CTGF反义寡核苷酸对AngⅡ诱导的人近曲肾小管上皮细胞转分化的阻碍.docx
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CTGF反义寡核苷酸对AngⅡ诱导的人近曲肾小管上皮细胞转分化的阻碍
CTGF反义寡核苷酸对AngⅡ诱导的人近曲肾小管上皮细胞转分化的阻碍
陈珑,刘必成,马坤岭,刘宏,罗冬冬
目的:
探讨结缔组织生长因子(CTGF)反义寡核苷酸对血管紧张素Ⅱ(AngⅡ)诱导的肾小管细胞转分化的可能阻碍。
方式:
采纳体外培育的人近曲肾小管上皮细胞株(HK2),别离观看CTGF反义寡核苷酸和AngⅡ干与细胞对细胞CTGFmRNA和蛋白质的表达、细胞内超微结构及细胞α滑腻肌肌动蛋白(αSMA)表达的阻碍。
结果:
AngⅡ干与HK2细胞48h后,细胞CTGFmRNA和蛋白的表达显著增高(P<);AngⅡ干与96h后,细胞超微结构显示出间质细胞样结构;这些作用都可被CTGF反义寡核苷酸显著抑制。
AngⅡ能够呈时刻依托性地刺激HK2细胞表达αSMA,这些作用能够被CTGF反义寡核苷酸显著抑制(P<)。
对照组错义寡核苷酸无上述作用。
结论:
CTGF反义寡核苷酸对AngⅡ诱导HK2细胞转分化具有显著的抑制作用,提示CTGF可能介导了AngⅡ诱导的肾小管上皮细胞转分化。
[关键词]人近曲肾小管上皮细胞;血管紧张素Ⅱ;结缔组织生长因子;细胞转分化
Abstract:
ObjectiveToinvestigatetheeffectofconnectivetissuegrowthfactorantisenseoligonucleotide(CTGFAS)onAngⅡinducedtubularcelltransdifferentiation.MethodsTheinfluenceofCTGFASonAngⅡinducedHK2cellsCTGFmRNAandproteinexpressionwereobservedbyRTPCRandconfocalmicroscopyrespectively.TheeffectofCTGFASonAngⅡinducedcellularultrastructurewereobservedbytransmissiveelectronicmicroscope(TEM).Theexpressionofαsmoothaction(αSMA)wereobservedbyimmunocytochemistry.Thecontrolgroupwastreatedwithscrambledoligonucleotide(SC).ResultsItwasshownthatAngⅡsignficantlyinducedtheincreasingexpressionofCTGFmRNAandprotein(P<,respectively).IfthecellswerestimulatedwithAngⅡfor96h,thecellularultrastructureshowedmesenchymalfeatures.AndtheseeffectscouldbepartiallyattenuatedbyCTGFAS.AngⅡsignificantlystimulatedtheexpressionofαSMAinatimedependentmanner,whichcouldbemarkedlyattenuatedbythetreatmentwithCTGFAS(P<,respectively).ThecontrolgrouptreatedwithSChadnosuchAngⅡinducestheEMToftubularepithelialcells,whichcanbesignificantlyattenuatedbytreatmentwithCTGFAS.OurdatahaveprovidedevidencethatCTGFmightbeinvolvedintheAngⅡinducedtubularcellEMT.
