生物制品相关概念.docx

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生物制品相关概念

1.拷贝数

拷贝数就是指某基因（可以是质粒）在某一生物的基因组中的个数.单拷贝就是该基因在该生物基因组中只有一个,多则指有多个。

（一）在细菌细胞中，某种特定质粒的数目。

根据复制特性，质粒分严紧型和松弛型两类，前者在细胞中只含1～2个，而后者含10～15个以上。

恒定的拷贝数与质粒复制控制系统、宿主细胞遗传背景及生长条件有关。

质粒复制控制系统首先通过调节复制的起始点来控制拷贝数，调节因素包括阻遏蛋白、反义RNA和某些顺向重复序列。

有些质粒还有其他控制系统，如有分配功能的par系统和确保质粒稳定遗传的ccd系统。

一旦质粒上与调控有关的基因或位点突变，可使拷贝数明显增加或减少。

（二）在细菌细胞中，某种特定基因的数目。

检测方法：

1）Southernblot：

Southernblot是一种常用的DNA定量的分子生物学方法。

其原理是将待测的DNA样品固定在固相载体（硝酸纤维膜或尼龙膜）上，与标记的核酸探针进行杂交，在与探针有同源序列的固相DNA的位置上显示出杂交信号，通过检测信号的有无、强弱可以对样品定性、定量，从而计算出转入的拷贝数。

Southern法准确性高、特异性强，但存在费时费力的缺点。

另外，由于Southern法检测不经过靶片段的扩增（PCR），一般每个电泳通道需要10-30μg的DNA，在实际操作中就需要较大量的植物材料来提取DNA，而转基因植物的愈伤组织在无菌条件下经过筛选、重新分化后一般都比较细弱，不宜大量取样。

如果外源基因在插入时发生基因重组，造成限制性酶切位点丢失，Southern法也无法检测到。

这些因素都制约了Southern法在T0代转基因植物中检测外源基因拷贝数的应用。

2）实时荧光定量PCR：

其定量的基本原理是在PCR反应体系中加入非特异性的荧光染料（如：

SYBRGREENI）或特异性的荧光探针（如：

Taqman探针），实时检测荧光量的变化，获得不同样品达到一定的荧光信号（阈值）时所需的循环次数：

CT值（CycleThreshold）；通过将已知浓度标准品的CT值与其浓度的对数绘制标准曲线，就可以准确定量样品的浓度。

荧光定量PCR技术具有简便、快捷的优点，能够有效扩增低拷贝的靶片段DNA，对每克样品中20pg-10ng的转基因成分进行有效检测。

同时，与Southern法相比，荧光定量PCR技术可对T-DNA的不同序列进行扩增，因此能实现对转基因品系中的基因重组的检测（Giovanna2002）。

2.什么是总离子流色谱图

Q：

液质联用的总离子流色谱图,横坐标出峰时间,纵坐标峰高,这个峰高到底是什么?

通过液相分离到达质谱时间不一样,那是不是同一个时间到达检测器的离子可能是不同的质量,也就是它这个总粒子流色谱图某一时间对应的点不是单一的质量?

A：

严格来说应该叫总离子流图,已经不是色谱图了,纵坐标高还是代表物质总生的总离子信号,和色谱峰面积比例接近,当然也有时有离子流峰不一定有色谱峰,特殊情况也很多.一个总离子流图由好多峰组成,这些峰出峰先后是按色谱出峰先后顺序排列的.在同一峰,又由好多不同质荷比的碎片组成,在质谱中,同一个离子流峰中不同的质荷比的碎片也按小到大的顺序先后检测到,形成质谱图.离子流图的一点和质谱图的某一点都不一定是纯的,因为存在色谱分离度和质谱分辨率的问题.色谱柱效足够高,分析方法足够好,总离子流图一个点的物质就越来越单一,分辨率越高质谱图某一点的峰纯度也越高。

