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分子生物学课件重点整理朱玉贤
第二章染色体与DNA
染色体(chromosome)是细胞在有丝割裂时遗传物质存在的特定形式,是间期细胞染色质结构紧密包装的结果。
真核生物的染色体在细胞生活周期的大部份时刻里都是以染色质(chromatin)的形式存在的。
染色质是一种纤维状结构,叫做染色质丝,它是由最大体的单位—核小体(nucleosome)成串排列而成的。
原核生物(prokaryote):
DNA形成一系列的环状附着在非组蛋白上形成类核。
染色体由DNA和蛋白质组成。
蛋白质由非组蛋白和组蛋白(H1,H2A,H2B,H3,H4)
DNA和组蛋白组成核小体。
组蛋白的一样特性:
P24
①进化上的保守性
②无组织特异性
③肽链氨基酸散布的不对称性:
碱性氨基酸集中散布在N端的半条链上。
④组蛋白的可修饰性:
甲基化、乙基化、磷酸化及ADP核糖基化等。
⑤H5组蛋白的特殊性:
富含赖氨酸(24%)(鸟类、鱼类及两栖类红细胞染色体不含H1而带有H5)
组蛋白的可修饰性
在细胞周期特按时刻可发生甲基化、乙酰化、磷酸化和ADP核糖基化等。
H3、H4修饰作用较普遍,H2B有乙酰化作用、H1有磷酸化作用。
所有这些修饰作用都有一个一起的特点,即降低组蛋白所携带的正电荷。
这些组蛋白修饰的意义:
一是改变染色体的结构,直接阻碍转录活性;二是核小体表面发生改变,使其他调控蛋白易于和染色质彼此接触,从而间接阻碍转录活性。
2、DNA
1)DNA的变性和复性
■变性(Denaturation)DNA双链的氢键断裂,最后完全变成单链的进程称为变性。
■增色效应(Hyperchromaticeffect)在变性进程中,260nm紫外线吸收值先缓慢上升,当达到某一温度时骤然上升,称为增色效应。
■融解温度(Meltingtemperature,Tm)变性进程紫外线吸收值增加的中点称为融解温度。
生理条件下为85-95℃
阻碍因素:
G+C含量,pH值,离子强度,尿素,甲酰胺等
■复性(Renaturation)热变性的DNA缓慢冷却,单链恢复成双链。
■减色效应(Hypochromaticeffect)随着DNA的复性,260nm紫外线吸收值降低的现象。
2)C值反常现象(C-valueparadox)C值是一种生物的单倍体基因组DNA的总量。
真核细胞基因组的最大特点是它含有大量的重复序列,而且功能DNA序列大多被不编码蛋白质的非功能DNA所隔开,这确实是闻名的“C值反常现象”。
(四)核小体(nucleosome):
用于包装染色质的结构单位,是由DNA链缠绕一个组蛋白核[(H2A、H2B、H3、H4)*2的八聚体】组成的。
一、原核生物基因组结构特点
●基因组很小,大多只有一条染色体
●结构简炼
●存在转录单元(trnascriptionaloperon)
●多顺反子(polycistron)
重叠基因由基因内基因、部份重叠基因、一个碱基重叠组成。
2、真核生物基因组结构特点
●真核基因组结构庞大3×109bp、染色质、核膜
●单顺反子
●基因不持续性断裂基因(interruptedgene)、内含子(intron)、外显子(exon)
●非编码区较多多于编码序列(9:
1)
●含有大量重复序列
■不重复序列/单一序列:
在基因组中有一个或几个拷贝。
真核生物的大多数基因在单倍体中都是单拷贝的。
如:
蛋清蛋白、血红蛋白等功能:
主若是编码蛋白质。
■中度重复序列:
在基因组中的拷贝数为101~104。
如:
rRNA、tRNA
一样是不编码蛋白质的序列,在调控基因表达中起重要作用
■高度重复序列:
拷贝数达到几百个到几百万个。