Keywords:
humanproximaltubularcell;angiotensinⅡ;connectivetissuegrowthfactor;celltransdifferentiation
大量研究说明,在各类缘故引发的慢性肾脏疾病中,肾小管间质纤维化(tubulointerstitialfibrosis,TIF)是阻碍肾脏病预后的重要因素。
肾小管上皮细胞(tubularepithelialcell,TEC)作为组成肾小管间质结构的要紧细胞之一,在激发肾小管间质炎症和纤维化中扮演了十分重要的角色。
晚近研究提示,TEC转分化是肾脏硬化初期重要的病理改变。
因此了解TEC转分化的发生机制,关于初期防治TIF具有十分重要的意义。
众所周知,肾脏局部肾素血管紧张素系统(RAS)的激活在肾脏纤维化发生、进展中起着关键的作用,已有研究证明血管紧张素Ⅱ(angiotensinⅡ,AngⅡ)能够诱导TEC发生转分化。
结缔组织生长因子(connectivetissuegrowthfactor,CTGF)是新近发觉的一个重要的致纤维化因子,在以增殖性病变成主的肾脏疾病中表达增高。
咱们新近的研究也说明,CTGF和糖尿病初期肾脏肥大可能关系紧密,AngⅡ受体拮抗剂irbesartan能够抑制该模型肾脏肥大和CTGF的表达[1];CTGF特异性抗体亦可阻断AngⅡ在体外诱导的肾小管细胞肥大[2]。
迄今尚无研究说明CTGF是不是介导了AngⅡ诱导的TEC转分化。
本研究拟探讨CTGF反义寡核苷酸对AngⅡ诱导的TEC转分化的可能阻碍,以增强肾脏病初期TEC转分化发生机制的研究,从而为临床初期防治肾脏纤维化的发生提供新的思路。
1材料和方式
细胞株
HK2细胞株为人近曲TEC的永生系,其维持了TEC大体的生物学特性,由Prof.Williams(Cardiff,UK)惠赠。
细胞用含10%新生牛血清的DMEM培育液培育,每日换液1次,2~3d传代1次。
要紧试剂
低糖型DMEM培育基(GIBCO公司),新生牛血清(杭州四季青生物工程材料研究所),AngⅡ(Sigma公司),CTGF反义寡核苷酸、错义寡核苷酸(全硫代磷酸化,上海捷倍思基因技术合成)。
CTGF反义寡核苷酸(CTGFAS)序列(按文献[3]选取):
5′TACTGGCGGCGGTCAT3′;错义寡核苷酸(SC):
5′GGTCTAGCTTGCGGAC3′。
TRIPURERNA提取液(GIBCOL公司)。
CTGF的PCR引物(按文献[4]选取),上游引物5′GAGGAAAACATTAAGAAGGGCAAA3′,下游引物5′CGGCACAGGTCTTGATGA3′,选取GAPDH为内参照。
山羊抗人CTGF多克隆抗体(R&D公司),FITC标记兔抗山羊IgG(北京中山生物技术),鼠抗人肌动蛋白单克隆抗体(北京中山生物技术),超敏SP试剂盒、AEC显色试剂盒(福州迈新生物技术开发)。
实验分组
实验分4组:
A组为正常对照组,B组为AngⅡ(10-7mol・L-1)组,C组为AngⅡ(10-7mol・L-1)加CTGFAS(20μg・ml-1)组,D组为AngⅡ(10-7mol・L-1)加SC(20μg・ml-1)组。
研究方式
RTPCR
用磷酸盐缓冲液(PBS)洗涤各组细胞后,加入TRIPURERNA提取液,按说明书步骤提取总RNA。
用紫外分光光度计测260、280nm吸光值,重复3次,计算A260nm/A280nm值。
按RTPCR操作步骤操作,总反映体系为50μl。
反映条件为:
94℃预变性5min;94℃扩增1min,55℃1min,72℃1min,35个循环;72℃延伸8min。
取CTGF和GAPDH的PCR产物各5μl,%的琼脂糖凝胶电泳,用ImageMasterVDS扫描分析仪扫描凝胶图谱。
用TotalLab分析软件对PCR条带进行密度扫描分析,目的片段和GAPDH的比值作为实验数据。
实验重复3次。
激光共聚焦显微镜
细胞行免疫荧光化学染色,一抗为山羊抗人CTGF多克隆抗体,1∶100;荧光二抗为FITC标记兔抗山羊IgG,1∶50。
PBS代替一抗作为阴性对照。
CTGF染色模式为胞浆着色,共聚焦显微镜下阳性细胞胞浆呈淡绿色或绿色荧光。