3.翻译后修饰

翻译后修饰是指蛋白质在翻译后的化学修饰。

对于大部份的蛋白质来说，这是蛋白质生物合成的较后步骤。

前体蛋白是没有活性的，常常要进行一个系列的翻译后加工，才能成为具有功能的成熟蛋白。

加工的类型是多种多样的，一般分为以下几种：

N-端fMet或Met的切除、二硫键的形成、化学修饰和剪切。

当合成蛋白质时，20种不同的氨基酸会组合成为蛋白质。

蛋白质的翻译后蛋白质其他的生物化学官能团（如醋酸盐、磷酸盐、不同的脂类及碳水化合物）会附在蛋白质上从而改变蛋白质的化学性质，或是造成结构的改变（如建立双硫键），来扩阔蛋白质的功能。

再者，酶可以从蛋白质的N末端移除氨基酸，或从中间将肽链剪开。

举例来说，胰岛素是肽的激素，它会在建立双硫键后被剪开两次，并在链的中间移走多肽前体，而形成的蛋白质包含了两条以双硫键连接的多肽链。

其他修饰，就像磷酸化，是控制蛋白质活动机制的一部份。

蛋白质活动可以是令酶活性化或钝化。

翻译后修饰包括以下加入官能团的反应：

乙酰化——通常于蛋白质的N末端加入乙酰。

烷基化——加入如甲基或乙基等烷基。

甲基化——烷基化中常见的一种，在赖氨酸、精氨酸等的侧链氨基上加入甲基。

生物素化——用生物素附加物令保存的赖氨酸酰化。

谷氨酸化——在谷氨酸与导管素及其他蛋白质之间建立共价键。

甘氨酸化——在一个至超过40种甘氨酸与导管素的C末端建立共价键。

糖化——将糖基加入天冬酰胺、羟离氨酸、丝氨酸或苏氨酸，形成糖蛋白。

异戊二烯化——加入如法呢醇及四异戊二烯等异戊二烯。

硫辛酸化——附着硫辛酸的功能性。

磷酸泛酰巯基乙胺基化——像在脂肪酸、聚酮、非核糖体肽链及白氨酸的生物合成中，从乙酰辅酶A加入4'磷酸泛酰巯基乙胺基。

磷酸化——加入磷酸根至丝氨酸、酪氨酸、苏氨酸或组氨酸。

硫酸化——将硫酸根加入至酪氨酸，硒化C末端酰胺化。

4.Edman降解

Edman降解（Edmandegradation），从多肽链游离的N末端测定氨基酸残基的序列的过程。

N末端氨基酸残基被异硫氰酸苯酯修饰，然后从多肽链上切下修饰的残基，再经层析鉴定，余下的多肽链（少了一个残基）被回收再进行下一轮降解循环。

用异硫氰酸苯酯（PITC）与待分析多肽的N-端氨基在碱性条件下反应，生成苯氨基硫代甲酰胺（PTC）的衍生物，然后用酸处理，关环，肽链N-端被选择性地切断，得到N-端氨基酸残基的噻唑啉酮苯胺衍生物。

