CTAB法提取DNA原理及步骤制胶电泳_精品文档.doc
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CTAB法提取DNA的原理及步骤:
冷冻的植物组织,在低温干燥状态下机械磨碎。
通常精提DNA,都要加液氮使材料变脆,易于研磨。
低温降低了DNase的活性,利用CTAB(十六烷基三甲基溴化铵)去污剂溶解细胞膜,使核蛋白等解聚,使DNA游离出来。
CTAB作为一种阳离子去污剂,可溶解细胞膜,与核酸形成复合物,可使核酸沉淀出来。
通过离心将CTAB-核酸复合物语糖类、蛋白质等分离开来。
随后将复合物溶于高盐溶液中,再加乙醇使核酸沉淀,而CTAB溶于乙醇,从而去除CTAB。
1.研磨
2.加1000ul预处理液,10-15min,4000r,10min,弃上清(重复)
预处理液:
Tris-hcl(PH8.0)提供缓冲环境,防止核酸被破坏。
EDTA(螯合二价阳离子)0.5M抑制DNase活性。
Nacl5M提供高盐环境,使DNA充分溶解。
β-巯基乙醇 抗氧化剂,去除酚,糖,能与酚形成络合物,也可与糖结合。
3.加800ul2×CTBA(预热),10ulβ-巯基乙醇,65℃水浴1-2h。
15min震荡
4.冷至室温,离心1000r,10min,取上清750ul,加800ul氯仿-异戊醇(24:
1),抽提10min,1000r,15min,重复3次。
氯仿:
加速有机相与水相分层,去除核酸溶液中残余酚,抽提蛋白质等杂质。
5.取上清,加2倍体积的无水乙醇,-20℃,1h,沉淀DNA.
无水乙醇:
DNA不溶于酒精,CTAB和一些蛋白质可以,低温乙醇可抑制DNase活性,降低分子运动,易于DNA沉淀。
6.4℃,1000r,10min,倒乙醇,收集DNA.
7.70%乙醇洗涤2遍,风干(不可太干),溶于40-60uldd水。
DNA在凝胶中涌动时有电荷效应和分子筛效应,DNA分子在高于等电点的PH溶液中带负电荷,在电场中向正极移动。
由于相同数量的双链DNA几乎具有等量的静电荷,因此能以同样的速率向正极移动。
在一定电场强度下,DNA分子的歉意速率取决于分子筛效应,即DNA本身的大小。
制胶步骤:
1.5%琼脂糖
1.配胶:
0.6g琼脂糖a
40ml1×TBEb
4ulEB剧毒
a、b混合在微波炉中加热,熔化,冷却至60℃以下,后加EB(慢)
加热沸出气泡,将其剥离,加EB(剧毒,小心使用,致癌)后慢摇匀。
2.倒在制胶槽中,插上梳子,待胶凝固后,拔下梳子。
3.将1×TBE(按配方配得5×TBE,再加蒸馏水稀释至1×TBE,即取一份5×TBE,加4份水)倒入电泳槽中,没过凝胶。
4.将制好的胶放入电泳槽中,点样(2ul溴酚蓝+10ulDNA),可以点在封口膜上,混匀,上样。
5.插电极,红黑线自搭。
开电源(100v,80mA),溴酚蓝跑到整胶的三分之二时,关闭电泳仪电源,紫外灯下观察。
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