●卫星DNA:
A·T含量很高的简单高度重复序列。
一、DNA的一级结构:
指4种脱氧核苷酸的连接及其排列顺序,DNA序列是这一概念的简称。
碱基序列
2)特点:
●双链反向平行配对而成
●脱氧核糖和磷酸交替连接,组成DNA骨架,碱基排在内侧
●内侧碱基通过氢键互补形成碱基对(A:
T,C:
G)。
二、DNA的二级结构:
指两条多核苷酸链反向平行盘绕所产生的双螺旋结构。
2)分类:
右手螺旋:
A-DNA,B-DNA
左手螺旋:
Z-DNA
3、DNA的高级结构:
指DNA双螺旋进一步扭曲盘绕所形成的特定空间结构。
是一种比双螺旋更高层次的空间构象。
2)要紧形式:
超螺旋结构(正超螺旋和负超螺旋)
(一)DNA的半保留复制(semi-nservativereplication)
一、概念:
由亲代DNA生成子代DNA时,每一个新形成的子代DNA中,一条链来自亲代DNA,而另一条链那么是新合成的,这种复制方式称半保留复制。
3、DNA半保留复制的生物学意义:
DNA的半保留复制说明DNA在代谢上的稳固性,保证亲代的遗传信息稳固地传递给后代。
(二)与DNA复制有关的物质
一、原料:
四种脱氧核苷三磷酸(dATP、dGTP、dCTP、dTTP)
二、模板:
以DNA的两条链为模板链,合成子代DNA
3、引物:
DNA的合成需要一段RNA链作为引物
4、引物合成酶(引发酶):
此酶以DNA为模板合成一段RNA,这段RNA作为合成DNA的引物(Primer)。
实质是以DNA为模板的RNA聚合酶。
五、DNA聚合酶:
以DNA为模板的DNA合成酶
●以四种脱氧核苷酸三磷酸为底物
●反映需要有模板的指导
●反映需要有3-OH存在
●DNA链的合成方向为53
性质
聚合酶Ⅰ
聚合酶Ⅱ
聚合酶Ⅲ
3'5'外切活性
+
+
+
5'3'外切活性
+
-
-
5'3'聚合活性
+中
+很低
+很高
新生链合成
-
-
+
聚合酶Ⅰ主若是对DNA损伤的修复;和在DNA复制时切除RNA引物并填补其留下的间隙。
聚合酶Ⅱ修复紫外光引发的DNA损伤
聚合酶ⅢDNA复制的要紧聚合酶,还具有3→5’外切酶的校对功能,提高DNA复制的保真性
六、DNA连接酶(1967年发觉):
假设双链DNA中一条链有切口,一端是3’-OH,另一端是5’-磷酸基,连接酶可催化这两头形成磷酸二酯键,而使切口连接。
可是它不能将两条游离的DNA单链连接起来
DNA连接酶在DNA复制、损伤修复、重组等进程中起重要作用
7、DNA拓扑异构酶(DNATopisomerase):
拓扑异构酶І:
使DNA一条链发生断裂和再连接,作用是松解负超螺旋。
要紧集中在活性转录区,同转录有关。
例:
大肠杆菌中的ε蛋白
拓扑异构酶Ⅱ:
该酶能临时性地切断和从头连接双链DNA,作用是将负超螺旋引入DNA分子。
同复制有关。
例:
大肠杆菌中的DNA旋转酶
八、DNA解螺旋酶/解链酶(DNAhelicase):
通过水解ATP取得能量来解开双链DNA。
中的rep蛋白确实是解螺旋酶,还有解螺旋酶I、II、III。
rep蛋白沿3’5’移动,而解螺旋酶I、II、III沿5’3’移动。
九、单链结合蛋白(SSBP-single-strandbindingprotein):
稳固已被解开的DNA单链,阻止复性和爱惜单链不被核酸酶降解。
(三)DNA的复制进程(大肠杆菌为例)
双链的解开
RNA引物的合成
DNA链的延伸
切除RNA引物,填补缺口,连接相邻的DNA片段
一、双链的解开------ftju制有特定的起始位点,叫做复制原点。
ori(或o)、富含A、T的区段。
从复制原点到终点,组成一个复制单位,叫复制子
复制时,解链酶等先将DNA的一段双链解开,形成复制点,那个复制点的形状象一个叉子,故称为复制叉
