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发酵工程
发酵工程
第1节概述
1、发酵工程:
是将微生物学、生物化学和化学工程学的基本原理有机地结合起来利用微生物(或其它生物细胞)的生长和代谢活动来生产各种有用物质的工程技术。
2、什么是发酵?
在工业微生物领域,把利用微生物在有氧或无氧条件下的生命活动来制备微生物菌体或其代谢产物的过程统称为发酵。
(现在已扩展到培养动、植物细胞来制备产品)
青霉素发酵生产:
固体培养---液体深层培养
3、发酵工业的地位:
现代发酵工业已形成完整的工业体系;发酵工业已成为全球经济的重要组成部分。
4、发酵工程的内容:
发酵工程的主体为利用微生物,特别是经DNA重组技术改造的微生物来生产有用物质。
目标:
菌体生产;代谢产物;转化产物(微生物机能的利用)
5、发酵的类型:
(1)微生物菌体发酵:
以获得具有某种用途的菌体为目的的发酵。
(2)微生物代谢产物发酵。
微生物代谢的类型:
1初级代谢产物
在微生物对数生长期所产生的产物,如氨基酸、核苷酸、蛋白质、核酸、糖类等,是菌体生长繁殖所必需的物质。
2次级代谢产物
在菌体生长静止期,某些菌体能合成在生长期中不能合成的、具有一些特定功能的产物,如抗生素、生物碱、细菌毒素、植物生长因子等。
这些产物与菌体生长繁殖无明显关系,叫做次级代谢产物。
次级代谢与初级代谢并非独立的代谢途径,两者有密切的关系,初级代谢的中间体或产物往往是次级代谢的前体物或起始物。
(3)微生物转化发酵
微生物转化就是利用微生物细胞的一种或多种酶,把一种化合化转变成结构相关的更有经济价值的产物。
生长细胞、静止营养细胞、孢子或干细胞均可进行转化反应。
(4)生物工程细胞的发酵
指利用生物工程技术所获得的生物细胞,如DNA重组的“工程菌”,细胞融合所得到的“杂合细胞”以及动、植物细胞等,进行培养的新型发酵。
6、发酵方法:
(1)表面培养法:
微生物在基质表面上进行培养的方法.劳动强度大、占地面积大、产量低、易污染,已被深层培养法所取代。
(2)深层培养法是以微生物细胞生长于液体培养基深层(好氧或厌氧)中进行培养的方法。
振荡培养,即所说的摇瓶振荡培养,培养微生物所需的氧气是外界空气与培养液在振荡时进行自然交换提供的。
深层(搅拌)通气培养,是强制通入无菌空气到密闭发酵罐中进行(搅拌)培养的方式,微生物所需的氧是外界通入空气中的氧经过溶解后提供的。
生产效率高、占地小、可人为控制等优点,广泛应用于抗生素、维生素、有机酸、酶制剂等生产中。
7、发酵过程:
(1)菌种:
必须从自然界分离得到能生产所需产物的菌种,并经分离、纯化及选育后,或是经基因工程改造后的“工程菌”,才能供发酵使用。
定期进行菌种纯化和育种,筛选出高产量和高质量的优良菌株。
菌种保存,一般采用砂土管或冷冻干燥管保存。
(2)种子制备:
将贮存的菌种进行生长繁殖,以获得良好的孢子或生物细胞。
种子制备的培养方式和培养级数,决定于菌种的性质、生产规模的大小和生产工艺的特点。
(3)发酵:
发酵是在无菌状态下进行纯种培养的过程,转移种子要采用无菌接种技术。
(4)下游处理:
发酵结束后,发酵液或生物细胞要进行分离和提取精制,将发酵产物制成符合要求的成品。
第二节优良菌种的选育
1、工业微生物育种的目的:
菌种选育的目的是改良菌种的特性,使其符合工业生产的要求。
提高其生产能力;适应工艺条件的菌种,如能利用廉价的发酵原料、能耐受某些化学消沫剂等。
