土壤稀释液待用。
涂布与培养:
取10-1,10-2,10-3稀释液分别涂布于平板培养基上,每个浓度涂布3个培养皿。
37℃恒温箱倒置培养24h。
观察与保存:
培养24h后,挑选菌落形态、颜色不一致的菌落保存待用。
(因为土壤酸碱度为6.0,所以取两种土样分别富集培养,然后在稀释、涂布培养。
)
1.2.4筛选
采用平板划线法将保存的单菌落划线于分离培养基上。
37℃恒温培养箱中培养24h。
通过观察水解圈的大小初步判断菌株产酶能力的高低,挑选产生透明水解圈大的单菌落接2环于装有5ml液体发酵培养基的无菌试管中,30℃条件下旋转摇床培养24h。
发酵液经5000r/min离心6min钟后,用5mm方形滤纸片粘上清夜贴于酪蛋白平板上,于30℃条件下保温24h。
然后用直尺测出菌落与透明水解圈直径,根据平板上水解圈直径和菌落直径的比值(R/r),选出比值较大的菌株。
1.2.5复筛
将初筛得到的3种菌株(R1,R2,R3)分别接于pH9的发酵培养基中,30℃摇床培养24h。
取发酵液离心后即得粗酶液,用移液枪取200uml粗酶液点于酪蛋白平板上。
为做透明圈大小的对比,以此筛选出产酶活力较高菌株,3种粗酶液点于同一个培养皿上,共点3个平皿,37℃保温24h。
1.2.6酶活力测定
菌株R1经斜面活化后接种于发酵培养基中,30℃条件下摇瓶发酵48h,取其发酵液5000r/min离心10min,用pH7.2磷酸缓冲液稀释100倍,冰箱保存待用。
用酪蛋白为作用底物,在一定的pH和温度下用等量的酶液经一定时间反应,并用三氯醋酸终止反应,使未反应的酪蛋白沉淀。
然后过滤,取滤液,用分光光度计测量波长为280nm吸光度。
为消除酶制剂本身发色基团对测定结果的影响,以失活酶为空白。
根据吸光度求算出释放出的酪氨酸的量。
不同温度下酶活力的测定:
用7支试管分别取10ml的稀释酶液,2ml2%的酪蛋白分别在10℃、20℃、30℃、40℃、50℃、60℃、70℃的恒温水箱中反应10min后用TCA中止反应使未反应的酪蛋白沉淀、过滤,取上清液测量光密度。
计算酶活力。
不同pH条件下酶活力的测定:
用7支试管分别取10ml的稀释酶液,2ml2%的酪蛋白在pH分别为5、6、7、8、9、10、11、12的条件下30℃恒温水浴箱中反应10min后用TCA中止反应使未反应的酪蛋白沉淀、过滤,取上清液测量波长280nm处的光密度。
计算酶活力。
酶活力的精确测定:
R1菌种接两环于pH为9的发酵培养基中,摇床培养48h,取发酵液离心得粗酶液,取1ml酶液,用pH9.0磷酸缓冲液稀释100倍并调pH到9。
取10ml稀释酶液,加2ml2.0%酪蛋白溶液,30℃水浴恒温反应20min,然后用2ml0.04M的TCA中止反应,使未反应的酪蛋白沉淀。
去沉淀,得到的上清液再稀释10倍,在分光光度计上测量波长280nm处的吸光度。
酶活力定义:
在30℃pH为9的条件下,每分钟水解酪蛋白产生1μg酪氨酸的酶量为一个活力单位,用U表示。
(最终因为时间关系复筛和酶活力测定的程序没有及时完成。
)
2.结果与分析
2.1实验结果图示
1)分离培养
2)初筛(平板划线法)
3)离心
4)酪蛋白培养
2.2实验各步结果记录
2月14日两种土样分别富集培养以及分离培养
2月15日选取聚集的菌落形态比较明显的菌株进行接种,共接种12个平板,每个平板上三个接种点,进行培养。
分别接种浓度10-2自土土样2三个、浓度10-3自土土样2三个、浓度10-2自土土样1两个、浓度10-3自土土样1两个、浓度10-3富土土样2两个。
2月16日,选取出现透明圈比较好的培养皿。
所选培养皿接种点出现的菌株直径与透明圈直径之比为:
10-3自土土样1(2:
3、1:
2、1:
2)(1:
4、1:
2、1:
3);10-2自土土样1(1:
2、1:
2、1:
2);10-2自土土样2(2:
3、1:
3、1:
2),选取三个平板再分别挑取产生透明水解圈大的单菌落接2环于装有5ml液体发酵培养基的无菌锥形瓶中,30℃条件下旋转摇床培养24h,每个平板的菌样按照顺序编号1、2、3号。
三个平板分别依次为1#、2#、3#平板。
2月17日,分别取1#、2#、3#菌样的1号锥形瓶,各取6ml,分别取两份到离心管中离心,再取上清液。
2月18日,观察平板的透明圈,1#(1:
2、1:
2)、2#(1:
3、1:
2)、3#(2:
3、1:
3)
3.结论与讨论
根据透明圈的大小测定碱性菌株产蛋白酶的酶活力。
菌圈和透明圈之比越大产酶效果越好。
系列1:
菌株分离后的透明圈比值
系列2:
筛选后的透明圈比值
结论:
透明圈可以表示酶活力,但不能精确表示酶活力的多少,也不能说明产酶的最佳条件。
心得体会:
这次实验验证了土壤中碱性蛋白菌株产蛋白酶的能力。
通过对整个实验的把握、计划以及实验步骤的实施,可以看出,在实验当中我们还是缺少对整体实验的细致计划和了解,缺少对时间的合理安排。
对实验出现的可能结果缺少提前的预测和分析,导致当出现结果差异的时候不知道如何在进行接下来的实验,缺少对问题的深入分析和理解。
每天的准备工作应该细致到位,正因为缺少对整体实验的把握,所以才在最后一天因为试剂没有准备完全所以导致不能精确的测量酶活力,同样也是因为对时间的安排有误,所以最终也没有时间进行不同条件下酶活力的测定。
本次实验也暴露出很多我们在平时操作上的不规范,导致实验误差大,菌种培养率低,污染严重。
最终经过查询资料得知透明圈的大小不能完全代表酶活力的强弱,其原因可能是:
在倒蛋白平板的过程中,平板的厚度不均一,单位面积所含的蛋白平板也不尽相同,另外平板培养和液体发酵的条件不同,得到的酶活力大小也不会完全一致。
致谢:
实验过程中离不开李军红老师方法原理的指导,方老师仪器设备的支持,杨老师的热心帮助,以及本组同学的团结合作,在此一并表示衷心的感谢。
参考文献:
[1]周兰姜,碱性蛋白酶高产菌株的筛选,【宜春学院学报】(33期)2011.8
[2]党建章,用平板透明圈法测定延胡索酸酶活力,【生物技术】(5)38-39,1995
[3]徐建国、田呈瑞、胡青平、罗季阳,高产蛋白酶菌株的筛选及产酶条件优化,【中国粮油学报】10.2010
[4]丁鲁华、孙淑琴,蛋白酶活性的快速准确测定方法,【食品与发酵工业】04,1984
[5]李艳丽、许少春、许尧兴,中性蛋白酶高产菌株的筛选及产酶酶系分析,【生物技术】01.2007
合肥工业大学综合实验报告
综合实验审阅
成绩评定书
学生姓名
李静
专业(班级)
生物工程09-1班
学号
20096091
实验名称:
碱性蛋白酶高产菌株的筛选
个人小结:
通过本次实验,了解了土壤中碱性蛋白菌株产蛋白的筛选方法以及酶活力的测定方法,和不同条件对酶活力的影响。
同时也暴露出我们在实验过程中严谨性不够,对时间和条件的控制也不够,实验当中对可能产生的不同结果的分析不到位,对实验的进度有很大的影响。
在实验当中,由于灭菌条件和时间的控制不好,所以在分离的菌株中,菌株的生长率和产酶率都很低。
实验的准备不够所以在最后酶活力没有进行测定。
但总体来说,本次实验还是比较成功的,从出现的菌株和透明圈来看,此次实验中蛋白酶产酶的能力还是比较高的。
个人签名:
李静
2012年2月19日
成绩:
指导教师签字:
年月日
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