双链解开、复制起始P44
大约20个DnaA蛋白在ATP的作用下与oriC处的4个9bp保守序列相结合
在HU蛋白和ATP的一起作用下,Dna复制起始复合物使3个13bp直接重复序列变性,形成开链
解链酶六体别离与单链DNA相结合(需DnaC帮忙),进一步解开DNA双链
二、RNA引物的合成
DnaB蛋白活化引物合成酶,引发RNA引物的合成。
引物长度约为几个至10个核苷酸,
3、DNA链的延伸
DNA的半不持续复制(semi-discontinuousreplication):
DNA复制时其中一条子链的合成是持续的,而另一条子链的合成是不持续的,故称半不持续复制。
在DNA复制时,合成方向与复制叉移动的方向一致并持续合成的链为前导链;合成方向与复制叉移动的方向相反,形成许多不持续的片段,最后再连成一条完整的DNA链为滞后链。
在DNA复制进程中,前导链能持续合成,而滞后链只能是断续的合成53的多个短片段,这些不持续的小片段称为冈崎片段。
4、切除RNA引物,填补缺口,连接相邻的DNA片段(复制终止)
当复制叉碰到约22个碱基的重复性终止子序列(Ter)时,Ter-Tus蛋白复合物能使DnaB再也不将DNA解链,阻挡复制叉继续前移。
P47
在DNA聚合酶Ⅰ催化下切除RNA引物;留下的间隙由DNA聚合酶Ⅰ催化合成一段DNA填补上;在DNA连接酶作用下,连接相邻的DNA链
(四)复制的几种要紧方式P42
一、双链环状、θ型复制、双向等速
二、滚环型:
(1)模板链和新合成的链分开;
(2)不需RNA引物,在正链3‘-OH上延伸
(3)只有一个复制叉;
3、D环复制---单向复制的特殊方式如:
动物线粒体DNA
(五)真核生物中DNA的复制特点
一、真核生物每条染色体上有多个复制起点,多复制子(约150bp左右);
二、复制叉移动的速度较慢(约50bp/秒),仅为原核生物的1/10。
3、真核生物染色体在全数复制完之前,各个起始点再也不从头开始DNA复制;真核生物快速生长时,往往采纳更多的复制起点。
4、真核生物有多种DNA聚合酶。
五、真核生物DNA复制进程中的引物及冈崎片段的长度均小于原核生物。
(真核冈崎片段长约100-200bp,原核冈崎片段长约1000-2000bp。
)
(六)原核和真核生物DNA的复制特点比较
1复制起点(ori):
原核一个,真核多个;
2复制子:
原核一个,真核多个;
3复制子长度:
原核长;真核短;
4复制叉:
原核多个;真核多个;
5复制移动速度:
原核较快;真核较慢;
6真核生物染色体在全数完成复制前,各起始点的DNA复制不能再开始。
而在快速生长的原核生物中,复制起点上能够持续开始新的DNA复制。
7原核生物染色体的复制与细胞割裂同步,能够多次复制;真核生物染色体的复制发生在S期,是细胞分类的特按时期,而且仅此一次。
四、DNA的修复
DNA修复系统
功能
错配修复
恢复错配
碱基切除修复
切除突变的碱基
核甘酸切除修复
修复被破坏的DNA
DNA直接修复
SOS系统
修复嘧啶二体或甲基化DNA
DNA的修复,导致变异
1、错配修复(mismatchrepair)
●Dam甲基化酶使母链位于5’GATC序列中腺甘酸甲基化
●甲基化紧随在DNA复制以后进行(几秒种后至几分钟内)
●依照复制叉上DNA甲基化程度,切除尚未甲基化的子链上的错配碱基
2、碱基切除修复excisionrepair
所有细胞中都带有不同类型、能识别受损核苷酸位点的糖苷水解酶,它能特意切除受损核苷酸上的N-β-糖苷键,在DNA链上形成去嘌呤或去嘧啶位点,统称为AP位点。
一些碱基在自发或诱变下会发生脱酰胺,然后改变配对性质,造成氨基转换突变
*腺嘌呤变成次黄嘌呤与胞嘧啶配对
