高效液相色谱分析.ppt
- 文档编号:948472
- 上传时间:2022-10-14
- 格式:PPT
- 页数:110
- 大小:7.15MB
高效液相色谱分析.ppt
《高效液相色谱分析.ppt》由会员分享,可在线阅读,更多相关《高效液相色谱分析.ppt(110页珍藏版)》请在冰豆网上搜索。
2022/10/14,第三章高效液相色谱分析,highperformanceliquidchromatograph,2022/10/14,教学目标及要求:
1.掌握液相色谱的特点;2.掌握液相色谱法的分类;3.了解影响液相色谱峰扩展及色谱分离的因素;4.理解液相色谱分离的原理;5.了解液相色谱的固定相和流动相;6.了解液相色谱仪的组成和结构原理及主要部件;7.了解液相色谱分离类型的选择;8.了解液相色谱的应用。
教学重点、教学难点:
1.高效液相色谱与气相色谱的异同点2.高效液相色谱速率理论方程式在实验条件优化中的应用3.分离柱和流动相的选择和匹配4.不同种类液相色谱分离的原理上的差异,2022/10/14,第一节高效液相色谱法概述Generalizationofhighperformanceliquidchromatograph,一、概述Generalization二、高效液相色谱仪HPLC三、高效液相色谱法的特点featureofHPLC四、流程及主要部件generalprocessandmainassemblyofHPLC,2022/10/14,高效液相色谱法:
以液体作为流动相的色谱法。
它是在经典液相色谱实验基础上,引入气相色谱的理论,在技术上采用高压输液泵,高效固定相和高灵敏的检测器,而发展起来的快速分离分析技术。
具有分离效能高,检出限低,操作自动化和应用范围广的特点。
一、概述Generalization,2022/10/14,
(一)、HPLC与经典LC区别,2022/10/14,
(二)、HPLC与GC异同点,近来出现的蒸发激光光散射检测器(ELSD)是灵敏度较高的通用检测器,2022/10/14,流动相差别GC:
流动相为惰性气体组分与流动相无亲合作用力,只与固定相作用。
HPLC:
流动相为液体组分与流动相和固定间有亲合作用力,为提高柱的选择性、改善分离度增加了因素,对分离起很大作用。
流动相种类较多,选择余地广流动相极性和pH值的选择也对分离起到重要作用选用不同比例的两种或两种以上液体作为流动相可以增大分离选择性,操作条件差别GC:
加温操作HPLC:
室温;高压(液体粘度大,峰展宽小),2022/10/14,二、液相色谱仪器highperformanceliquidchromatograph,2003年全球液相色谱市场的总销售额为25.16亿美金,2010年预计将达到33.83亿美金。
国内对液相色谱仪的需求量越来越大:
2000年版中国药典规定用液相色谱仪对药物的最终质量控制和检验,较之95版药典有了大幅度的增加;我国的医药生产、新药开发以及中草药的研究都大大增加了对液相色谱的需求;色谱分析已被列为全国化学及相关专业大学生的必修课,全国近1000所大学学生实验用液相色谱仪的需求量将相当可观;随着国家对环境保护和生态平衡的更加重视,“十五”期间全国各地的环境监测站也已逐步配备液相色谱仪及其他分析仪器,对水质、大气和土壤进行监控;我国进出口国际贸易近年来快速增长,并还将持续大幅度增长,而色谱分析方法及其色谱质谱联用技术是世界公认的商品检验手段之一,只有高质量的色谱仪、色质联用仪和高水平的检验结果才可能被世界各国认可,没有足够数量的高质量色谱仪器和色质联用仪就难以“与世界接轨”。
我国液相色谱仪的发展远远落后于气相色谱仪的发展,目前国内使用的液相色谱仪90%以上均是进口产品。
2004年市场调查报告,2022/10/14,三、高效液相色谱法的特点和应用,特点:
“三高”“一快”“一广”高柱效n=104片/米,柱效高(远高于一般LC)高灵敏度(紫外:
10-9g;荧光:
10-11g)高选择性分析速度快(1h)应用范围广泛(可分析80%有机化合物)(是高沸点、热不稳定有机及生化试样的高效分离分析方法。