2、菌种选育方法:
自然选育;诱变育种;杂交育种;分子育种。
突变
生物表型突然发生的可遗传的变化,实质是可通过复制而遗传给子代的永久性DNA序列变化。
3、菌种的自然选育:
不经人工诱变,利用微生物的自然突变进行菌种选育的过程称为自然选育或自然分离。
4、菌种分离,筛选步骤:
(1)采样:
是筛选菌种的几个关键步骤的第一步。
土壤是微生物聚集的最主要场所,微生物的种群分布会因土壤的组成和含有的有机物的种类及数量的不同而异。
水,特别是江、河、湖、海以及被特种物质污染的水域是微生物生存的另一重要场所。
近年来,由于极端环境微生物为人类提供了大量的具有特殊性能的酶和生物活性物质,土壤和水中生存的大量微生物已成为人们竞争开发的微生物资源。
(2)富集培养与分离
①直接分离
在自然界中微生物都是许多种类混杂在一起,为了进行纯种培养,首先必须进行纯种分离。
平板划线法、稀释平板培养分离法。
根据各种微生物的不同外观,挑取单个菌落,再反复划线培养就可得到纯种。
②先富集、再分离
大多数情况下,在采集的样品中,目的微生物不一定是优势菌,数量有限,为了增加分离成功几率,需要设法增加待分离菌的数目。
因此,首先对样品在适当的培养基上进行富集培养,使样品中目的菌从劣势菌转化成人工环境中的优势菌,以便将它们从样品中分离出来。
富集培养选择压的确定:
微生物的生长会改变培养基的性质,从而改变选择压力。
特别是采用特定的碳或氮源或限制性基质为选择压力时,由于它们在培养过程中不断消耗,造成选择压力的改变,因而需要重复移植培养,再进行分离。
(3)发酵实验
利用所选出的菌种进行小规模发酵实验。
5、诱变育种
自然突变的频率极低,不能满足育种工作的需要。
通过诱变剂处理可以大大提高菌种的突变频率、扩大变异幅度,从中选出具有优良特性的变异菌株。
诱变育种是诱发突变与随机筛选相结合的一项育种技术,它在工业微生物育种中使用最多,而且至今仍是菌种改良的重要手段。
(1)定义:
诱变育种
人为地利用物理、化学等因素,使诱变的细胞内遗传物质染色体或DNA的片段发生缺失、易位、倒位重复等畸变,或DNA的某一部位发生改变(又称点突
变),从而使微生物的遗传物质DNA或RNA的化学结构发生变化,引起微生物的遗传变异。
(2)突变诱发过程:
诱变剂接触DNA分子前:
细胞壁对诱变剂的透性;细胞质的某些组份和某些酶可和诱变剂相互作用而影响诱变效果;基因所处的状态,培养条件,在培养基中加入诱导剂使基因处于转录状态,DNA双链解开,有利于诱变剂的作用。
DNA损伤的修复:
DNA序列的可变性是绝对的,不变是相对的。
改变了DNA序列有可能永久存在下去,或只能存在很短时间,甚至刚刚出现即被纠正过来。
DNA序列的可变性是物种形成和增加的基础,而不变的相对稳定性是物种稳定的基础。
从前突变到突变:
损伤:
DNA序列可修复的变化。
损伤主要是DNA序列在复制过程中在一条链上可以经修复系统改正的DNA序列的变化。
突变:
是可以通过复制而遗传给子代的永久性DNA序列变化。
只有非致死的突变才能永久遗传。
已知DNA修复机制:
光修复、切补修复、重组修复和SOS修复等。
SOS修复:
一种细胞DNA出现损伤或复制受到抑制而诱导产生的修复。
SOS反应广泛存在于原核生物和真核生物。
此反应不仅有DNA修复作用,而且系统变异,有些致癌物质正是通过SOS反应的诱导而产生癌变的。
SOS修复具有引起差错的性质,有利于突变。
前突变形成后,细胞中几种修复系统会对它施加作用。