*鸟嘌呤变成黄嘌呤与胞嘧啶配对
*胞嘧啶变成尿嘧啶与腺嘌呤配对
3、核苷酸切除修复
1)通过特异的核酸内切酶识别损伤部位
2)由酶的复合物在损伤的两边切除几个核苷酸
3)DNA聚合酶以母链为模板复制合成新子链
4)DNA连接酶将切口补平
4、DNA的直接修复
在DNA光解酶的作用下将环丁烷胸腺嘧啶二体和6-4光化物还原成为单体
甲基转移酶使O6-甲基鸟嘌呤脱甲基生成鸟嘌呤,避免G-T配对
SOS反映(SOSresponse):
是细胞DNA受到损伤或复制系统受到抑制的紧急情形下,细胞为求生存而产生的一种应急方法。
*包括诱导DNA损伤修复、诱变效应、细胞割裂的抑制和溶原性细菌释放噬菌体等。
细胞癌变也与SOS反映有关。
两个作用
(1)DNA的修复;
(2)产生变异
五、DNA的转座
DNA的转座或叫移位(transposition):
由可移位因子(transposableelement)介导的遗传物质重排现象。
转座子(transposonTn):
存在于染色体DNA上可自主复制和位移的大体单位。
已经发觉“转座”这一命名并非十分准确,因为在转座进程中,可移位因子的一个拷贝常常留在原先位置上,在新位点上显现的仅仅是它的拷贝。
因此,转座有别于同源重组,它依托于DNA复制。
原核生物转座子的类型:
一、插入序列(IS)
IS是最简单的转座子,不含有任何宿主基因,它们是细菌染色体或质粒DNA的正常组成部份。
二、复合转座子(compositetransposon)
复合转座子是一类带有某些抗药性基因(或其他宿主基因)的转座子,其两翼往往是两个相同或高度同源的IS序列
3、TnA家族
TnA家族没有IS序列、体积庞大(5000bp以上)、带有3个基因,其中一个编码β-内酰胺酶(AmpR),另两个那么是转座作用所必需的。
(三)转座作用的机制
转座时发生的插入作用的普遍特点,是受体分子中有一段很短的(3~l2bp)、被称为靶序列的DNA会被复制,使插入的转座子位于两个重复的靶序列之间。
关于一个特定的转座子来讲,它所复制的靶序列长度是一样的,如IS1两翼总有9个碱基对的靶序列,而Tn3两头总有5bp的靶序列。
靶序列的复制可能起源于特定内切酶所造成的黏性DNA结尾。
(三)转座作用的遗传学效应p63
(1)转座引发插入突变
(2)转座产生新的基因(3)转座产生的染色体畸变(4)转座引发的生物进化
反转录转座子(retrotransposon):
指通过RNA为中介,反转录成DNA后进行转座的可动元件。
第三章生物信息的传递(上)——从DNA到RNA
转录(transcription):
生物体以DNA为模板合成RNA的进程。
参与转录的物质
原料:
NTP(ATP,UTP,GTP,CTP)
模板:
DNA
酶:
RNA聚合酶
其他蛋白质因子
RNA合成方向:
5'到3'
转录的不对称性:
在RNA的合成中,DNA的二条链中仅有一条链可作为转录的模板,称为转录的不对称性。
与mRNA序列相同的那条DNA链称为编码链;将另一条依照碱基互补原那么指导mRNA合成的DNA链称为模板链。
DNA分子上转录出RNA的区段,称为结构基因。
转录单元(transcriptionunit)一段从启动子开始至终止子终止的DNA序列。
二、参与转录起始的关键酶与元件
(一)RNA聚合酶
●原核生物RNA聚合酶(大肠杆菌为例)---全酶=核心酶+σ因子
亚基
基因
相对分子量
亚基数
组分
功能
α
rpoA
36500
2
核心酶
核心酶组装,
启动子识别
β
rpoB
151000
1
核心酶
β和β'共同形成
RNA合成的活性中心
β'
rpoC
155000
1
核心酶
ω
?
11000(需查)
1
核心酶
?
