乙肝表面抗原的ELISA法定量分析方法学验证_精品文档.doc
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学号:
毕业论文
GRADUATETHESIS
论文题目:
乙肝表面抗原的ELISA法定量分析方法学验证
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班级:
姓名:
指导教师:
2016年10月31日
目录
毕业论文
学号:
1
乙肝表面抗原的ELISA法定量分析方法学验证 3
中文摘要 3
前言 5
1.材料与方法 5
1.1试剂盒 5
1.2仪器 5
1.3方法 5
2.结果 7
2.1标准曲线与线性范围 7
2.2准确度(回收率)的验证 8
2.3精密度的验证 9
2.4检测限(LOD)计算 12
3.讨论 13
3.1乙肝表面抗原定量分析的意义 13
3.2常用定量分析方法 13
3.3方法概述 14
3.4方法学验证内容 14
4.结果分析及应用评价 15
参考文献 16
综述 17
致谢 18
18
摘要
乙肝表面抗原的ELISA法定量分析方法学验证
摘要
目的:
随着免疫学技术的不断发展,抗原抗体检测灵敏度不断提高,使得乙肝病毒低水平的检测成为了可能,本实验就是对上海酶联生物有限公司生产的乙肝表面抗原的ELISA法定量分析试剂盒进行方法学验证,以判断该试剂盒是否能用于临床低浓度样本的定量分析。
方法:
HBsAg的ELISA法定量分析,用浓度为8ng/ml标准品溶液做2倍稀释的6个浓度梯度做标准曲线,以6,3,1.5ng/ml3个浓度梯度5复孔做准确度,精密度和检测限等方法学验证。
结果:
标准曲线R2=0.9979,显示具有良好的相关性;检测限为LOD为0.167ng/ml;准确度99.03%,准确度好;板内精密度和板见精密度方面都表现在低浓度样品(<1.5ng/ml)的检测低于高浓度样品,重复性差。
故不适合低浓度样品的检测。
结论:
由于该试剂盒在低浓度样本测量上的精密度差,故该公司生产的HBsAg的ELISA法定量分析试剂盒不可以用于临床生物低浓度样品的分析。
关键词HBsAgELISA定量分析方法学验证
Abstract
ThereificationoftheHBsAgELISAquantitativemethodology
Abstract
Object:
Withthecontinuousdevelopmentofimmunologyandtechnology,increasingantigenantibodydetectionsensitivity,makesthedetectionoflowhepatitisbvirus,toverifythequantitativemethodologyofShanghaienzymelinkedBiologicalTechnologytomakesurewhetheritcabeusedtotheanalysisofClinicalSample.Methods:
ELISAquantitativemethodology,makeanApplicationofthestandardHBsAgkitfromtheconcentrationof8ng/mldo2timesdilutedsixconcentrationgradienttoconstituteastandardcurve,testingWith6,3,1.5ng/ml3aconcentrationgradient5accuratelypreciseanddetection.Results:
R2=0.9979,standardcurveshowedgoodcorrelation;DetectionlimitforLODis0.167ng/ml;99.03%accuracy,goodaccuracy;Precisionandprecisionoftheplateintheplatehasperformanceinlowconcentrationsample(<1.5ng/ml)detectionislowerthanthehighconcentrationsamples,poorrepeatability.Soisnotsuitablefordetectionoflowconcentrationsamples.Conclusion:
Becausethekitonthelowconcentrationsamplemeasurementprecisionispoor,sotheELISAquantitativeanalysiskitofHBsAgcannotbeusedfortheanalysisofClinicalSample.
Keywords:
HBsAg;Quantitativeanalysis;Verification;Methodology.