从对突变诱发的影响看,修复系统可以分为两类:
(1)校正差错:
如光复合作用,切补修复和DNA多聚酶较正这三种修复作用具有校正差错的性质而不利于突变的诱发;
(2)引起差错:
如重组修复和SOS修复系统具有引起差错的性质而有利于突变的发生。
从突变到突变型:
突变基因的出现并不等于突变表型的出现,表型的改变落后于基因型改变的现象称为表型迟延。
表型迟延有两种:
分离性迟延和生理性迟延。
生理性迟延最明显的例子是噬菌体抗性突变的表达。
6、诱变育种方案设计:
出发菌株(原菌株)
纯化
微
菌株特性检查
生
诱离心收集菌体
物
变离心洗涤
摇瓶培养
诱
过玻璃珠振荡分散
变
制备细胞或孢子悬浊液
程过滤
育
细胞计数
种
诱变剂处理诱变条件试验
的
一稀释涂平板
突
筛
般变
中间培养菌生
选
程株产
活细胞计数
过性性
序初复能能
突变菌株分离
程筛筛检检
测测
微生物诱变育种的一般程序(诱变与筛选)
(1)诱变过程
①出发菌株
纯种作为出发菌株,排除异核体或异质体的影响。
产量高、生长快、廉价营养要求低、可利用原料等。
对诱变剂敏感,对数生长期,已经诱变过的菌株。
②诱变剂的选择(种类、剂量、作用方式)
紫外线:
主要作用于DNA分子的嘧啶碱基。
亚硝酸:
主要作用于DNA分子的嘌呤碱基。
烷化剂:
使DNA分子增加烷基侧链(烷化作用),从而改变DNA的结构。
剂量:
诱变率随诱变剂量的增加而提高,但达到一定程度后,再提高剂量,反而会使诱变率下降。
高剂量:
致死率高,形成异核体,较纯的变异菌落
中剂量:
高产株出现频率高
低剂量:
有利于高产株稳定
诱变处理方法:
单一诱变剂处理和复合处理。
复合处理是指用两种以上的诱变方法处理菌种,处理效果比单一处理好。
③影响诱变效果的因素:
出发菌株的遗传特性、生理状态;诱变剂种类、剂量、诱变过程;环境条件,温度、DO、pH。
(2)筛选过程
随机筛选:
即将诱变处理后形成的各单细胞菌株,不加选择地随机进行发酵并测定其产量,从中选
出产量最高者进一步复试。
抗生素生产中仍常用。
理化筛选:
根据产物已知的合成途径、代谢机理和分子结构来设计和采用一些筛选方法。
第三节发酵过程及检测
1、微生物发酵方式:
(1)分批发酵:
分批发酵时,在灭菌的培养基上接种相应的微生物,之后不再加入新的培养基,经过若干时间发酵后再将发酵液一次放出。
特征:
微生物的生长、各种营养物质的消耗和代谢产物的合成都时刻处于变化之中,整个发酵过程处于不稳定状态。
(2)连续发酵
指以一定的速度向发酵罐内添加新鲜培养基,同时以相同的速度流出培养液,从而使发酵罐内的液量维持恒定,微生物在稳定状态下生长。
恒浊法(turbidostat),利用浊度来检测细胞的浓度由控制生长限制基质的流量来维持恒定的菌体浓度。
恒化法(chemostat),以某种必需营养作为生长限制基质,通过控制其流加速率造成适应于这种流加条件的生长密度和生长速率。
连续发酵具有以下优点:
1)可维持稳定的操作条件,细胞的生长状态一致,产率和
产品质量稳定;
2)易实现机械化和自动化,降低劳动强度,减少操作人员
与病原微生物和毒性产物接触的机会;
3)减少设备清洗、准备和灭菌等非生产占用时间,提高了
设备利用率;
4)生物反应器体积小;
5)灭菌次数减少,测量仪器的探头寿命延长;
6)容易对过程进行优化,有效地提高发酵产率。
连续发酵的缺点:
对设备、仪器及控制元器件的要求较高,投资成本高;
由于是开放系统,发酵周期长,容易造成杂菌污染,长时间维持工业规模生产的无菌状态很困难;