σ
rpoD
70000
1
σ因子
存在多种σ因子,
用于识别不同的启动子
真核细胞的三种RNA聚合酶特点比较
酶
位置
转录产物
相对活性
对α-鹅膏蕈碱的敏感性
RNA聚合酶Ⅰ
核仁
rRNA
50-70%
不敏感
RNA聚合酶Ⅱ
核质
hnRNA
20-40%
敏感
RNA聚合酶Ⅲ
核质
tRNA
约10%
存在物种特异性
RNA聚合酶与DNA聚合酶的区别
RNA聚合酶
DNA聚合酶
大小(M)
大,×105dol
小,×105dol
引物
无
有
产物
较短,游离
较长,与模板以氢键相连
作用方式
一条链的某一段
两条链同时进行
外切酶活性
无
5’3’,3’5’
校对合成能力
无
有
修复能力
无
有
(二)启动子(promoter)
启动子概念:
指能被RNA聚合酶识别、结归并启动基因转录的一段DNA序列。
TATA区:
酶的紧密结合位点(富含AT碱基,利于双链打开)
TTGACA区:
提供了RNA聚合酶全酶识别的信号
转录起点---与新生RNA链第一个核甘酸相对应DNA链上的碱基。
真核生物启动子的结构
核心启动子(corepromoter)
●概念:
指保证RNA聚合酶Ⅱ转录正常起始所必需的、最少的DNA序列,包括转录起始位点及转录起始位点上游TATA区
●作用:
选择正确的转录起始位点,保证精准起始
2、上游启动子元件
●包括CAAT盒(CCAAT)和GC盒(GGGCGG)等
●作用:
操纵转录起始频率。
(三)转录起始复合物---二元闭合复合物、二元开链复合物、三元复合物。
(原核)
三、转录的大体进程
1、起始位点的识别:
RNA聚合酶与启动子DNA双链彼此作用并与之相结合的进程。
RNA聚合酶全酶
(2)与模板结合
二、转录起始
①RNA聚合酶全酶
(2)与模板结合
•DNA双链解开
•在RNA聚合酶作用下发生第一次聚合反映,形成转录起始复合物
5-pppG-OH+NTP5-pppGpN-OH3+ppi
转录起始复合物:
RNApol
(2)-DNA-pppGpN-OH3
3、RNA链的延伸
●亚基脱落,RNA–pol聚合酶核心酶变构,与模板结合松弛,沿着DNA模板前移;
●在核心酶作用下,NTP不断聚合,RNA链不断延长。
注意:
9个核苷酸以前还在启动子区,容易脱落,一旦形成9个以上的核苷酸并离开启动子区,转录正式进入眼神时期。
4、转录终止
终止子(terminator):
位于基因的结尾,在转录终止点之前有一段回文序列(反向重复序列)约6-20bp。
真核生物终止:
由一段特定序列5′-AATAAA-3′和回文序列(反向重复序列)组成。
分为两类:
●强终止子-内部终止子:
不依托Rho(ρ)因子的终止。
●弱终止子-需要ρ因子(rhofactor),又称为ρ依托性终止子(Rho-dependentterminator)
不依托因子的终止
当RNA链延伸到转录终止位点时,RNA聚合酶再也不形成新的磷酸二酯键,RNA-DNA杂合物分离,转录泡瓦解,DNA恢复成双链状态,而RNA聚合酶和RNA链都被从模板上释放出来,这确实是转录的终止。
终止位点上游一样存在一个富含GC碱基的二重对称区,RNA形成发夹结构;
在终止位点前面有一段由4-8个A组成的序列,RNA的3’端为寡聚U
发夹式结构和寡聚U的一起作用使RNA从三元复合物中解离出来。
依托因子的终止
因子:
六聚体蛋白、水解各类核甘三磷酸促使新生RNA链从三元转录复合物中解离出来,从而终止转录。
(二)、真核生物的转录进程
1.转录起始
真核生物的转录起始上游区段比原核生物多样化,转录起始时,RNA-pol不直接结合模板,其起始进程比原核生物复杂。
(1).转录起始前的上游区段
•顺式作用元件(cis-actingelement):
阻碍自身基因表达活性的非编码DNA序列。