利用LSM510Version软件分析荧光强度。
透射电镜分析技术
搜集细胞,胰蛋白酶消化,然后以2000r・min-1离心15~20min,弃上清,加入4℃预冷的2%戊二醛,固定2h后经脱水、渗透、包埋、修块、切片及染色等步骤后上镜观看。
免疫细胞化学技术
细胞按试剂盒说明用SP免疫细胞化学染色方式测定HK2细胞α滑腻肌肌动蛋白(αSMA)表达。
一抗为αSMA,1∶50。
取PBS代替一抗作为阴性对照,用αSMA阳性对照片作为阳性对照。
αSMA染色模式为胞浆着色。
显微镜下,细胞胞浆呈淡红色或红色者为阳性细胞。
按红色染色深浅分为4级:
阴性(-)为胞浆内无红色,与背景一致;弱阳性(+)为胞浆内呈淡红色明显突出于背景;阳性(++)为胞浆内呈红色;强阳性(+++)为胞浆内呈深红色。
每张盖玻片在400倍高倍镜视野任意计数200个细胞,记录结果,用秩和查验统计各组间不同。
数据处置和统计学分析
实验所得数据均以±s表示,多组间资料比较用方差分析,两组间资料比较用t查验,品级资料用秩和查验。
利用SPSS统计软件进行统计分析,P<为有统计学意义。
2结果
CTGFAS对AngⅡ诱导的HK2细胞CTGFmRNA表达的阻碍
总RNA纯度的鉴定
A260nm/A280nm值在~之间,说明RNA纯度高。
琼脂糖电泳显示2八、18S条带清楚,前者荧光强度约为后者的两倍,无其它杂带,说明RNA完整、无降解。
RTPCR结果
B组AngⅡ刺激HK2细胞48h,细胞CTGFmRNA显著增加,与A组比较有显著统计学意义(A、B组OD值别离为±与±,P<);CTGFAS与AngⅡ诱导后表达明显增加的CTGFmRNA结合后,对CTGFmRNA的逆转录和扩增具有显著的抑制作用(C组OD值为±),与B组比较,P<;而SC(D组,OD值为±)无此作用(图1)。
CTGFAS对AngⅡ诱导的HK2细胞CTGF蛋白表达的阻碍
B组AngⅡ刺激HK2细胞48h,细胞CTGF蛋白表达明显增加,与A组比较有显著统计学意义(A、B组ROI值别离为±与±,P<);C组CTGFAS对AngⅡ诱导后细胞CTGF表达的增加具有显著的抑制作用(C组ROI值为±),与B组比较P<;而SC(D组,ROI值为±)无此作用(图2)。
CTGFAS对AngⅡ诱导的HK2细胞超微结构改变的阻碍
透射电镜观看显示,A组细胞表面微绒毛及细胞*与A组比较,P<;**与B组比较,P<
图1CTGFAS对AngⅡ诱导的HK2细胞CTGFmRNA表达的阻碍(略)
Fig1CTGFASattenuatedexpressionofCTGFmRNAnducedbyAngⅡinHK2cells
内线粒体丰硕,粗面内质网稀少;AngⅡ处置48h后与A组比较,细胞表面微绒毛减少,细胞内粗面内质网增多(见图3a箭头所指),线粒体减少,高尔基体增加;AngⅡ处置96h后,细胞超微结构显示出间质细胞样结构,表现为细胞胞膜上有致密样结构显现,胞浆内可见有弥散的细丝样物质(见图3b、c箭头所指);而CTGFAS干与后,上述现象有所改善;SC无此作用。
CTGFAS对AngⅡ诱导的HK2细胞αSMA表达的阻碍
AngⅡ对HK2细胞αSMA表达的时刻效应
显微镜下细胞胞浆中有淡红色或红色者为阳性细胞,阴性对照仅见细胞核呈蓝色,胞浆无着色。
A组(0h)HK2细胞形态正常,胞浆无着色,胞核呈淡蓝色,即无αSMA表达;AngⅡ干与后,HK2细胞形态慢慢肥大,胞浆染色慢慢增强,即AngⅡ能够呈时刻依托性地增进细胞αSMA表达增加。
在72h,αSMA表达阳性的细胞比例显著增加,与A组(0h)比较,P<;在实验进行96h内细胞的αSMA表达持续增加,并于96h时达峰值(图4)。
图2CTGFAS对AngⅡ诱导的HK2CTGF蛋白表达的阻碍(略)
Fig2CTGFASabolishedexpressionofCTGFproteininducedbyAngⅡinHK2cellsdeterminedbyconfocalmicroscopy
图3AngⅡ对HK2细胞超微结构的阻碍(略)
Fig3AngⅡinducedalterationsofcellularultrastructureinHK2cells