在长期连续发酵中,微生物易发生变异;
粘性丝状菌菌体容易附在器壁上生长及在发酵液内结团给连续发酵操作带来困难。
(3)补料分批发酵
补料分批发酵又称半连续发酵,是介于分批发酵和连续发酵之间的一种发酵技术,是指在微生物分批发酵中,以某种方式向培养系统补加一定物料的培养技术。
兼有分批发酵向连续发酵两者优点,克服了两者的缺点。
特点:
消除底物抑制;高密度细胞培养;延长次级代谢产物的生产时间;稀释有毒代谢产物;降低染菌和避免遗传不稳定性。
2、发酵动力学
发酵动力学是发酵工程的一个重要组成部分,它研究各种发酵过程中变量在活细胞的作用下变化的规律,以及各种发酵条件对这些变量变化速度的影响。
对发酵过程进行简化:
1)反应器内完全混合,即任何区域的温度、pH、物质浓度等变量完全一致;
2)温度、pH等环境条件能够稳定控制,从而使动力学参数也保持相对稳定;
3)细胞固有的化学组成不随发酵时间和某些发酵条件的变化而发生明显变化;
4)各种描述发酵动态的变量对发酵条件变化的反应无明显滞后。
质量平衡法:
物质在系统中积累速度=物质进入系统的速度+物质在系统中生成的速度—物质排出系统的速度—物质在系统中消耗的速度
3、发酵检测的参数
(1)物理参数:
参数名称单位测定方法意义及主要作用
温度℃,K传感器维持生长、合成
罐压Pa压力表维持正压,增加溶氧
空气流量V/Vmin,m3/h传感器供氧,排废气,提高KLa
搅拌转速r/min传感器物料混合,提高KLa
搅拌功率KW传感器反映搅拌情况,KLa
粘度Pa.S粘度计反映菌生长情况,
密度g/cm3传感器反映发酵液性质
装量M3,L传感器反映发酵液数量
浊度透光度%传感器反映菌体生长情况
泡沫传感器反映发酵代谢情况
传质系数KLa1/h间接计算,在线检测反映供氧效率
加糖速度kg/h传感器反映耗氧情况
加消泡剂速度kg/h传感器反映泡沫情况
加中间体或前体速率kg/h传感器反映前体和基质利用情况
加其它基质速率kg/h传感器反映基质利用情况
(2)化学参数:
参数名称单位测定方法意义及主要作用
酸碱度pH传感器反映菌代谢情况
溶氧mg/L传感器反映氧供给和消耗情况
排气氧浓度Pa传感器,热磁氧分析仪了解耗氧情况
氧化还原电位mV传感器反映菌的代谢情况
溶解CO2浓度%传感器了解CO2对代谢的影响
排气CO2浓度%传感器,红外吸收了解菌的呼吸情况
总糖、葡萄糖、蔗糖、淀粉kg/m3取样了解发酵过程变化
前体及中间体浓度mg/mL取样产物合成情况
氨基酸浓度mg/mL取样了解氨基酸等含量变化
矿物盐浓度mol,%取样,离子选择电极了解离子含量对发酵的影响
Fe2+,Mg2+,Ca2+,Na+
NH4+,PO43-,SO42-
(3)生物参数:
参数名称单位测定方法意义及主要作用
菌体浓度g(DCW)/g取样了解生长情况
菌体中RNA,DNA含量g(DCW)/g取样了解生长情况
菌体中ATP,ADP,AMPg(DCW)/g取样了解菌的能量代谢情况
菌体中NADH含量g(DCW)/g在线荧光了解菌的合成能力
菌体中蛋白质含量g(DCW)/g取样了解生长和产物情况
效价或产物浓度g/L取样(传感器)产物合成情况
细胞形态取样,离线了解生长情况
第3节发酵过程及检测
1、间接参数的测定:
在发酵过程中还有一些间接参数是通过以上参数经计算得到的。
如氧利用速率、二氧化硫释放率、呼吸强度、呼吸商、氧传递系数、比生成速率、菌体生长速率、产物得率等。
它们是分析、判断的和衡量发酵过程的重要参数,为控制发酵过程提供了依据。