研究论文
乙肝表面抗原的ELISA法定量分析方法学验证
前言
根据流行病学调查,我国人群乙型肝炎病毒感染率为10%左右,乙型肝炎病毒(HBV)感染是最常见的传染病之一。
实验室诊断乙型肝炎对其治疗和预防有重要的参考意义而HBsAg是乙肝病毒感染最早的血清标志物,因此乙肝表面抗原检测是一个重要的乙型肝炎病毒感染的诊断的依据。
随着免疫学技术的不断发展,抗原抗体检测灵敏度不断提高,使得乙肝病毒低水平的检测成为了可能,对于临床诊断和流行病学具有重要意义[1]。
ELISA方法具有灵敏度高、特异性强、重复性好和定性测定的优点,可以在酶免疫分析仪进行批量检测。
目前临床上多倾向于做定量分析,若想得到准确的检验结果,必须要经过实验室的验证,本实验对上海酶联生物生产的HBsAg的ELISA法定量分析试剂盒进行准确度,精密度和检测限等方法学验证,现将实验结果报告如下:
1.材料与方法
1.1试剂盒
乙肝表面抗原ELISA法定量分析试剂盒,上海酶联生物出品。
1.2仪器
酶标仪:
ELx800光吸收酶标仪;洗板机:
DNX-9620A电脑洗板机;超纯水系统:
MilliporeElix;电热恒温培养箱(DNP-9052)上海精宏实验设备有限公司;振荡器(苏州管械,KJ-201A);移液器;Tip头;EP管。
1.3方法
1.3.1.溶液配置
磷酸缓冲液的配备:
称取8gNaCl、0.2gKCl、1.44gNa2HPO4和0.24gKH2PO4,溶于800ml蒸馏水中,用HCl调节溶液的pH值至7.4,最后加蒸馏水定容至1L即可。
在15lbf/in2(1034×105Pa)
标准品的配备:
原始标准品浓度为8ng/ml。
取6支2mlEP管,分别标记为A1-A6。
50ul/well,共1孔需50ul,每孔配置60ul留作备用,稀释方案详见表一。
编号
终浓度
(ng/ml)
预加磷酸缓冲液
标记
取(ul)
剩余(ul)
A1
8
0
标准品
120
60
A2
4
60
A1
60
60
A3
2
60
A2
60
60
A4
1
60
A3
60
60
A5
0.5
60
A4
60
60
A6
0.25
60
A5
60
60
表一标准品的稀释方案
质控品的配置:
50ul/well,共5复孔需250ul,配置300ul留作备用,取3支2mlEP管,分别标记为C1,C2,C3,质控品稀释方案见表二。
编号
终浓度
(ng/ml)
预加磷酸缓冲液
标记
取(ul)
剩余(ul)
C1
6
150
标准品
450
300
C2
3
300
C1
300
300
C3
1.5
300
C2
300
300
表二质控品的稀释方案
1.3.2.铺板方案
取出试剂盒中已包被酶标板,取出板条,在相应孔中依次加入系列标准品、质控品及空白对照,每孔50ul。
空白对照加入磷酸缓冲液缓冲液。
铺板方案见表三。
序号
标准品
质控1
质控2
质控3
空白组
1
A1
C1
C2
C3
磷酸缓冲液
2
A2
C1
C2
C3
磷酸缓冲液
3
A3
C1
C2
C3
磷酸缓冲液
4
A4
C1
C2
C3
磷酸缓冲液
5
A5
C1
C2
C3
磷酸缓冲液
6
A6
表三铺板方案
1.3.3.加样步骤
加入酶标抗体,50ul/well,震荡。
37℃电热恒温培养箱温育60min,取出后洗板4次,加入A、B液,50ul/well,37℃电热恒温培养箱温育15min。
加入终止液,50ul/well。
酶标板放入酶标仪,盖上盖子,在电脑上打开MicroplateManager5.2软件,选择450nm波长(参照波长630nm),设置layout和报告模式,测定各孔吸收值。
2.结果
2.1标准曲线与线性范围
序号
1
2
3
4
5
6
HBsAg(ng/ml)
8
4
2
1
0.5
0.25
吸光度值
1.67
0.99
0.63
0.40
0.31
0.26
表四标准品理论浓度对应的实测OD值
以标准品实际浓度为横坐标,所测吸光度值值为纵坐标作图,绘制标准曲线观察线性关系,结果显示R2=0.998,显示具有良好的相关性。
表五标准曲线
2.2准确度(回收率)的验证
质控品理论稀释浓度对应实测浓度值见表六。
HBsAg(ng/ml)
1
2
3
4
5
6
6.51
4.94
5.67
6.08
6.12
3
3.57
3.07
3.29
3.08
2.95
1.5
1.27
1.36
1.54
1.21
1.59
表六实测浓度值
质控品做了3个浓度梯度,每个浓度做了5个复孔,见表七。
HBsAg
(ng/ml)
测定值(ng/ml)
回收率(%)
平均回收率
RR(%)
3个浓度的平均回收率
6
6.51
108.5
97.72
99.03%
4.94
82.3
5.67
94.5
6.08
101.3
6.12
102.0
3
3.57
119.0
106.40
3.07
102.3
3.29
109.7
3.08
102.7
2.95
98.3
1.5
1.27
84.7
92.96
1.36
90.7
1.54
102.7
1.21
80.7
1.59
106.0
表七回收率
结果显示HBsAg6ng/m的平均回收率为97.72%,3ng/ml的平均回收率为106.40%和1.5ng/ml的平均回收
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