图4AngⅡ对HK2细胞αSMA表达的时刻效应(略)
Fig4AngⅡinducedtheexpressionofαSMAinHK2cellsinatimedependentmanner
CTGFAS对AngⅡ诱导的HK2细胞αSMA表达的阻碍
AngⅡ刺激后,HK2细胞形态肥大,胞浆染色增强,αSMA表达阳性的细胞显著增加,与A组比较(秩和查验),P<;而CTGFAS干与后,胞浆染色有所减弱,αSMA蛋白表达阳性的细胞减少,与B组比较,P<;SC无此作用(图5)。
图5CTGFAS对AngⅡ诱导的HK2细胞αSMA表达的阻碍(略)
Fig5CTGFASattenuatedtheexpressionofαSMAbyAngⅡinHK2cells
3讨论
肾小管上皮细胞的表型转化(phenotypictransformationofrenaltubularepithelialcells)这一概念是Nielson在1994年第一提出的,即TEC转化为成纤维细胞或肌成纤维细胞(myofibroblast,MyoF)。
Strutz等[5]1995年报导在抗基底膜抗体诱导的肾小球肾炎的小鼠模型中,小鼠TEC可转分化为MyoF。
随后Ng等[6]在5/6肾切除模型中发觉,受损的TEC可表达MyoF的标志蛋白αSMA,并向间质游动。
因此,表型转化的TEC可能是肾间质MyoF的部份来源,直接参与TIF的进展。
最近几年来大量研究揭露,肾脏局部RAS的激活在肾脏疾病进展中起十分关键的作用,AngⅡ能够引发肾脏固有细胞发生肥大、转分化,并合成大量胞外基质成份,增进肾小球硬化和TIF的形成。
给大鼠持续静脉输入AngⅡ,可诱导肾小管萎缩、肾间质表达αSMA、胞外基质积聚[7];利用AngⅡ转换酶抑制剂和其受体拮抗剂能显著抑制输注AngⅡ引发的肾间质胶原和纤维连接蛋白的合成[89],也能够减轻单侧输尿管阻塞小鼠肾间质αSMA的表达[10]。
体外实验证明,AngⅡ能够增进猪肾小管上皮株(LLCPK1)转分化为MyoF,AngⅡ受体拮抗剂能够阻断这一进程[11]。
CTGF是一富含半胱氨酸的分泌多肽,相对分子质量36000~38000,由346~349个氨基酸组成,属于CCN家族。
1991年,Bradham等第一次在人脐静脉内皮细胞条件培育基中发觉了CTGF。
晚近人们发觉CTGF过度表达与某些增生性或纤维化性肾脏疾病的发生紧密相关。
GoreHyer等[12]研究发觉,CTGF能够直接诱导TEC转分化。
国内也有研究说明,rhCTGF在体外能刺激人TEC向MyoF转分化,并增进其合成胞外基质[1314]。
Ruperez等[15]发觉,给正常大鼠注射AngⅡ后3d肾脏CTGF的表达上升,7d时肾小球、肾小管和肾动脉显现CTGF的过度表达,而且其与肾小管损伤程度及纤维结合蛋白沉积紧密相关;体外实验中,AngⅡ能诱导CTGF的表达,CTGFAS能够减少AngⅡ诱导的纤维结合蛋白的合成。
提示CTGF可能参与了AngⅡ的致纤维化作用。
本研究采纳反义寡核苷酸技术,经合理设计的具有高度序列特异性的CTGFAS通过氢键与CTGFmRNA上的杂交位点特异结合,从而阻断CTGF蛋白的表达。
咱们先前的研究证明,AngⅡ能够呈浓度和时刻依托性地诱导HK2细胞表达CTGFmRNA和蛋白[2]。
本研究结果提示,AngⅡ在体外直接诱导HK2细胞CTGFmRNA和蛋白质的表达增加,能够呈时刻依托性地诱导HK2细胞表达αSMA,而且引发细胞超微结构的改变,而上述作用均能够被CTGFAS显著抑制,说明AngⅡ所诱导的TEC转分化能够被CTGFAS所阻断。
咱们有理由推测CTGF可能介导了AngⅡ所致TEC转分化。
众所周知,TIF是慢性肾衰的一起途径和要紧机制之一。
而TEC转分化与TIF关系极为紧密。
TEC在TIF形成中既是受害者又是主动参与者。
本研究工作结合咱们先前的工作进一步说明,TEC过度表达CTGF可能介导了肾脏局部RAS的致纤维化作用,此为研究TIF形成机制开辟了新的思路。
[参考文献]
[1]刘必成,罗冬冬,孙子林,等.结缔组织生长因子在糖尿病大鼠肾脏中的表达及其意义[J].东南大学学报:
医学版,2002,21
(1):
3639.