2、发酵传感器:
为适应自控的要求,发酵过程变量变化的信息,应尽可能通过安装在发酵罐内的传感器检测。
1.发酵过程对传感器的要求用于发酵过程的传感器,由于所面临的过程及检测对象的特殊性,除了常规要求外,还应满足一些特殊要求。
(1)可靠性
(2)准确性(3)精确度(4)响应时间(5)分辨能力(6)灵敏度(7)测量范围(8)特异性(9)可维修性(10)发酵过程对传感器的特殊要求:
承受高温灭菌;与外界大气隔绝的保持无菌状态;防止培养基和细胞沾附在其表面。
2.发酵用传感器分类
按测量方式分:
(1)离线传感器
(2)在线传感器(重要)(3)原位传感器
按测量原理分:
(1)力敏传感器,
(2)热敏传感器,(3)光敏传感器,(4)磁敏传感器,(5)电化学传感器
发酵过程的主要在线传感器:
(1)pH
(2)溶解氧(3)氧化还原电位(4)溶解二氧化碳
3、发酵过程的其它重要检测技术:
在发酵过程中,除使用上述传感器外,还引入了一些现代分析技术,其中最重要的检测项目有生物量,尾气成体和发酵液成份。
(1)生物量分析
生物量是发酵过程中极其重要的一个参数。
发酵过程优化和控制由经验走向模型化,生物量的测定必不可少。
目前,还不具备理想的直接用于监测生物量的在线传感器,即使是离线分析,结果也不理想。
生物量测定方法有:
(1)干重法:
(2)DNA(3)粘度,(4)浊度:
(5)沉降量或压缩(6)过滤探头,(7)荧光分析,
(2.)尾气分析
通气发酵尾气中O2的减少和CO2的增加是培养基中营养物质好氧代谢的结果,由这两种气体的在线分析所获得的耗氧速率(OUR)和CO2释放速率(CER)是目前最有效的微生物代谢活性指示值。
(1)红外CO2分析仪
(2)顺磁O2分析仪(3)质谱仪
(3)发酵液成分分析
发酵液成分的分析对于认识和控制发酵过程也是十分重要的。
高效液相色谱(HPLC)具有分辩率高、灵敏度好测量范围广、快速及系统特异性等优点,目前已成为实验室分析的主导方法。
第四节发酵生物反应器
1、发酵生物反应器:
生物反应器是利用生物催化剂进行反应的设备。
按照所使用的生物催化剂,生物反应器可分为酶反应器和细胞反应器两类。
发酵罐是微生物细胞反应器,是最重要的一种生物反应器。
2、发酵反应器的进步表现在以下几个方面:
(1)染菌率极低。
现代发酵多为纯种培养,因为杂菌入侵将干扰正常生产。
培养基的彻底灭菌,空气的灭菌设备的严密度和科学管理形成了防止杂菌污染的基础
(2)发酵设备的大型化、多样化。
发酵罐的体积从几十立方米增加到几百至几千立方米,设备大型化有利于提高经济效益。
(3)过程控制设备的优化。
第五节代谢控制发酵
1、代谢控制发酵(MetabolicControlFermentation)是利用遗传学的方法或其它生物化学方法,人为地在DNA分子水平上,改变和控制微生物的代谢,使有用目的产物大量生成、积累的发酵。
与随机诱变相比,其特点是定向性。
2、代谢网络:
(metabolicengineering)
组成:
分解代谢途径
合成代谢途径有序组合成代谢网络
膜输送体系
广义的代谢网络:
物质代谢网络
能量代谢网络
多结点、多因素、形成网络体系。
可在一定范围内对代谢网络的遗传根据进行人为的修饰,从而有可能实现代谢途径(网络)的延伸和剪接。
3、代谢流:
处于一定环境条件下的微生物培养物中,参与代谢的物质在代谢网络中按一定规律流动,形成微生物的代谢流。