接着用有机溶剂将该衍生物萃取出来，酸作用下，该衍生物不稳定，会继续反应，形成一个稳定的苯基乙内酰硫脲（PTH）衍生物。

余下肽链中的酰胺键不受影响。

通过用HPLC或电泳法分析生成的苯乙内酰硫脲（PTH-氨基酸），可以鉴定出是哪一个氨基酸。

每反应一次，结果是得到一个去掉N-端氨基酸残基的多肽，剩下的肽链可以进入下一个循环，继续发生降解。

以上方法已经可以自动化。

用根据此原理设计出的自动分析仪进行分析时，能够可靠地测定肽链的30个左右氨基酸残基序列，最多可以分析50-60个氨基酸残基。

在最好的条件下，每形成一次PTH-氨基酸，效率可保持在99%以上。

而且此法用量少，一般只用10-100皮摩尔的多肽即可测定氨基酸序列。

对于肽链较长的多肽，可以先将肽链切断成多个小肽，对这些小肽进行氨基酸分析，然后将这些信息拼接起来，得到起始肽链中的氨基酸序列。

限制：

由于Edman降解是以化学试剂对N-端氨基的修饰为基础的，因此当N-端被其他化学基团所封闭时，就需要先去除这些基团，然后才能进行测序。

此外，蛋白质中含有半胱氨酸残基时，有时两个半胱氨酸残基会发生二硫键交联。

这种情况下，需要先用过酸将二硫键氧化为–SO3H，然后才能用Edman降解测定序列。

5.糖基化

糖基化是在酶的控制下，蛋白质或脂质附加上糖类的过程，发生于内质网。

在糖基转移酶作用下将糖转移至蛋白质，和蛋白质上的氨基酸残基形成糖苷键。

蛋白质经过糖基化作用，形成糖蛋白。

糖基化是对蛋白的重要的修饰作用，有调节蛋白质功能作用。

N-连接的糖链合成起始于内质网，完成于高尔基体。

在内质网形成的糖蛋白具有相似的糖链，由Cis面进入高尔基体后，在各膜囊之间的转运过程中，发生了一系列有序的加工和修饰，原来糖链中的大部分甘露糖被切除，但又被多种糖基转移酶依次加上了不同类型的糖分子，形成了结构各异的寡糖链。

糖蛋白的空间结构决定了它可以和那一种糖基转移酶结合，发生特定的糖基化修饰。

许多糖蛋白同时具有N-连接的糖链和O-连接的糖链。

O-连接的糖基化在高尔基体中进行，通常的一个连接上去的糖单元是N-乙酰半乳糖，连接的部位为Ser、Thr和Hyp的羟基，然后逐次将糖基转移到上去形成寡糖链，糖的供体同样为核苷糖，如UDP-半乳糖。

糖基化的结果使不同的蛋白质打上不同的标记，改变多肽的构象和增加蛋白质的稳定性。

在高尔基体上还可以将一至多个氨基聚糖链通过木糖安装在核心蛋白的丝氨酸残基上，形成蛋白聚糖。

这类蛋白有些被分泌到细胞外形成细胞外基质或粘液层，有些锚定在膜上。

根据糖苷链类型，蛋白质糖基化可以分为四类，即以丝氨酸、苏氨酸、羟赖氨酸和羟脯氨酸的羟基为连接点，形成-0-糖苷键型。

以天冬酰胺的酰胺基、N一末端氨基酸的α-氨基以及赖氨酸或精氨酸的ω-氨基为连接点，形成-N-糖苷键型;以天冬氨酸或谷氨酸的游离羧基为连接点，形成脂糖苷键型以及以半胱氨酸为连接点的糖肽键。

6.等电点

等电点（pI）：

在某一pH的溶液中，氨基酸或蛋白质解离成阳离子和阴离子的趋势或程度相等，成为兼性离子，呈电中性，此时溶液的pH成为该氨基酸或蛋白质的等电点。

例如：

在某一pH的溶液中，氨基酸解离成阳离子和阴离子的趋势及程度相等，所带净电荷为零，呈电中性，此时溶液的pH称为该氨基酸的等电点。

两性离子所带电荷因溶液的pH值不同而改变，当两性离子正负电荷数值相等时，溶液的pH值即其等电点。

当外界溶液的pH大于两性离子的pI值，两性离子释放质子带负电；当外界溶液的pH小于两性离子的pI值，两性离子质子化带正电；当达到等电点时氨基酸在溶液中的溶解度最小。

应用：

蛋白质的沉淀：

同种蛋白质在水溶液中带有同种电核，互相排斥，且蛋白质表面能形成水化膜，这就使得蛋白质溶液（实际上是胶体）十分稳定。

要想破坏其稳定性让其沉淀则需要从这两方面入手，也就是除去水化膜和表面电荷。

比如，可以先将蛋白质的pH调整至等电点，这时的蛋白质分子呈等电状态，虽不很稳定，但还有水膜的保护作用，一般不致沉淀，如果这时加入脱水剂除去蛋白质分子的水膜，则蛋白质分子互相凝聚、沉淀析出。