[2]LIUBC,SUNJ,CHENQ,etal.RoleofconnectivetissuefactorinmediatinghypertrophyofhumanproximaltubularcellsinducedbyangiotensinⅡ[J].AmJNephrol,2003,23:
429437.
[3]HISHIKAWAK,OEMARBS,NAKAKIT.Staticpressureregulatesconnectivetissuegrowthfactorexpressioninhumanmesangialcells[J].JBiolChem,2001,276:
03.
[4]TWIGGSM,CHENMM,JOLYAH,etal.Advancedglycosylationendproductsupregulateconnectivetissuegrowthfactor(insulinlikegrowthfactorbindingprotein2)inhumanfibroblasts:
apotentialmechanismforexpansionofexcellularmatrixindiabetesmellitus[J].Endocrinol,2001,142:
.
[5]STRUTZF,CARONR,TOMASZEWSKIJ.Transdifferentiation:
anewconceptinrenalfibrogenesis[J].JAmSocNephrol,1994,5:
819.
[6]NGYY,HUANGTP,YANGWC,etal.Tubularepithelialmyofibroblasttransdifferentiationinprogressivetubulointerstitialfibrosisin5/6nephrectomizedrats[J].KindeyInt,1998,54:
864876.
[7]JOHNSONRJ,ALPERSCE,YOSHIMURAA,etal.RenalinjuryfromangiotensinⅡmediatedhypertensin[J].Hypertensin,1992,19:
464474.
[8]WULL,COXA,ROECJ,etal.Transforminggrowthfactorβ1andrenalinjuryfollowingsubtotalnephrectomyintherat:
roleofthereninangiotensinsystem[J].KidneyInt,1997,51:
.
[9]RUPEREZM,RUIZORTEGAM,ESTEBANV,etal.AngiotensinⅡincreasesconnectivetissuegrowthfactorinthekidney[J].AmJPathol,2003,163:
.
[10]MORRISSEYJJ,ISHIDOYAS,MCCRACKENR,etal.TheeffectofACEinhibitorsontheexpressionofmatrixgenesandtheroleofp53andp21(WAF1)inexperimentalrenalfibrosis[J].KidneyInt,1996,54(Suppl1):
S83S87.
[11]孙阳,郑法雷,刘彦信,等.血管紧张素Ⅱ及其Ⅰ型受体拮抗剂对猪肾小管上皮细胞株LLCPK1细胞转分化的作用[J].中华内科杂志,2000,39:
703704.
[12]GOREHYERE,SHEGOGUED,MARKIEWICZM,etal.TGFbetaandCTGFhaveoverlappinganddistinctfibrogeniceffectsonhumanrenalcells[J].AmJPhysiolRenalPhysiol,2002,283:
F707F716.
[13]张海燕,李幼姬,叶任高,等.结缔组织生长因子介导转化生长因子促肾小管上皮细胞转分化[J].中华肾脏病杂志,2003,19:
360364.
[14]ZHANGC,MENGX,ZHUZ,etal.Connectivetissuegrowthfactorregulatesthekeyeventsintubularepithelialtomyofibroblasttransitioninvitro[J].CellBiolInt,2004,28:
863873.
[15]RUPEREZM,RUIZORTEGAM,ESTEBANV.AngiotensinⅡincreasesconnectivetissuegrowthfactorinthekidney[J].AmJPathol,2003,163:
.
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