代谢流具备流体流动的一些基本属性,诸如方向性、连续性、有序性、可调性等,也可以接受疏导、阻塞、分流、汇流等“治理”,也可能发生“干枯”或“溢出”等现象。
载流途径和代谢主流:
在一定的生理状态下,碳架物质在微生物的代谢网络中流经的主要途径,称为载流途径。
以特定的初级代谢产物为目的产物的工业发酵要求微生物在形成目的产物期间让碳架物质相对集中地经载流途径流向目的产物,形成代谢主流。
从而实现新基质的利用,新产品的开发,新合成技术的开发。
4、代谢分析
内容:
代谢流的定向和定量
细胞内代谢物浓度的测定细胞内物质的代谢途径与通量(代谢设计的基础)
细胞内稳态流的分析
5、细胞调节控制:
微生物细胞具有高度适应环境和繁殖的能力。
细胞的各种结构能协调地进行工作,对环境的刺激和信息作出反应进行自我调节。
这种调节控制作用主要靠两个因素,即参与调节的有关酶的活性和酶量,也就是反馈抑制和反馈阻遏。
6、代谢工程设计
(1)改变代谢流
改变分支代谢途径的流向,阻断有害代谢产物的合成,以提高产物的产量。
其困难在于代谢网络的刚性及细胞的应答反应,此外,还存在细胞代谢平衡的问题。
改变代谢流的方法:
(i)加速限速度反应:
通过克隆对生物合成起限速作用的关键酶基因,加速代谢流的流动。
(ii)改变分支代谢途径流向:
提高代谢分支点的某一分支代谢途径酶系的活力,在与
另外的分支代谢途径的竞争中占有优势,可以提高目的末端代谢产物的产量。
按照这种思路,设计并了多种氨基酸高产代谢工程菌,并取得了成功。
(iii)构建代谢旁路:
阻断或降低副产物的合成,特别是有毒产物的产生。
目前许多基因工程产物都是以大肠杆菌为宿主进行发酵生产的,大肠杆菌糖代谢的末端产物乙酸,当达到一定浓度后会抑制细胞的生长。
将枯草杆菌的乙酰乳酸合成酶基因克隆到大肠杆菌中,改变了细胞的糖代谢流,
使乙酸处于低于细胞毒性的浓度,从而实现高密度培养。
(iv)改变能量代谢途径
直接方法:
通过相关代谢途径的基因操作完成;
间接的方法:
通过改变能量代谢途径或电子传递系统去影响或改变细胞的代谢流。
(2)扩展代谢途径:
通过引入外源基因,可以引伸原来的代谢途径。
(3)转移或构建新的代谢途径
第六节发酵过程优化及控制
1、发酵过程控制是根据对过程变量的有效测量及对过程变化规律的认识,借助于由自动化仪表和计算机组成的控制器,操纵其中的一些关键变量,使过程向着预定的目标发展。
发酵过程控制包括三方面的内容:
(1)和过程未来状态相联系的控制目的或目标,如要求控制的温度、pH、生物量浓度等。
(2)一组可供选择的控制动作,如阀门的开、关,泵的开、停等;
(3)一种能够预测控制动作对过程状态影响的模型,如用加入基质的浓度和速率控制细胞生长率时需要能表达它们之间相关关系的数学式。
2、细胞代谢网络是由多种酶催化的系列反应系统、膜传递系统、信号传递系统组成,并且是受精密调节,又相互协调的复杂体系。
各种代谢是相互作用、相互转化、相互制约的一套完整、统一、灵敏的调节系统。
在生命进化过程中,微生物细胞形成了完善的代谢调节机制,使细胞内复杂的生物化学反应高度有序地进行,并对外界环境的改变迅速作出反应。
代谢的自动调节机制式通过自然选择而逐步完善的,调节有多种途径。
只有一个终端产物的调节活力
多终端产物的调节酶合成
横向调节
3、发酵工程的研究内容包括
生产菌种的选育
发酵条件的优化与控制
反应器的设计
产物的分离、提取与精制等
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