先脱水，后调节pH到等电点，也同样可使蛋白质沉淀。

蛋白质的电泳：

当蛋白质不处于等电点状态时其总是带有一定电荷的，可以利用此特性使其电泳。

还可以通过调节电泳液的pH来控制蛋白质的电泳方向和速度。

7.SDS-PAGE聚丙烯酰氨凝胶电泳

聚丙烯酰胺凝胶电泳（英语：

polyacrylamidegelelectrophoresis，简称PAGE）

作用：

用于分离蛋白质和寡核苷酸。

作用原理：

聚丙烯酰胺凝胶为网状结构，具有分子筛效应。

它有两种形式：

非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳（Native-PAGE）及SDS-聚丙烯酰胺凝胶（SDS-PAGE）；非变性聚丙烯酰胺凝胶，在电泳的过程中，蛋白质能够保持完整状态，并依据蛋白质的分子量大小、蛋白质的形状及其所附带的电荷量而逐渐呈梯度分开。

而SDS-PAGE仅根据蛋白质亚基分子量的不同就可以分开蛋白质。

该技术最初由shapiro于1967年建立，他们发现在样品介质和丙烯酰胺凝胶中加入离子去污剂和强还原剂（SDS即十二烷基硫酸钠）后，蛋白质亚基的电泳迁移率主要取决于亚基分子量的大小（可以忽略电荷因素）。

SDS是阴离子去污剂，作为变性剂和助溶试剂，它能断裂分子内和分子间的氢键，使分子去折叠，破坏蛋白分子的二、三级结构。

而强还原剂如巯基乙醇，二硫苏糖醇能使半胱氨酸残基间的二硫键断裂。

在样品和凝胶中加入还原剂和SDS后，分子被解聚成多肽链，解聚后的氨基酸侧链和SDS结合成蛋白-SDS胶束，所带的负电荷大大超过了蛋白原有的电荷量，这样就消除了不同分子间的电荷差异和结构差异。

SDS-PAGE一般采用的是不连续缓冲系统，与连续缓冲系统相比，能够有较高的分辨率。

浓缩胶的作用是有堆积作用，凝胶浓度较小，孔径较大，把较稀的样品加在浓缩胶上，经过大孔径凝胶的迁移作用而被浓缩至一个狭窄的区带。

当样品液和浓缩胶选TRIS/HCl缓冲液，电极液选TRIS/甘氨酸。

电泳开始后，HCl解离成氯离子，甘氨酸解离出少量的甘氨酸根离子。

蛋白质带负电荷，因此一起向正极移动，其中氯离子最快，甘氨酸根离子最慢，蛋白居中。

电泳开始时氯离子泳动率最大，超过蛋白，因此在后面形成低电导区，而电场强度与低电导区成反比，因而产生较高的电场强度，使蛋白和甘氨酸根离子迅速移动，形成一稳定的界面，使蛋白聚集在移动界面附近，浓缩成一中间层。

此鉴定方法中，蛋白质的迁移率主要取决于它的相对分子质量，而与所带电荷和分子形状无关。

8.表达载体

表达载体四部分：

目的基因、启动子、终止子、标记基因

常用细菌质粒进行构建，构建过程中运用限制性核酸内切酶切割出与目的基因相合的末端（多为黏性末端，也有平末端），采用DNA连接酶连接，导入生物体实现表达。

标记基因可帮助识别质粒并检测是否成功整合到染色体DNA中。

表达载体（Expressionvectors）就是在克隆载体基本骨架的基础上增加表达元件（如启动子、RBS、终止子等），使目的基因能够表达的载体。

如表达载体pKK223-3是一个具有典型表达结构的大肠杆菌表达载体。

其基本骨架为来自pBR322和pUC的质粒复制起点和氨苄青霉素抗性基因。

在表达元件中，有一个杂合tac强启动子和终止子，在启动子下游有RBS位点（如果利用这个位点，要求与ATG之间间隔5-13bp），其后的多克隆位点可装载要表达的目标基因。