例:
启动子、增强子、弱化子等
•增强子:
在启动区存在的能增强或增进转录的起始的DNA序列。
但不是启动子的一部份。
特点:
1.远距离效应;2.无方向性;3.顺式调剂;4.无物种和基因的特异性;5.具有组织特异性;6.有相位性;7.有的增强子能够对外部信号产生反映。
(2).转录因子:
能直接、间接识别和结合转录上游区段DNA的蛋白质,现已发觉数百种,统称为反式作用因子(trans-actingfactors)。
反式作用因子中,直接或间接结合RNA聚合酶的,那么称为转录因子(transcriptionalfactors,TF)。
参与RNA-polⅡ转录的TFⅡ--TFⅡD、TFⅡA、TFⅡB、TFⅡF、TFⅡE、TFⅡH
(3)转录起始前复合物(pre-initiationcomplex,PIC)
真核生物RNA-pol不与DNA分子直接结合,而需依托众多的转录因子。
(4)模板理论(piecingtheory)
一个真核生物基因的转录需要3至5个转录因子。
转录因子之间相互结合,生成有活性、有专一性的复合物,再与RNA聚合酶搭配而有针对性地结合、转录相应的基因。
2.转录延伸
真核生物转录延长进程与原核生物大致相似,但因有核膜相隔,没有转录与翻译同步的现象。
RNA-pol前移处处都遇上核小体。
转录延长进程中能够观看到核小体移位和解聚现象。
3.转录终止——和转录后修饰紧密相关。
四、转录后加工
5’端加帽、3’端加尾、RNA的剪接、RNA的编辑
一、在5’端加帽
5’端的一个核苷酸老是7-甲基鸟核苷三磷酸(m7Gppp)。
mRNA5’端的这种结构称为帽子(cap)。
帽子结构功能:
①能被核糖体小亚基识别,促使mRNA和核糖体的结合;
②m7Gppp结构能有效地封锁mRNA5’结尾,以爱惜mRNA免受5’核酸外切酶的降解,增强mRNA的稳固。
二、3’端加尾--多聚腺苷酸尾巴---AAUAAA:
★准确切割。
。
★加poly(A)
多聚腺苷酸尾巴功能:
提高了mRNA在细胞质中的稳固性。
3、RNA的剪接
生物体内内含子的要紧类型:
U-AG、AU-AC、Ⅰ类内含子、Ⅱ类内含子Ⅲ类内含子
参与RNA剪接的物质:
snRNA(核内小分子RNA)、snRNP(与snRNA结合的核蛋白)、核内RNA(U1、U2、U4、U5、U6)
4、RNA的编辑
*编辑(editing)是指转录后的RNA在编码区发生碱基的突变、加入或丢失等现象。
五、原核生物与真核生物mRNA的特点比较
一、原核生物mRNA的特点
●半衰期短
●多以多顺反子的形式存在
单顺反子mRNA:
只编码一个蛋白质的mRNA。
多顺反子mRNA:
编码多个蛋白质的mRNA。
Z:
β-半乳糖苷酶Y:
透过酶A:
乙酰基转移酶
ZYA为结构基因
●5’端无“帽子”结构,3’端没有或只有较短的poly(A)结构。
●SD序列:
原核生物起始密码子AUG上游7-12个核苷酸处有一被称为SD序列的保守区。
mRNA顶用于结合原核生物核糖体的序列。
P85
二、真核生物mRNA的特点
“基因”的分子生物学概念:
产生一条多肽链或功能RNA所必需的全数核甘酸序列。
●5’端存在“帽子”结构
●多数mRNA3’端具有poly(A)尾巴(组蛋白除外)
●以单顺反子的形式存在
六、RNA合成与DNA合成异同点
相同点:
1、都以DNA链作为模板
2、合成的方向均为5’→3’
3、聚合反映均是通过核苷酸之间形成的3’,5’-磷酸二酯键,使核苷酸链延长。
不同点:
复制
转录
模板
两条链均复制
模板链转录
(不对称转录)
原料
dNTP
NTP
酶
DNA聚
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