),2022/10/14,四、流程及主要部件processandmainassemblyofHPLC,1.流程,2022/10/14,2.主要部件P83,
(1)高压输液泵主要部件之一,压力:
150350105Pa。
为了获得高柱效而使用粒度很小的固定相(10m),液体的流动相高速通过时,将产生很高的压力,因此高压、高速是高效液相色谱的特点之一。
应具有压力平稳、脉冲小、流量稳定可调、耐腐蚀,往复式柱塞泵,死体积小,很适用于梯度洗提等特性。
2022/10/14,
(2)梯度淋洗装置,外梯度:
(低压梯度)将两种不同极性的溶剂按一定的比例送入梯度混合室,混合后进入色谱柱。
内梯度:
(高压梯度)一台高压泵,通过比例调节阀,将两种或多种不同极性的溶剂按一定的比例抽入高压泵中混合。
2022/10/14,2022/10/14,(3)进样装置,流路中为高压力工作状态,通常使用耐高压的六通阀进样装置,其结构如图所示:
2022/10/14,(4)高效分离柱,柱体为直型不锈钢管,内径16mm,柱长540cm。
发展趋势是减小填料粒度和柱径以提高柱效。
2022/10/14,理想的HPLC检测器应具有如下特性:
第一,具有高灵敏度和可预测的响应;第二,对样品所有组分都有响应,或具有可预测的特异性,适用范围广;第三,温度和洗脱液流速的变化对响应没有影响;第四,响应与洗脱液组成无关,因此可作梯度洗脱;第五,死体积小,不造成柱外谱带扩展;第六,使用方便、可靠、耐用,易清洗和检修;第七,响应值随样品组分量的增加而线性增加,线性范围宽;第八,不破坏样品组分;第九,能对被检测的峰提供定性和定量信息;第十,响应时间快。
(5)液相色谱检测器,2022/10/14,检测器的分类:
2022/10/14,2022/10/14,a.紫外检测器应用最广,对大部分有机化合物有响应。
特点:
灵敏度高;线形范围高;流通池可做的很小(1mm10mm,容积8L);对流动相的流速和温度变化不敏感;波长可选,易于操作;可用于梯度洗脱。
2022/10/14,b.光电二极管阵列检测器,紫外检测器的重要进展;光电二极管阵列检测器:
1024个二极管阵列,各检测特定波长,计算机快速处理,三维立体谱图,如图所示。
2022/10/14,2022/10/14,光电二极管阵列检测器,2022/10/14,c.示差折光检测器(differentialrefractiveindexdetector),除紫外检测器之外应用最多的检测器;可连续检测参比池和样品池中流动相之间的折光指数差值。
差值与浓度呈正比;,通用型检测器(每种物质具有不同的折光指数);灵敏度低、对温度敏感、不能用于梯度洗脱;偏转式、反射式和干涉型三种;,2022/10/14,示差折光检测器,2022/10/14,d.荧光检测器(fluorescencedetector),高灵敏度、高选择性的检测器。
对多环芳烃,维生素B、黄曲霉素、卟啉类化合物、农药、药物、氨基酸、甾类化合物等有响应;e.其它检测器:
电化学检测器(电导检测器、伏安检测器等),电导检测器直接测定柱后洗脱液的电导变化。
将被测洗脱液置于施加电场的两个电极间,电导值1R(R为两电极间电阻值)与电极截面积A,两电极间距离L和各离子的电导总和C之间有如下关系:
式中C为i离子的摩尔浓度,为i离子的摩尔电导。
2022/10/14,一、液-固吸附色谱liquid-solidadsorptionchromatograph二、液-液分配色谱liquid-liquidpartitionchromatograph三、离子交换色谱ion-exchangechromatograph四、离子色谱ionchromatograph五、离子对色谱ion-pairchromatograph六、排阻色谱size-exclusionchromatograph七、亲和色谱(AC)Affinitychromatograph,第二节主要分离类型与原理P70,basicprincipleandmainseparatingtypes,2022/10/14,一、液-固吸附色谱liquid-solidadsorptionchromatography,固定相:
固体吸附剂:
如硅胶、氧化铝等,较常使用的是510m的硅胶吸附剂;流动相:
各种不同极性的一元或多元溶剂,“相似相溶”原理基本原理:
组分在固定相吸附剂上的吸附与解吸;适用于分离相对分子质量中等的油溶性试样,对具有不同官能团的化合物和异构体有较高选择性;缺点:
非线形等温吸附常引起峰的拖尾;,2022/10/14,二、液-液分配色谱liquid-liquidpartitionchromatography,固定相与流动相均为液体(互不相溶);基本原理:
组分在固定相和流动相上的分配;流动相:
对于亲水性固定液,采用疏水性流动相,即流动相的极性小于固定液的极性(正相normalphase),分离极性化合物,极性小的先出峰。
反之,流动相的极性大于固定液的极性(反相reversephase)。
正相与反相的出峰顺序相反。
2022/10/14,固定相有机基团主要有三类:
1.疏水基团:
如不同链长的烷烃(C8,C18,C6等)。
2.极性基团:
如丙胺基,氰乙基,醚和醇等。
3.离子交换基团:
如作为阴离子交换基团的胺基,季铵盐。
作为阳离子交换基团的磺酸基等。
固定相:
早期涂渍固定液,固定液流失,较少采用;化学键合固定相:
(将各种不同基团通过化学反应键合到硅胶(担体)表面的游离羟基上)。
2022/10/14,三、离子交换色谱ion-exchangechromatography,键合相离子交换剂是以硅胶为基质,在它上面覆盖一层如图所示的离子交换树脂涂层,或者在硅胶上直接键合离子交换基团。
固定相:
阴离子离子交换树脂或阳离子离子交换树脂;,2022/10/14,流动相:
阴离子离子交换树脂作固定相,采用酸性水溶液;阳离子离子交换树脂作固定相,采用碱性水溶液;基本原理:
组分在固定相上发生的反复离子交换反应;组分与离子交换剂之间亲和力的大小与离子半径、电荷、存在形式等有关。
亲和力大,保留时间长。
阳离子交换:
阴离子交换:
离子交换反应达到平衡时,保留值决定于平衡常数。
容量因子k与平衡常数K成正比,且与流动相中的反离子浓度(M+、X-)成反比。
应用:
离子及可离解的化合物,氨基酸、核酸、蛋白质等。
2022/10/14,四、离子色谱ionchromatography,离子交换色谱法由于没有与之相匹配的检测器,难以发挥更大的作用。
无机离子与大多数有机离子不同,只有在远紫外区才有吸收,光度检测器不适于检测无机离子,而电导检测器却是可检测电解质溶液的通用型检测器,这种检测器简单易于操作,但是长时间以来没有一种可以和电导检测器相适应的分离模式。
直到1975年Small才提出把电导检测器用于离子交换色谱,他为了克服洗脱液中的离子对电导检测器的干扰。
在分析柱和检测器之间增加一个“抑制柱”,消除洗脱液中离子本身带来的本底电导,他把这一方法叫做“离子色谱”(IonChromtatography)。
这一方法提出之后受到普遍的重视,20多年来得到了长足的发展,成为分析无机和有机离子十分重要的方法,在各领域中得到广泛的应用。
2022/10/14,离子色谱仪,2022/10/14,离子色谱法原理principleofIC,(IonChromatography,简称IC)以无机、特别是无机阴离子混合物为主要分析对象,在七十年代出现、八十年代迅速发展。
传统离子交换色谱存在着两个难于解决的问题:
(1)需要高浓度淋洗液洗脱且洗脱时间很长;
(2)洗脱后的组分缺乏灵敏、快速的在线检测方法。
2022/10/14,离子交换原理,与传统离子交换的不同点:
采用交换容量非常低的特制离子交换树脂为固定相;细颗粒柱填料,高柱效;采用高压输液泵;,低浓度淋洗液或本底电导抑制(在分离柱后,采用抑制柱来消除淋洗液的高本底电导);可采用电导检测器,快速分离分析微量无机离子混合物;各种抑制装置及无抑制方法的出现,发展迅速。
2
- 配套讲稿:
如PPT文件的首页显示word图标,表示该PPT已包含配套word讲稿。双击word图标可打开word文档。
- 特殊限制:
部分文档作品中含有的国旗、国徽等图片,仅作为作品整体效果示例展示,禁止商用。设计者仅对作品中独创性部分享有著作权。
- 关 键 词:
- 高效 色谱 分析