9.实时荧光定量PCR

其定量的基本原理是在PCR反应体系中加入非特异性的荧光染料（如：

SYBRGREENI）或特异性的荧光探针（如：

Taqman探针），实时检测荧光量的变化，获得不同样品达到一定的荧光信号（阈值）时所需的循环次数：

CT值（CycleThreshold）；通过将已知浓度标准品的CT值与其浓度的对数绘制标准曲线，就可以准确定量样品的浓度。

荧光定量PCR技术具有简便、快捷的优点，能够有效扩增低拷贝的靶片段DNA，对每克样品中20pg-10ng的转基因成分进行有效检测。

同时，与Southern法相比，荧光定量PCR技术可对T-DNA的不同序列进行扩增，因此能实现对转基因品系中的基因重组的检测（Giovanna2002）。

10.单克隆抗体

动物脾脏有上百万种不同的B淋巴细胞系，选择性表达出不同基因的B淋巴细胞合成不同的抗体。

当机体受抗原刺激时，抗原分子上的许多决定簇分别激活各个表达不同基因的B细胞。

被激活的B细胞分裂增殖形成效应B细胞（浆细胞）和记忆B细胞，大量的浆细胞克隆合成和分泌大量的抗体分子分布到血液、体液中。

如果能选出一个制造一种专一抗体的浆细胞进行培养，就可得到由单细胞经分裂增殖而形成细胞群，即单克隆。

单克隆细胞将合成针对一种抗原决定簇的抗体，称为单克隆抗体。

由单一B细胞克隆产生的高度均一、仅针对某一特定抗原表位的抗体，称为单克隆抗体。

通常采用杂交瘤技术来制备，杂交瘤（hybridoma）抗体技术是在细胞融合技术的基础上，将具有分泌特异性抗体能力的致敏B细胞和具有无限繁殖能力的骨髓瘤细胞融合为B细胞杂交瘤。

用具备这种特性的单个杂交瘤细胞培养成细胞群，可制备针对一种抗原表位的特异性抗体即单克隆抗体。

1975年分子生物学家G.J.F.克勒和C.米尔斯坦在自然杂交技术的基础上，创建立杂交瘤技术，他们把可在体外培养和大量增殖的小鼠骨髓瘤细胞与经抗原免疫后的纯系小鼠B细胞融合，成为杂交细胞系，既具有瘤细胞易于在体外无限增殖的特性，又具有抗体形成细胞的合成和分泌特异性抗体的特点。

将这种杂交瘤作单个细胞培养，可形成单细胞系，即单克隆。

利用培养或小鼠腹腔接种的方法，便能得到大量的、高浓度的、非常均一的抗体，其结构、氨基酸顺序、特异性等都是一致的，而且在培养过程中，只要没有变异，不同时间所分泌的抗体都能保持同样的结构与机能。

这种单克隆抗体是用其他方法所不能得到的。

这项新技术从根本上解决了在抗体制备中长期存在的特异性和可重复性问题，可用于探讨①蛋白质的精细结构；②淋巴细胞亚群的表面新抗原；③组织相容性抗原；④激素和药物的放射免疫（或酶免疫）分析；⑤肿瘤的定位和分类；⑥纯化微生物和寄生虫抗原；⑦免疫治疗和与药物结合的免疫-化学疗法（“导弹”疗法,利用单克隆抗体与靶细胞特异性结合，将药物带至病灶部位。

因此，单克隆抗体可直接用于人类疾病的诊断、预防、治疗以及免疫机制的研究，为人类恶性肿瘤的免疫诊断与免疫治疗开辟了广阔前景。

11.CHO细胞

（ChineseHamsterOvary，CHO） 中国仓鼠卵巢细胞

1957年美国科罗拉多大学Dr.TheodoreT.Puck从一成年雌性仓鼠卵巢分离获得，为上皮贴壁型细胞，是生物工程上广泛使用的细胞系。

该细胞具有不死性，可以传代百代以上，是生物工程上广泛使用的细胞。

另外CH0细胞在基因工程使用中还有一个优点，该细胞属于成纤维细胞（fibroblast），是一种非分泌型细胞，它本身很少分泌CHO内源蛋白，因此对目标蛋白分离纯化工作十分有利。

可形成有活性的二聚体（如白介素2），具有糖基化的功能（如EPO），CHO为表达复杂生物大分子的理想宿主。

由于该细胞存在遗传缺陷，无脯氨酸合成基因，不能将谷氨酸转变为谷氨酸--半醛，培养过程中需在培养基中添加L-脯氨酸才能生长。

并且由于该细胞已经霍乱毒素适应，形态学有所改变。

最初细胞为贴壁型细胞，经多次传代筛选后，也可悬浮生长。

工业生产上应用较多的是CHO-K1细胞，为转化细胞系，细胞染色体分布频率是2n=22，系亚二倍体细胞。

ATCC保存CHO-K1细胞株，编号为CCL-61，被广泛地用于重组DNA蛋白的表达。

CHO细胞虽可像微生物细胞一样，在人工控制条件的生物反应器中进行大规模培养，但其细胞结构和培养特性与微生物细胞相比，有显著差别：

动物细胞比微生物细胞大得多，无细胞壁，机械强度低，对剪切力敏感，适应环境能力差；倍增时间长，生长缓慢，易受微生物污染，培养时须用抗生素；培养过程需氧量少（氧传质系数kLa大于10h-1即可满足每毫升107个细胞的生长）；培养过程中细胞相互粘连以集群形式存在；原代培养细胞一般繁殖50代即退化死亡；代谢产物具有生物活性，生产成本高，但附加值也高。

通过几十年的发展至今，CHO细胞已成为生物技术药物最重要的表达或生产系统，这种局面仍将持续并且其所占比例有逐年增大趋势。

CHO细胞大规模培养技术及其生物反应器工程可广泛应用于抗体、基因重组蛋白质药物、病毒疫苗等生物技术产品的研究开发和工业化生产。

12.一级质谱与二级质谱

二级质谱只是在一级质谱基础上选择性的分析一些碎片。

如果条件合适，一级质谱就已经能看到分子离子峰和打碎后的碎片，但是有杂质干扰。

二级质谱可以选择特定的碎片，比如就是母离子，继续给能量打碎，产生碎片，采集的数据，所以二级质谱图很干净，基本都是被分析物质产生的碎片。

这个就是子离子扫描。

二级质谱是建立在一级质谱基础上的，如你不知道组分中有什么，你是不能选择性的做二级质谱的。

就是因为二级质谱的选择性，所以你成分多也没关系。

如果你真只有单一组分，一级质谱足够了，因为没有干扰。

目前质谱一般都和液相串联的，所以尽管你组分多，液相已经先把成分分开了，陆续的进入质谱分析，所以成分多不是问题。

但是中药中组分实在是多，我怕你液相没有足够的分离度。

13.轻链重链

重链（heavychain，H链）大小约为轻链的2倍，含450～550个氨基酸残基，分子量约为55或75kD。

每条H链含有4～5个链内二硫键所组成的环肽。

不同的H链由于氨基酸组成的排列顺序、二硫键的数目和位置、含的种类和数量不同，其抗原性也不相同，根据H链抗原性的差异可将其分为5类：

μ链、γ链、α链、δ链和ε链，不同H链与L链（κ或λ链）组成完整免疫球蛋白的分子分别称之为IgM、IgG、IgA、IgD和IgE。

γ、α和δ链上含有4个肽，μ和ε链含有5个环肽。

轻链（lightchain，L）大约由214个氨基酸残基组成，通常不含碳水化合物，分子量约为24kD。

每条轻链含有两个由链内二硫键内二硫所组成的环肽。

L链共有两型：

kappa（κ）与lambda（λ），同一个天然免疫球蛋白分子上L链的型总是相同的。

正常人血清中的κ：

λ约为2：

1。

游离轻链的测定及其医学意义：

免疫球蛋白（Ig）轻链分为κ（kappa）和λ（lambda）2个型别，每个Ig分子上只有一个型别的轻链，人类κ（kappa）和λ（lambda）的比例为6：

4.轻链为能自由通过肾小球基底膜的小分子蛋白质，在肾小管被重吸收回到血循环中，所以正常人尿中只有少量轻链存在。

当代谢失调和多发性骨髓瘤时，血中出现大量游离轻链，并由尿中排出，即为Bence-Jones蛋白（本周蛋白）

14.CDR（免疫球蛋白分子的互补决定区）

在免疫球蛋白可变区（V区）内，某些区域氨基酸残基的组成和排列次序比V区内其他区域更易变化，这些区域称为高变区（hypervariableregionHVR）。

高变区实际上是特异性抗原与Ig结合的位置。

由于这些高变区序列与抗原决定簇互补，故又称为互补决定区（complementarity-determiningregion,CDR）。

从免疫球蛋白的抗原性考虑，其独特型决定簇也在该区域。

因此，免疫球蛋白高变区、免疫球蛋白的抗原结合部位和免疫球蛋白独特型决定簇这三个完全不同的概念，实际上建立在统一结构基础上，即免疫球蛋白分子V区球形顶端的立体结构。

抗体（Ab）的重链和轻链可变区内的高变区构成抗体分子的抗原（Ag）结合点,因为抗原结合点是与抗原表位结构相互补的,所以高变区又称为抗体分子的互补决定区（complementarity-determiningregion,CDR）

比较不同抗体V区的氨基酸序列，发现VH和VL各有3个区域的氨基酸组成和排列顺序特别易变化，这些区域称为HVR。

VH和VL的三个HVR共同组成Ig的抗原结合部位，该部位也称为CDR。

15.逆转录病毒

逆转录病毒（Retrovirus），又称反转录病毒，是RNA病毒的一种，它们的遗传信息不是存录在脱氧核糖核酸（DNA），而是存录在核糖核酸（RNA）上，此类病毒多具有逆转录酶。

反转录病毒的DNA基因组整合在宿主染色体上的位点是随机的。

每个受感染的细胞一般有1～10份前病毒拷贝。

反转录病毒DNA的整合是复制病毒RNA的必经阶段。

反转录病毒的DNA插入宿主细胞染色体时，在5’LTR的U3左端和3’端LTR的U5右端各丢失2bp，而在宿主染色体插入位点上生成4～6bp的重复序列。

只有当受感染细胞处于细胞分裂期间，反转录病毒DNA基因组才能接触到宿主细胞的遗传物质。

因此，反转录病毒只能在分裂中的细胞内复制。

反转录病毒的最基本特征是在生命过程活动中，有一个从RNA到DNA的逆转录过程，即病毒在反转录酶的作用下，以病毒RNA为模板，合成互补的负链DNA后，形成RNA-DNA中间体。

中间体的RNA被RNA酶水解，进而在DNA聚合酶的作用下，由DNA复制成双链DNA。

特点：

1）病毒为球形，衣壳20面体立体对称，有包膜；

2）基因组为两个相同+ssRNA；

3）含有逆转录酶和整合酶；

4）复制通过DNA中间体，并与宿主细胞的染色体整合；

5）具有gag、pol、env编码基因；

6）成熟病毒以芽生方式释放。

[1] 

16.Vero细胞

Vero细胞Verocell于1962年从止常的成年非}i·绿猴肾细胞获得的转化细胞。

该细胞是贴壁依赖性的成纤维细胞。

它能支持多种病毒的增殖，包括乙型脑炎、脊髓灰质炎、狂犬病等病毒，已被准许用于生产人用病毒疫苗。

17.ADCC效应

ADCC效应中文名称